专利名称：筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，是一种筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法。
背景技术：
目前国内外转基因动物细胞阳性单克隆的筛选与培养，多选用抗新霉素基因为筛选标志，实验过程中，由于被基因转染的细胞数较少，能在培养过程中稳定遗传的细胞数更少，因此转基因动物细胞阳性单克隆的筛选十分重要。但是，用新霉素筛选转基因动物细胞阳性单克隆时，一般先进行动物细胞的培养，然后在进行正常细胞新霉素浓度敏感性检测，得到正常细胞致死新霉素浓度范围后，将正常细胞进行基因转染，将转染后细胞用致死范围内的新霉素浓度处理，存留下来细胞低浓度稀释，进行96孔板单细胞克隆筛选；有关细胞计数、活细胞检测、新霉素浓度敏感性检测及转染方法和步骤详见薛庆善主编的2001年由科学出版社出版的“体外培养的原理与技术”一书；由于该实验方法工作量大，消耗大量的培养基和培养耗材，同时由于单细胞筛选，细胞间失去接触、联系，在新霉素的作用下细胞极易老化、死亡，因此上述转基因动物细胞阳性单克隆的筛选与培养方法效率较低、成本较高、费工费时。
发明内容
本发明提供了一种筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，克服了现有技术之不足，其效率较高、成本较低、省时省工。
本发明的技术方案是这样来实现的一种筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其按下述步骤进行第一步，在培养液中对需要克隆的动物细胞进行培养，待其动物细胞聚合至40％至80％后，进行基因转染；第二步，在基因转染后进行1天至7天的动物细胞生长恢复，然后用能致死非基因转染动物细胞的浓度的新霉素进行5天至20天筛选；第三步，在第二步致死性筛选后，在阳性转基因动物细胞维持生长的浓度的新霉素下，再加入离心收集的该动物细胞对数生长期含有生长因子培养液的条件下，在培养液中进行2天至14天的动物细胞培养扩增；第四步，当第三步中的阳性转基因动物细胞生长形成克隆后，用细胞刮刀刮除正常细胞，保留转基因阳性动物细胞克隆；第五步，挑选和标记选定的转基因动物细胞阳性单克隆，用0.125％至0.25％胰酶或EDTA-胰酶定点消化该单克隆细胞并将消化后的阳性单克隆细胞迅速置入新的培养器皿中培养扩增，培养扩增至50％--80％的细胞聚合，用0.125％至0.25％浓度的胰酶或EDTA-胰酶消化和悬浮上述所培养扩增的阳性转基因单克隆动物细胞，加入培养液和致死非基因转染动物细胞的浓度的新霉素，继续培养细胞，在致死非基因转染动物细胞的浓度的新霉素和胰酶或EDTA-胰酶作用下，在培养液中致死残留的非基因转染动物细胞；第六步，将第五步所得到阳性单克隆动物细胞再植入新的培养器皿中培养，在阳性转基因动物细胞维持生长的浓度的新霉素条件下，再加入离心收集的该细胞对数生长期含有生长因子培养液的条件下，即可得到大量的纯化的转基因阳性单克隆动物细胞。
本发明特别适用于牛、羊和猪等哺乳类转基因动物细胞阳性单克隆的筛选与培养。依照此方法可获得众多不同转基因阳性单克隆动物细胞。
下面是对本发明技术方案的进一步优化上述需要筛选的转基因动物细胞可为成年荷斯坦奶牛成纤维细胞。
上述成年荷斯坦奶牛成纤维细胞被致死的新霉素浓度可为300μg/ml至1000μg/ml。
上述成年荷斯坦奶牛成纤维细胞能维持生长的新霉素浓度可为50μg/ml至250μg/ml。
上述需要筛选的转基因动物细胞可为成年莎能奶山羊成纤维细胞。
上述成年莎能奶山羊成纤维细胞被致死的新霉素浓度可为250μg/ml至800μg/ml。
上述成年莎能奶山羊成纤维细胞能维持生长的新霉素浓度可为20μg/ml至200μg/ml。
上述需要筛选的转基因动物细胞可为猪成纤维细胞。
上述猪成纤维细胞被致死的新霉素浓度可为400μg/ml至1000μg/ml。
上述猪成纤维细胞能维持生长的新霉素浓度可为100μg/ml至300μg/ml。
