专利名称：水稻抗逆相关基因－锚定序列重复蛋白基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物学领域，具体地说，本发明涉及新的水稻(Oryz sativa)的锚定序列重复蛋白基因及其编码蛋白。本发明还公开了编码这种锚定序列重复蛋白的基因的用途，尤其是在植物品种改良和杂交育种中用于改变植物的耐盐性和抗旱性。
背景技术：
盐、旱等非生物胁迫是农作物减产及品质下降的主要原因。目前已经有一部分抗盐相关的基因被克隆，而且通过基因工程技术获得一部分抗逆植物或农作物品系。不过这离很好地理解和认识植物抗盐机制，并进一步应用于实际还有很大的距离。
在植物抗盐信号转导过程中，蛋白磷酸化以及运输蛋白的募集和激活都是非常重要的事件。一部分蛋白激酶以及离子转运蛋白含有一段叫做锚定蛋白的重复(ankyrin repeat)，它们被认为和蛋白质的互作相关。在酵母和动物中的信号转导的研究中发现不同的信号转导途径有特异的信号转导框架存在，而这种信号转导框架一个重要组成部分就是支架蛋白，而这种支架蛋白通常都是锚定蛋白，它起到募集不同信号分子，如蛋白激酶等的作用。
总而言之，人们对植物如何耐盐、抗旱的机理还不甚了解。由于赋予或有助于耐盐性或抗旱性的基因与植物的耐盐性或抗旱性密切相关，因此，为了有效地、针对性地改变植物品种的耐盐性或抗旱性，本领域迫切需要开发与耐盐性或抗旱性有关的蛋白及其编码基因。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的耐盐性、抗旱性相关基因(即水稻锚定序列重复蛋白)及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在改变植物耐盐性和抗旱性方面的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的水稻锚定序列重复蛋白(简称为Rap)，该多肽源自水稻，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高水稻耐盐性的功能的由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码上述水稻锚定序列重复蛋白Rap的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中1-1815位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中49-1716位的序列；(c)具有SEQ ID NO7中1-1854位的核苷酸序列；(D)具有SEQ ID NO9中1-3640位的核苷酸序列(基因组序列)。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备水稻锚定序列重复蛋白的方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出水稻锚定序列重复蛋白。
在本发明的第五方面，提供了与上述的水稻锚定序列重复蛋白特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的约15-1500个核苷酸，它们可用作引物或探针。
在本发明的第六方面，提供了抗本发明蛋白的抗体以及一种检测样品中是否存在水稻锚定序列重复蛋白的方法，它包括将样品与水稻锚定序列重复蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在水稻锚定序列重复蛋白。
在本发明的第七方面，提供了一种改变植物耐盐性和/或抗旱性的方法，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有水稻锚定序列重复蛋白DNA编码序列，所述的水稻锚定序列重复蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高水稻耐盐性的功能的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使水稻锚定序列重复蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入水稻锚定序列重复蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了水稻RaP因序列(大写字母示为开放阅读框，斜体部分为日本晴比Nona多余的序列，下划线部分为Nona比日本晴多余的序列)图2显示了水稻Rap蛋白的氨基酸序列。
图3显示了在盐胁迫下(100mM NaCl处理12天后，再150mM NaCl处理5天后)，水稻Rap(来自于日本晴，图中示为REST，Rap derived Nipponbare EST)转基因植株明显提高了水稻的抗盐性。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次从水稻(Oryza sativa.L)中，利用高通量技术cDNA微阵列(microarray)，在水稻中筛选到一个新的盐诱导锚定序列重复蛋白(ankyrin repeat-protein)基因Rap(Rice ankyrin-repeatprotein)，并利用反向遗传学的方式对其功能进行了研究，显示该基因为水稻耐受盐旱等逆境所必需，它的超表达(Overexpression)能增强水稻的耐盐性，因此在农作物抗逆性育种中具有应用前景。
在本发明中，术语“水稻锚定序列重复蛋白”、“Rap蛋白”、“Rap多肽”等可互换使用，都指具有水稻锚定序列重复蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
