一种筛选抗白粉病小麦的方法及其专用引物的制作方法

专利名称：一种筛选抗白粉病小麦的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选抗白粉病小麦的方法及其专用引物。
背景技术：
小麦白粉病是由小麦白粉菌Blumeria graminis f.sp.tritici引起的真菌性病害，已成为影响世界小麦生产的重要病害。在20世纪70年代以前，我国小麦白粉病仅在云、贵、川和山东沿海等湿润多雨地区流行，但近三十年，由于水肥条件的改善和矮杆品种的应用，其发生范围和面积不断扩大，危害程度明显加重，成为影响我国小麦生产的主要病害，几乎所有小麦产区都有发生，每年均对生产造成较大损失，流行年份损失更重。如1990和1991年白粉病在全国大流行，两年发生面积均超过1.8亿亩，年损失小麦32亿公斤，发生范围遍及全国各主要麦区。
利用抗病品种是防治小麦白粉病最经济、有效、安全易行的途径，选育和推广抗病品种是控制病害流行的首选措施。国内外在小麦白粉病抗病育种方面做了大量工作，育成的抗病品种对减轻病害损失发挥了一定作用。但由于病原菌小种的快速变化以及抗病育种过程中过分强调免疫或高抗类型的选择，品种抗性频繁丧失，抗病育种始终处于被动应付状态。在欧洲，抗白粉病品种在生产中推广后，快则2-3年，慢则4-5年就丧失了抗病能力(段霞瑜，欧洲小麦白粉菌的毒性监测和抗病基因的利用，植物保护，20(3)36-38，1994，)。在我国，花费多年培育的抗病品种应用不久，有的甚至还未应用，就由于病菌群体的变化而丧失抗性。“七五”期间，含Pm8的品种在全国丧失抗性；“八五”和“九五”期间，Pm4a在北京、贵州、河北、河南、山东、湖北和江苏7省市的毒性频率呈上升趋势(33.3％-100％)，Pm6在上述7省市的抗性已接近丧失，其毒性频率为91.3％-100％；还发现了对我国自己转育成功并定名的抗病基因Pm21有毒性的菌株(段霞瑜，周益林，盛宝欣，我国主要麦区小麦白粉菌毒性现状，植物保护21世纪展望，北京中国科学技术出版社，246-249，1998)；2003年含有Pm2基因的品种在我们试验地也丧失抗性。目前国内推广的品种大多高感或中感白粉病，生产上迫切需要抗性好且持久的品种。
实践表明，累加多个有效抗病基因是提高品种抗病广谱性和延长品种抗性寿命的有效手段之一。但是，在育种实践中通过常规手段难以鉴定出多个基因在一起的材料。利用分子标记辅助选择(maker-assisted selection，MAS)，可快速、准确地鉴定出具体的抗性基因，从而实现抗病基因的聚合。
自从90年代以来，已找到了小麦锈病、赤霉病、白粉病等病害的不少抗病基因的分子标记。SSR(simple sequence repeat，即简单重复序列)标记又称作微卫星(Microsatellite)标记，由于具有多态性高、染色体专化性强，重复性好、操作简单等优点，而被广泛应用于小麦、水稻、玉米、大豆等作物的分子标记、遗传作图等项研究。
目前国际上已发现的小麦主效抗白粉病基因有42个，分别位于32个基因位点，在这些基因当中，仅Pm2，Pm4b，Pm12，Pm13，Pm16，Pm20，Pm21，Pm30，Pm31在我国大部分麦区抗性是有效的，特别是Pm16基因在我国抗谱广、抗性强。然而，到目前为止还未发现Pm16基因的分子标记。因此，发掘Pm16基因的分子标记，对于培育多基因聚合体材料，培育持久抗性品种和进一步的基因克隆具有重要意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种可用于筛选抗白粉病小麦的引物。
本发明所提供的用于筛选抗白粉病小麦的引物，名称为xgwm159，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。
序列表中的序列1由18个碱基组成，序列表中的序列2由20个碱基组成。
本发明的第二个目的是提供一种筛选抗白粉病小麦的方法。
本发明所提供的筛选抗白粉病小麦的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有197bp和193bp大小的条带。
如扩增产物中有197bp和193bp大小的条带，待测小麦为抗白粉病小麦。
其中，以25μl总体积为例，PCR扩增的反应体系包括模板DNA(20ng/μl)5μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，引物对(2μM)3μl，dNTPs(2.5mM)0.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，无菌蒸馏水13.8μl。10×PCR缓冲液的组成是Tris-HCl(pH8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM。反应程序是94℃预变性5min，随后进行35个循环94℃40s，60℃30s，72℃40s；最后72℃延伸10min，4℃保存。