上述培养液可为含有10％至20％牛血清或小牛血清或类胎牛血清或胎牛血清和100u/ml双抗的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培养基的培养液。
上述基因转染可以脂质体包埋或电穿孔方法进行。
本发明的特点本发明的特点省时省工，效率高，并且大大降低了筛选转基因动物细胞阳性单克隆的成本。同时该方法适用于商业上具有经济价值的转基因动物细胞阳性单克隆的筛选，是制作转基因动物的必要手段之一。
附图1为激发光照射下含有绿色荧光蛋白、新霉素抗性基因的牛耳成纤维细胞阳性单克隆。
附图2为已将乳腺特异表达启动子、绿色荧光蛋白及新霉素抗性三种基因同时导入的牛耳成纤维细胞阳性单克隆。
图3、图4激发光照射下正在生长的同时含有乳腺特异表达启动子、绿色荧光白及新霉抗性三种基因的莎能奶山羊成纤维细胞阳性单克隆。
具体实施例方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
实施例1，用含有10％或15％或20％的牛血清或小牛血清或类胎牛血清或胎牛血清和100u/ml双抗的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培养基的培养液，纯化培养成年荷斯坦奶牛成纤维细胞，待细胞聚合至40％或50％或60％或70％或80％，以脂质体包埋或电穿孔方法进行基因转染，24小时或36小时或48小时的细胞生长恢复，然后用300μg/ml或500μg/ml或750μg/ml或1000μg/ml浓度新霉素筛选培养5天或10天或14天，再用含20％的牛血清或小牛血清或类胎牛血清或胎牛血清、100u/ml双抗和50μg/ml或100μg/ml或150μg/ml或200μg/ml或250μg/ml新霉素的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培养基的培养液并加入离心收集的该细胞对数生长期含有生长因子培养液，使阳性转基因细胞生长、扩增2天或6天或10天。待阳性转基因动物细胞生长形成克隆后并长到接触抑制，用细胞刮刀尽可能刮除正常细胞，保留阳性克隆。挑选和标记选定的转基因动物细胞阳性单克隆，用0.125％至0.25％胰酶或EDTA-胰酶定点消化该单克隆细胞并将消化后的阳性单克隆细胞迅速置入新的培养器皿中培养扩增，培养扩增至50％--80％的细胞聚合，用胰酶或EDTA-胰酶消化和悬浮上述培养放大的阳性转基因单克隆动物细胞，并在培养液中保留原消化胰酶和加入300μg/ml或500μg/ml或750μg/ml或1000μg/ml筛选浓度的新霉素，残留下来的正常细胞由于受胰酶或EDTA-胰酶和新霉素双重负作用因子影响，将很难再贴壁并很快死亡。将上述细胞植入各种培养器皿，再次联合使用离心收集到的该细胞对数生长期含有生长因子培养液，保持50μg/ml或100μg/ml、150μg/ml或200μg/ml或250μg/ml阳性转基因动物细胞维持生长的浓度的新霉素，即可得到大量的转基因阳性单克隆动物细胞。
实施例2，用含有10％或15％或20％牛血清或小牛血清或类胎牛血清或胎牛血清和100u/ml双抗的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培养基的培养液，纯化培养成年莎能奶山羊成纤维细胞，待细胞聚合至40％或50％或60％或70％或80％，以脂质体包埋或电穿孔方法进行基因转染，24小时或36小时或48小时的细胞生长恢复，然后用250μg/ml或600μg/ml或800μg/ml浓度新霉素筛选培养5天或10天或14天，再用含有20％牛血清或小牛血清或类胎牛血清或胎牛血清、100u/ml双抗和20μg/ml或60μg/ml或100μg/ml或140μg/ml或180μg/ml或200μg/ml新霉素的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培养基的培养液并加入离心收集的该细胞对数生长期含有生长因子培养液，使阳性转基因细胞生长、扩增2天或6天或10天。