在未特别指出时，术语“锚定序列重复蛋白”包括野生型和突变型锚定序列重复蛋白。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的水稻锚定序列重复蛋白或多肽”是指水稻锚定序列重复蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化水稻锚定序列重复蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括水稻锚定序列重复蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然水稻锚定序列重复蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“水稻锚定序列重复蛋白”指具有水稻锚定序列重复蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。该术语还包括具有与水稻锚定序列重复蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括水稻锚定序列重复蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与水稻锚定序列重复蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗水稻锚定序列重复蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含水稻锚定序列重复蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了水稻锚定序列重复蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有水稻锚定序列重复蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供水稻锚定序列重复蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然水稻锚定序列重复蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“水稻锚定序列重复蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码水稻锚定序列重复蛋白的多聚核苷酸。
本发明的水稻锚定序列重复蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或水稻锚定序列重复蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的水稻锚定序列重复蛋白。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码水稻锚定序列重复蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，水稻锚定序列重复蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含水稻锚定序列重复蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐盐性和抗旱性改变的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的水稻锚定序列重复蛋白有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗水稻锚定序列重复蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组水稻锚定序列重复蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能刺激水稻锚定序列重复蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对水稻锚定序列重复蛋白DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的水稻锚定序列重复蛋白基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达水稻锚定序列重复蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用水稻锚定序列重复蛋白基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与水稻锚定序列重复蛋白基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗水稻锚定序列重复蛋白的抗体可用于检测样品中的水稻锚定序列重复蛋白。
本发明还涉及定量和定位检测水稻锚定序列重复蛋白水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的水稻锚定序列重复蛋白水平，可用于解释水稻锚定序列重复蛋白在耐盐性和抗旱性方面重要性。