所述检测扩增产物的方法可为对扩增产物进行6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。具体可为每份扩增产物中加入8μl变性的载样指示剂(98％甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝和0.25％二甲苯青)，95℃变性5-10mins。每份变性的扩增样品7μl在浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。检测扩增产物中是否有197bp和193bp大小的条带。
由于Pm16基因以前已被定位在小麦4A染色体上(Reader，S.M.，and T.E.Miller，1991The introduction into bread wheat of a major gene for resistanceto powdery mildew from wild emmer wheat.Euphytica 53，57-60.)，发明人选用定位在4A染色体上的16对SSR引物，以及与小麦4A染色体有部分同源关系的水稻第3染色体上的15对SSR引物对小麦材料70281(含抗病基因Pm16)、Chanceller(感病)、抗病池、感病池进行扩增。结果表明所有引物在抗病池和感病池间的扩增产物均无多态性，仅有4对引物在亲本间有多态性，与预期的结果不符。因为Naranjo等(Naranjo，T.，A.Roca，P.G.Goicoechea，and R.Giraldez，1987Arm homoeology of wheat and rye chromosomes.Genome 29，873-882)发现在小麦进化过程中第4、5和7同源染色体组发生了交换，后来得到了Nelson等人(Nelson，J.C.，M.E.Sorrells，A.E.V.Deynze，Y.H.Lu，M.Atkinson，M.Bernard，P.Leroy，J.D.Faris and J.A.Anderson，1995Molecular mapping of wheatMajor genes and rearrangments in homoeologous groups 4，5，and 7.Genetics141，721-731.)的证实。所以进一步选用小麦4B、5A、5B、7A和7B染色体上的34对SSR引物对感病品种Chanceller、含有Pm16的抗病品系70281(PM16/北京8373)以及以这两个亲本杂交组合的F2代分离群体进行分子标记筛选和遗传连锁分析，结果表明引物xgwm159在抗、感亲本和抗、感池间均存在明显的多态性，抗病亲本和抗病池均具有197bp和193bp两条带，感病亲本和感病池均具有193bp和191bp两条带，其中197bp的特征带为抗病病亲本和抗病池所特有，且与抗白粉病基因Pm16紧密连锁，其遗传距离为5.3cM。经中国春缺体-四体分析，证明了Pm16基因位于小麦5B染色体短臂(5BS)，并非4A染色体。并用7个感病小麦品种和16个含有已知抗病基因的抗病品种(系)进行了验证，结果表明SSR分子标记xgwm159是小麦抗白粉病基因Pm16的很好标记。
本发明提供了小麦抗白粉病基因Pm16的SSR分子标记xgwm159，该标记与Pm16基因紧密连锁(5.3cM)，Pm16基因在我国抗谱广、抗性强，利用该标记可以对抗病基因Pm16进行分子标记辅助选择，从而实现与其它有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明的方法及其专用引物将在小麦抗白粉病基因Pm16的筛选和小麦抗病育种中发挥重要作用。


图1a为微卫星引物xgwm159对抗、感亲本，抗、感池间和F2群体单株的扩增结果图1b为微卫星引物Borc004对抗、感亲本，抗、感池间和F2群体单株的扩增结果图1c为微卫星引物Borc109对抗、感亲本，抗、感池间和F2群体单株的扩增结果图2为SSR标记与抗病基因Pm16的连锁3为引物xgwm159对中国春的第4、5同源群的部分缺体-四体材料的PCR扩增产物电泳4a-图4b为引物xgwm159对7个感病品种和16个含有已知抗病基因的抗病品种的PCR扩增产物电泳图具体实施方式
实施例中未注明小麦材料来源者均购自于国家种质资源库。
实施例1、小麦抗白粉病基因Pm16的SSR分子标记xgwm159的获得1、用华北地区流行的白粉菌15号生理小种对“Chanceller×70281(杂交组合为PM16/北京8373)F2代群体进行苗期抗性鉴定，共鉴定F2群体156株，其中抗病116株，感病40株，符合3∶1的抗感分离比例(x2＝0.286＜x20.01＝6.63)，表明70281含有一个显性抗病基因。从抗源分析，这个抗病基因就是Pm16。选用10株典型抗病株和10株感病株分别组成抗病池和感病池。