待阳性转基因动物细胞生长形成克隆后并长到接触抑制，用细胞刮刀尽可能刮除正常细胞，保留阳性克隆。挑选和标记选定的转基因动物细胞阳性单克隆，用0.125％至0.25％胰酶或EDTA-胰酶定点消化该单克隆细胞并将消化后的阳性单克隆细胞迅速置入新的培养器皿中培养扩增，培养扩增至50％--80％的细胞聚合，用胰酶或EDTA-胰酶消化和悬浮上述培养放大的阳性转基因单克隆动物细胞，并在培养液中保留原消化胰酶和加入250μg/ml或600μg/ml或800μg/ml筛选浓度的新霉素，残留下来的正常细胞由于受胰酶或EDTA-胰酶和新霉素双重负作用因子影响，将很难再贴壁并很快死亡。将上述细胞植入各种培养器皿，再次联合使用离心收集到的该细胞对数生长期含有生长因子培养液，保持50μg/ml或100μg/ml或150μg/ml或200μg/ml阳性转基因动物细胞维持生长的浓度的新霉素，即可得到大量的转基因动物阳性单克隆细胞。
实施例3，用含有10％或15％或20％牛血清或小牛血清或类胎牛血清或胎牛血清和100u/ml双抗的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培养基的培养液，纯化培养猪成纤维细胞，待细胞聚合至40％或50％或60％或70％或80％，以脂质体包埋或电穿孔方法进行基因转染，24小时或36小时或48小时的细胞生长恢复，然后用400μg/ml或600μg/ml或800μg/ml或1000μg/ml浓度新霉素筛选培养5天或10天或14天，再用20％牛血清或小牛血清或类胎牛血清或胎牛血清、100u/ml双抗和100μg/ml或200μg/ml或300μg/ml新霉素的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培养基的培养液并加入离心收集的该细胞对数生长期含有生长因子培养基，使阳性转基因细胞生长、扩增2天或6天或10天。待阳性转基因动物细胞生长形成克隆后并长到接触抑制，用细胞刮刀尽可能刮除正常细胞，保留阳性克隆。挑选和标记选定的转基因动物细胞阳性单克隆，用0.125％至0.25％胰酶或EDTA-胰酶定点消化该单克隆细胞并将消化后的阳性单克隆细胞迅速置入新的培养器皿中培养扩增，培养扩增至50％--80％的细胞聚合，用胰酶或EDTA-胰酶消化和悬浮上述培养放大的阳性转基因单克隆动物细胞，并在培养液中保留原消化胰酶和加入400μg/ml或600μg/ml或800μg/ml或1000μg/ml筛选浓度的新霉素，残留下来的正常细胞由于受胰酶或EDTA-胰酶和新霉素双重负作用因子影响，将很难再贴壁并很快死亡。将上述细胞植入各种培养器皿，再次联合使用离心收集到的该细胞对数生长期含有生长因子培养基，保持100μg/ml或200μg/ml或300μg/ml阳性转基因动物细胞维持生长的浓度的新霉素，即可得到大量的转基因动物阳性单克隆细胞。
从实施例1、实施例2和实施例3来看，本发明不仅适用于牛、羊和猪的转基因成纤维细胞阳性克隆的筛选，还适用于其它哺乳类转基因动物细胞阳性克隆的筛选与培养。
权利要求
1.一种筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其特征在于按下述步骤进行第一步，在培养液中对需要转基因的动物细胞进行培养，待其动物细胞聚合至40％至80％后，进行基因转染；第二步，在基因转染后进行1天至7天的动物细胞生长恢复，然后用能致死非基因转染动物细胞的浓度的新霉素进行5天至20天筛选；第三步，在第二步致死性筛选后，使用转基因动物细胞维持生长浓度的新霉素，再加入离心收集的该动物细胞对数生长期含有生长因子培养液，在此条件下，在培养液中进行2天至14天的动物细胞培养扩增；第四步，当第三步中的阳性转基因动物细胞生长形成克隆后，用细胞刮刀刮除正常细胞，保留转基因阳性动物细胞克隆；第五步，挑选和标记选定的转基因动物细胞阳性单克隆，用0.125％至0.25％胰酶或EDTA-胰酶定点消化该单克隆细胞并将消化后的阳性单克隆细胞迅速置入新的培养器皿中培养扩增，培养扩增至50％--80％的细胞聚合，用0.125％至0.25％浓度的胰酶或EDTA-胰酶消化和悬浮上述所培养扩增的阳性转基因单克隆动物细胞，加入培养液和致死非基因转染动物细胞的浓度的新霉素，继续培养细胞，在致死非基因转染动物细胞的浓度的新霉素和胰酶或EDTA-胰酶作用下，在培养液中致死残留的非基因转染动物细胞；第六步，将第五步所得到阳性单克隆动物细胞再植入新的培养器皿中培养，在阳性转基因动物细胞维持生长的浓度的新霉素条件下，再加入离心收集的该细胞对数生长期含有生长因子培养液的条件下，即可得到大量的纯化的转基因阳性单克隆动物细胞。