一种检测样品中是否存在水稻锚定序列重复蛋白的方法是利用水稻锚定序列重复蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与水稻锚定序列重复蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在水稻锚定序列重复蛋白。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用水稻锚定序列重复蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测水稻锚定序列重复蛋白的转录产物。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从水稻cDNA文库中分离出的，其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1815个碱基，其开放读框位于49-1716位，编码全长为556个氨基酸的水稻锚定序列重复蛋白(SEQ ID NO2)。
水稻锚定序列重复蛋白具有明确改善植物耐盐性和/或抗旱性的功能，为改变植物的耐盐性和/抗旱性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以导入Rap基因，可改变现有优良农作物品种的耐盐性和抗旱性，获得高耐盐性和抗旱性的小麦、水稻等农作物或其他品种如林草、果树、花木等，解决农林业生产中存在的实际问题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)或植物分子生物学-实验手册(PlantMolecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1水稻锚定序列重复蛋白基因的克隆利用代表大约9,000个水稻基因的10,000点cDNA微阵列(购自上海联合基因博星基因芯片有限公司)，研究了耐盐水稻品种“Nona Bokra”(可购自国际水稻研究所等的水稻品种资源库)在150mM NaCl高盐胁迫下的转录谱，鉴定了一系列的高盐响应基因。其中，在盐胁迫后20分钟鉴定了一个快速响应的锚定序列重复蛋白基因Rap。
用常规方法构建高度耐盐水稻品种Nona Bokra和日本晴的cDNA文库。通过筛选抗盐品种Nona Bokra盐胁迫下的基因组文库和cDNA文库，克隆到一个包含1233个核苷酸的ORF的Nona Rap基因。同时在日本水稻EST数据库中搜索到一个序列相同的EST，AU163572。将Nona cDNA文库筛选的克隆以及EST克隆AU163572完全测序。序列分析显示Nona中的Rap基因比日本晴对应的cDNA克隆在3’-UTR多394个核苷酸，但是日本晴的开放阅读框比Nona多了375个核苷酸，原因是Rap5’端有一个高GC含量(80％)的区域，Nona的cDNA没有反转录过去，而Rap的第一个起始密码子位于这个区域(图1)。
对于日本晴而言，全长ORF为1815个核苷酸(SEQ ID NO1)，其编码蛋白长556个氨基酸(SEQ ID NO2和图2)。
对于Nona而言，其全长ORF为1854个核苷酸(SEQ ID NO7)，其编码蛋白长410个氨基酸(SEQ ID NO8)。Nona中的Rap基因比日本晴稳定，但是不能确定第一个起始密码子。
Rap基因的基因组全长3640bp(SEQ ID NO9)，含有4个外显子。推测的蛋白分析表明该基因编码的蛋白有四个跨膜区，定位在细胞质膜上。功能预测提示可能和离子运输有关。
实施例2水稻锚定序列重复蛋白是耐盐性相关蛋白以KpnI和NotI酶切回收纯化的Rap基因片段为探针(或者用对应于SEQ IDNO8的扩增产物作为探针)随机引物标记。然后通过常规的Northern技术对Rap基因在抗、感品种中盐胁迫下的表达模式进行了分析。结果显示高盐胁迫可以迅速诱导Rap在耐盐水稻品种Nona苗中的表达，然而旱、冷以及ABA处理却不能快速诱导，而是在处理1天后Rap的转录本才明显提高。在盐敏感品种IR28(可购自国际水稻研究所等的水稻品种资源库)中，盐处理20分钟后没有观测到Rap的明显上调，而却在干旱胁迫20分钟后快速受到上调。这些结果表明Rap在水稻抗逆过程中扮演重要而又特殊的角色。
实施例3水稻Rap转基因材料的制备本实施例采用改造于双元载体pCAMBIA3301(购自CAMBIA公司，Canberra，Australia)的双元载体pHB作为水稻转基因载体(pHB是将购自CAMBIA公司的pCAMBIA3301质粒中的GUS基因替换为潮霉素抗性基因(Hygr)所获得的质粒)。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kanr)、潮霉素抗性基因(Hygr)、除草剂抗性基因(Bar)、CaMV35S启动子、NOS基因的终止信号序列以及后两者之间的限制性内切酶克隆位点(MCS)。在限制性内切酶克隆位点可正向或反向插入Rap的cDNA构建成转基因质粒。
(1)日本晴Rap超表达的转基因质粒构建以NotI和KpnI消化构建在pBluescript SK(+)上的cDNA克隆AU163572的质粒(可购自日本国家农业科学研究所基因库，NIAS)，以T4聚合酶补平5’突出端削平3’突出端，回收纯化得到目的片断1.8kb。pHB以PstI酶切，同样以T4聚合酶补平。两者连接重组转化细菌DH5α。挑取重组子，限制性酶切重组子进行插入及方向鉴定，正确的进行测序。
(2)Nona Rap超表达的转基因质粒构建挑取从Nona盐胁迫的cDNA文库筛选到单克隆测序鉴定。设计引物如下Sense，5’-CTCGGGTACCTCACCATGGCTG-3’(SEQ ID NO3)；Antisense(T7primer)，5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(SEQ ID NO4)。以此引物扩增所挑取单克隆质粒，获得PCR产物以KpnI酶切消化，回收目的片段。同时pCAMBIA1301ns(将购自CAMBIA公司的pCAMBIA1301进行如下改造而获得的质粒在pCAMBIA1301多克隆位点的EcoRI和PstI分别插入35S启动子以及NOS转录终止位点)也以KpnI酶切，纯化回收。将Nona Rap重组进pCAMBIA1301ns。重组子酶切鉴定插入片断及方向。鉴定正确的再测序鉴定。