选用小麦4A染色体上的微卫星(SSR)引物16对，4B、5A、5B、7A、7B染色体上的微卫星(SSR)引物34对(引物名称和序列见Rder M.S.，Korzum V.，WendehakeK.，Plaschke J.，Tixier M.H.，Leroy P.and Ganal M.W.1998.A microsatellitemap of wheat.Genetics 1492002-2023和美国大、小麦赤霉病协作网http//www.scabusa.org)以及水稻第3染色体上的微卫星引物15对(见Temnykh S.，Park W.D.，Ayres N.，Cartinhour S.，Hauck N.，Lipovich L.，Cho Y.G.and IshiiT.2000.Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice(Oryza sativa L.).Theor Appl Genet 100697-712.)，对70281、Chanceller、抗病池、感病池进行扩增。其中，PCR反应体系为每个反应的总体积为25μl，包括模板DNA(20ng/μl)5μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，引物对(2μM)3μl，dNTPs(2.5mM)0.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，无菌蒸馏水13.8μl。10×PCR缓冲液的组成是Tris-HCl(pH8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM。反应程序是94℃预变性5min，随后进行35个循环94℃40s，60℃30s，72℃40s；最后72℃延伸10min，4℃保存。每份扩增产物中加入8μl变性的载样指示剂(98％甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝和0.25％二甲苯青)，95℃变性5-10mins。每份变性的扩增样品7μl在浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。结果如图1a-图1c所示，表明位于染色体5BS上的xgwm159、Borc004和Borc109在抗感亲本间扩增产物具有多态性，xgwm159在抗感亲本及抗感池间均扩增出明显不同的微卫星标记带各两条，抗病亲本和抗病池均为197bp和193bp两条带，感病亲本和感病池均为193bp和191bp两条带，其中197bp的特征带为抗病病亲本和抗病池所特有，初步表明xgwm159与Pm16连锁。图1a中，M为100bpDNA Ladder(箭头示200bp)，CK为二粒抗(Pm16)(购自中国农业科学院品种资源研究所)，7，PR为70281，PS为Chanceller，BR为抗病池，BS为感病池，R为F2群体抗病单株，S为F2群体感病单株，a为197bp，b为193bp，c为191bp。图1b中，M为100bpDNA Ladder(箭头示200bp)，CS为中国春，PR为70281，PS为Chanceller，R为F2群体抗病单株，S为F2群体感病单株。图1c中，1为100bpDNA Ladder(箭头示200bp)，2为CS，3为70281，4为Chanceller，5-34为F2群体部分单株。
2、用5B上的3个引物xgwm159、Borc004和Borc109对F2群体156个单株分别进行扩增(反应体系和反应条件同步骤1)，用MAPMAKER/EXP 3.0软件对微卫星标记及基因位点进行连锁分析。结果如图2所示，表明Pm16的基因位点与这3个标记位点连锁，其排列顺序为Pm16-Xgwm159-Borc109-Borc004。三个区间的遗传距离依次为5.3cM、23.7cM、2.2cM。因此Pm16与Xgwm159的遗传距离为5.3cM。
3、用特异标记引物xgwm159对中国春的第4、5同源群的部分缺体-四体材料(N4AT4D，N4AT4B，N4DT4B，N5BT5D，N5AT5D和N5AT5B，购于西北农林科技大学)扩增(反应体系和反应条件同步骤1)，结果如图3所示，表明在缺5B染色体的材料中没有扩增出与感病亲本一致的带，而在其它材料中均能扩增出这条带，由此进一步证实Pm16基因位于5B染色体上，而并非4A染色体。图3中，M为pBR322DNA/MspI Markers，1、4为CS，2、3为Opata，5、6为CSN5BT5D，7为CSN5AT5D，8为CSN5AT5B，9为CSN4AT4D，10为CSN4AT4B，11为CSN4DT4B，12为二粒抗(Pm16)，13为70281，14为Chanceller，15为抗病池，16为感病池；箭头示没有扩增片段。