2.根据权利要求1所述的筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其特征在于需要筛选的转基因动物细胞为成年荷斯坦奶牛成纤维细胞。
3.根据权利要求2所述的筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其特征在于成年荷斯坦奶牛成纤维细胞被致死的新霉素浓度为300μg/ml至1000μg/ml；或/和，成年荷斯坦奶牛成纤维细胞能维持生长的新霉素浓度为50μg/ml至250μg/ml。
4.根据权利要求1所述的筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其特征在于需要筛选的转基因动物细胞为成年莎能奶山羊成纤维细胞。
5.根据权利要求2所述的筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其特征在于成年莎能奶山羊成纤维细胞被致死的新霉素浓度为250μg/ml至800μg/ml；或/和，成年莎能奶山羊成纤维细胞能维持生长的新霉素浓度为20μg/ml至200μg/ml。
6.根据权利要求1所述的筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其特征在于需要筛选的转基因动物细胞为猪成纤维细胞。
7.根据权利要求2所述的筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其特征在于猪成纤维细胞被致死的新霉素浓度为400μg/ml至1000μg/ml；或/和，猪成纤维细胞能维持生长的新霉素浓度为100μg/ml至300μg/ml。
8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其特征在于培养液为含有10％至20％牛血清或小牛血清或类胎牛血清或胎牛血清和100u/ml双抗的RPMI1640或MEM或DMEM或DMEM/F12或F12或F10或199培养基的培养液。
9.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其特征在于基因转染以脂质体包埋或电穿孔方法进行。
10.根据权利要求8所述的筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其特征在于基因转染以脂质体包埋或电穿孔方法进行。
全文摘要
一种筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其按下述步骤进行第一步，对需要转基因的动物细胞进行培养，并进行基因转染；第二步，用能致死非基因转染动物细胞的浓度的新霉素进行筛选；第三步，转基因动物细胞阳性克隆的培养扩增；第四步，刮除非基因转染动物细胞，保留转基因动物细胞阳性克隆；第五步，挑选转基因动物细胞阳性单克隆并培养扩增，致死残留的非基因转染动物细胞；第六步，进一步培养扩增得到大量的转基因动物阳性单克隆细胞。本发明的特点省时省工，效率高，并且大大降低了筛选转基因动物细胞阳性单克隆的成本。同时该方法适用于商业上具有经济价值的转基因动物细胞阳性单克隆的筛选，是制作转基因动物的必要手段之一。
文档编号C12N5/10GK1616653SQ20041009283
公开日2005年5月18日 申请日期2004年11月12日 优先权日2004年9月20日
发明者王亮, 朱海, 吕自力, 刘婷婷, 帅志强, 彭涛 申请人:新疆金牛生物股份有限公司