上述两种重组质粒通过冻融法导入常用的农杆菌菌株EHA105。每200μlEHA105感受态细胞加0.5-1μg(约10μl)质粒DNA混匀，依次于冰上、液氮和37℃水浴中各放置5分钟；用新鲜的YEB液体培养基稀释至1ml，于28℃振摇培养2-4小时；取200μl涂布于含抗生素Kan(50μg/ml)的YEB平板上，28℃培养2-3天。长出的菌落在含抗生素的YEB平板上划单菌，连续划3次。参考Hiei等(1994)的方法，从YEB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的AB液体培养基中，200rpm继续振摇培养至OD600为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、4℃离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。
实施例4转基因植物的制备本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻中花11(感盐品种，可购自中国农业科学院作物品种资源库)以及日本晴(可购自国际水稻研究所等的水稻品种资源库)的成熟胚愈伤。取成熟种子剥去种皮，用75％的乙醇消毒1-2分钟，无菌水冲洗2-3次，次氯酸钠消毒20-30分钟(无菌水∶5.2％次氯酸钠3∶1-4∶1)，无菌水冲洗4-5次，接入NBD培养基，7-10天后切取愈伤组织转入相同的培养基，1-2周后继代一次，即可进行转化。将愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，把已浸泡过的愈伤组织转移到垫有一层无菌滤纸的含2.5％Phytagel的NBD(AS100)培养基上共培养2-3天。
共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮作为农杆菌Vir基因活化物，使用浓度为100μmol/L。共培养后将愈伤组织用无菌滤纸吸干(换一次滤纸)，转至筛选培养基上筛选抗性愈伤，暗中筛选培养45天左右，(中间换一次筛选培养基。筛选培养基第一次筛选用NBD+Cef700μl+Hyg25mg/L；第二次筛选用NBD+Cef500μl+Hyg50mg/L)。将筛选生长的水稻愈伤转至预分化培养基，培养10天。
将经过预分化的水稻愈伤转至分化培养基上分化成苗(光照，15-30天)。再生的小苗在1/2MSoH培养基上生根壮苗，随后移入大田栽培。获得的再生植株移栽成活后以除草剂或GUS染色再次筛选鉴定转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR或Southern杂交进一步鉴定转化植株。用转基因T1代进行盐胁迫(100mM NaCl和150mM NaCl)观察表型，验证Rap因功能。
结果表明，转基因水稻的耐盐性有所提高。对阳性转化植株进行盐胁迫分析表明，日本晴的Rap基因正义超表达有助于提高转化植株的耐盐性(图3)。这明确表明Rap在水稻耐盐过程中起着重要的作用。
实施例5水稻锚定序列重复蛋白的制备在该实施例中，以实施例3步骤(1)中cDNA克隆AU163572(购自日本国家农业科学研究所基因库，NIAS)为模板，基于SEQ ID NO1起始密码子以及终止密码子附近设计引物(SEQ ID NO5和6)，用高保真Taq酶pfuTaq(购自STRATAGENE公司，LaJolla，CA)进行扩增，获得扩增产物1.65kb。
其中，5’寡核苷酸引物序列为5’-CCATGGCGCTCGAAATCCATGAAG-3’(SEQ ID NO5)；3’端引物序列为5’-TCTAGAGCATACACTTGGTTAAGCTCAGTC-3’(SEQ ID NO6)将扩增产物以普通Taq酶加A重组进pGEM T-easy载体(购自Promega，Madison，WI，USA.)。重组子酶切鉴定后测序。以NcoI和EcoRI消化重组有日本晴Rap的pGEM T-easy，回收纯化目的片段；T4连接酶连进同样以NcoI和EcoRI消化的pET32a(+)(购自Novagen公司，Madison，WI，USA.)。以NcoI和EcoRI酶切鉴定重组子。鉴定正确的进行测序，验证读码框以及序列的正确性。将重组有Rap的原核表达载体pET32a(+)转化入大肠杆菌DH5α，IPTG诱导原核表达，然后His-tag柱纯化蛋白。
结果获得了纯化的Rap蛋白，用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定蛋白质分子量约为60Kda。
实施例6制备抗体将实施例5中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀Rap基因翻译产物的能力加以评估。
结果发现，该抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
实施例7Rap突变体可提高耐盐性用常规的PCR定点诱变方法，获得编码556位Leu→Ile突变的cDNA序列，然后用实施例3-4中相似方法获得制备被该突变基因所转化的水稻。用转基因T1代进行盐胁迫(100mM NaCl和150mM NaCl)观察表型，验证Rap突变体的基因功能。
结果表明，该突变体日本晴的Rap基因的正义超表达同样有助于提高转化植株的耐盐性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>水稻抗逆相关基因-锚定序列重复蛋白基因及其应用<130>048877<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1815<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