实施例2、Xgwm159做为筛选小麦抗白粉病基因Pm16的分子标记的验证为了进一步检测微卫星引物Xgwm159标记的特异性，用它对除了Chanceller和70281以外的感病材料6份和含有其它抗白粉病菌15号小种基因或多基因聚合的材料15份，进行PCR扩增(反应体系和反应条件同实施例1)，感病材料是中国春、京411、宛7107、罗卜林、CA0015、CA0131。抗病材料是CA9640(Pm2，来自于杂交组合CA8695/C39//京411)，40275(Pm4b，来自于杂交组合V.P.M./百农3217)，二粒抗(Pm16)(购自中国农业科学院品种资源研究所)，70281(Pm16)，41139(Pm12，来自于杂交组合农大015/87-1//Line31/3/2*中麦9)，40375(Pm12，来自于杂交组合Line31/4*百农3217)，40388(Pm13，来自于杂交组合T3BL.3BS-3S1#1S/2*百农3217//96鉴63)，C262(Pm21，来自于杂交组合T6AL.6VS/2*农大93)，C266(Pm21，来自于杂交组合中9303/T6AL.6VS//矮早/3/93鉴64)，CA9550(Pm2+Pm4b，来自于杂交组合CA8695/C39//京411)，WM1(Pm13+Pm4b，来自于杂交YW243//T3BL.3BS-3S1#1S/2*百农3217)，WM16(Pm12+Pm4b，来自于杂交组合Line31/4*百农3217//YW243)，WM30(Pm4b+Pm21+Pm12，来自于杂交组合Line31/4*百农3217//YW243/3/PM97033)和WM42(Pm21+Pm4b，来自于杂交组合Line31/4*百农3217//YW243/3/PM97033)，3B509(购自中国农业大学)和3B625(购自中国农业大学)均具有二粒抗血缘。结果如图4a-图4b所示，表明在所有感病材料和其它抗病材料中均没有扩增出与含有Pm16基因的抗病亲本70281和二粒抗相同的特征带197bp。因此xgwm159可作为抗白粉病基因Pm16的特异分子标记，而应用于分子标记辅助选择，筛选抗白粉病的小麦品种和品系。图4a中，1为pBR322DNA/Msp IMarkers，2为二粒抗(Pm16)，3为Chanceller，4为CS，5为CA0015，6为CA0131，7为京411，8为70281，9为宛7107，10为罗卜林，11为CA9640，12为40275，13为二粒抗(Pm16)，14为41139，15为40375，16为40388，17为3B509，18为3B625，19为C262，20为C266。图4b中，1为pBR322DNA/Msp I Markers，2为70281，3为Chanceller，4为CA9550，5为WM16，6为WM1，7为WM42，8为WM30。
序列表<160>2<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1gggccaacac tggaacac 18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2gcagaagctt gttggtaggc 20
权利要求
1.用于筛选抗白粉病小麦的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。
2.一种筛选抗白粉病小麦的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有197bp和193bp大小的条带。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系的总体积为25μl，包括模板DNA(20ng/μl)5μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，引物对(2μM)3μl，dNTPs(2.5mM)0.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，无菌蒸馏水13.8μl；反应程序是94℃预变性5min，随后进行35个循环94℃ 40s，60℃30s，72℃40s；最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述检测扩增产物方法为对扩增产物进行6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。
全文摘要
本发明公开了一种筛选抗白粉病小麦的方法及其专用引物。本发明所提供的用于筛选抗白粉病小麦的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。筛选抗白粉病小麦的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有197bp和193bp大小的条带。本发明的方法及其专用引物将在小麦抗白粉病基因Pm16的筛选和小麦抗病育种中发挥重要作用。
文档编号C12Q1/68GK1775953SQ20041009082
公开日2006年5月24日 申请日期2004年11月15日 优先权日2004年11月15日
发明者陈新民, 罗英皓, 何中虎, 夏兰芹, 陈孝 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所