<221>CDS<222>(49)..(1716)<223>
<400>1cagggataat cccactactg gctactgcat tcgcttatct cgctcgcg atg tcg ctc57Met Ser Leu1gaa atc cat gaa gag gag gga gga ggt acg gcg gcg gcg gcg gcg gtg105Glu Ile His Glu Glu Glu Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Val5 10 15aag gtg atg acg gtg tcg ggg agc ggg aag cgg ggg cgg tac gtg cgg153Lys Val Met Thr Val Ser Gly Ser Gly Lys Arg Gly Arg Tyr Val Arg20 25 30 35cag gtg acg ggg cgg cac aac gac acc gac ctg cac gtg gcg gcc cgc201Gln Val Thr Gly Arg His Asn Asp Thr Asp Leu His Val Ala Ala Arg40 45 50gga ggg gac gcc ggg gcg ctg cgc cgc gcg ctg gac gag gcg gcg gcg249Gly Gly Asp Ala Gly Ala Leu Arg Arg Ala Leu Asp Glu Ala Ala Ala55 60 65gcc gtg gcc acc ggg gag ggg agg gag gcg ctg gag gag gtg cgg cgg297Ala Val Ala Thr Gly Glu Gly Arg Glu Ala Leu Glu Glu Val Arg Arg70 75 80gcc gtg gcg gcg gag ccc aac gag gcc ggg gag acg ccg ctc gtc gcc345Ala Val Ala Ala Glu Pro Asn Glu Ala Gly Glu Thr Pro Leu Val Ala85 90 95gcg gcg gag agg ggg cac ctg gag gtg gta agg gag ctg ctc agg cac393Ala Ala Glu Arg Gly His Leu Glu ValVal Arg Glu Leu Leu Arg His100 105110 115ctc gac gcc gag ggg gtc gcc gcg aag aac agg tcg ggg tac gac gcg441Leu Asp Ala Glu Gly Val Ala Ala Lys Asn Arg Ser Gly Tyr Asp Ala120 125 130
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权利要求
1.一种分离的水稻锚定序列重复蛋白，其特征在于，它包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高水稻耐盐性的功能的由(a)衍生的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码权利要求1所述的多肽。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中1-1815位的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO1中49-1716位的核苷酸序列；(c)具有SEQ ID NO7中1-1854位的核苷酸序列；(d)具有SEQ ID NO9中1-3640位的核苷酸序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。
8.一种水稻锚定序列重复蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出水稻锚定序列重复蛋白。
9.一种改良植物的方法，其特征在于，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有水稻锚定序列重复蛋白的编码序列，所述的水稻锚定序列重复蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高水稻耐盐性的功能的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使水稻锚定序列重复蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入水稻锚定序列重复蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法改良植物的耐盐性和/或抗旱性。
全文摘要
本发明提供了一种新的植物基因－水稻锚定序列重复蛋白基因(Riceankyrin－repeat protein，Rap)及其编码蛋白。本发明还公开了这种锚定序列重复蛋白基因的用途，尤其是在植物品种改良和杂交育种中用于改变植物的耐盐性和/或抗旱性。
文档编号C12N15/29GK1786027SQ20041008938
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者林鸿宣, 晁代印, 施敏, 葛良法, 朱美珍 申请人:中国科学院上海生命科学研究院