专利名称：编码植物脱氧海普赖氨酸合成酶的dna，植物真核起始因子5a，转基因植物和控制植物衰 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有衰老诱导的表达的编码植物多肽的多核苷酸。本发明还涉及含有反义方向的所述多核苷酸的转基因植物和控制植物程序性细胞死亡，包括衰老的方法。更具体地讲，本发明涉及一种衰老诱导的植物脱氧海普赖氨酸(deoxyhypusine)合成酶基因和衰老诱导的eIF-5A基因，其表达是通过包括衰老在内的程序性细胞死亡的开始诱导的，以及将脱氧海普赖氨酸合成酶基因和eIF-5A基因单独或组合用于控制植物的程序性细胞死亡和衰老。
现有技术衰老是植物生命的生物学发育的终结期。它预示着死亡，并且在各种水平的生物学组构上发生，包括金植株、器官、花和果实，组织和单细胞。
衰老的开始可以由不同因素，包括内部和外部因素诱导。衰老是植物或诸如果实、花和叶的植物组织的生命中复杂的、高度调控的发育阶段。衰老会导致细胞膜和大分子的协调的降解，以及随后将代谢产物转移到植物的其他部分。
除了在正常植物发育期间所发生的程序衰老之外，细胞和组织的死亡以及所引起的代谢产物的转移是由于外部环境因子的协调作用而引起的。引起衰老提前开始(又被称作坏死或程序死亡)的外部因子包括环境胁迫，如温度、干旱、光照不足或营养不良，以及病原体侵袭。受到环境胁迫的植物组织还能产生乙烯，通常称之为胁迫乙烯(Buchanan，Wollaston，V.，1997，实验植物学杂志43，181-199；Wright，M.1974，植物，152063-69)。已知乙烯能在某些植物中导致衰老。
衰老不是一个被动的过程，相反，它是一个积极调控的过程，包括特定基因的调节表达。在衰老期间，总RNA水平降低并且很多基因的表达被关闭(Bate等，1991，实验植物学杂志42，801-11；Hensel等，1993，植物细胞，5，553-64)。不过，由越来越多的证据表明，衰老过程取决于从头开始的核基因的转录。例如，衰老是受mRNA和蛋白合成抑制剂和去核化抑制的。将来自衰老叶片和绿色叶片的mRNA用于体外翻译实验的分子研究发现了衰老叶片中叶片蛋白产物的改变了的形式(Thomas等，1992，植物生理学杂志，139，403-12)。利用视差筛选和扣除杂交技术业已从多种不同的植物中鉴定了代表衰老诱导基因的许多cDNA克隆，包括单子叶和双子叶植物，如拟南芥属、玉米、黄瓜、芦笋、番茄、水稻和马铃薯。专门在衰老期间表达的基因的鉴定是衰老的发展需要从头转录的有利证据。
在衰老期间所发生的事件似乎是高度协调的，以便能够在坏死和死亡发生之前最大限度地利用细胞成分。复杂的相互作用包括对特殊信号的感知和必须发生的一连串基因表达的诱导，以便调控该过程。编码衰老相关蛋白的基因的表达有可能是通过共同的活化蛋白调控的，而活化蛋白是通过激素信号直接或间接活化的。对有关该过程的起始信号或随后的协调作用的机制所知甚少。
协调的基因表达需要与转录和翻译相关的因子，包括起始因子。业已在包括植物在内的各种生物中分离并鉴定了翻译起始因子基因。真核翻译起始因子5A(eIF-5A)是大小为17KDa的一种重要的蛋白因子，它与真核细胞蛋白合成的开始相关。其特征是存在海普赖氨酸(hypusine)[N-(4-氨基-2-羟基丁基)赖氨酸]，它是一种修饰过的氨基酸，已知其仅存在于eIF-5A中。海普赖氨酸是在翻译之后通过将多胺、亚精胺上的丁基氨基基团转移到eIF-5A上面的特定赖氨酸残基的侧链氨基基团上并羟化而形成的。eIF-5A的活化包括将亚精胺的丁胺残基转移到eIF-5A的赖氨酸上，形成海普赖氨酸并活化eIF-5A。在真核生物中，脱氧海普赖氨酸合成酶(DHS)能介导海普赖氨酸在eIF-5A中的翻译后合成。不过，在植物中尚未鉴定相应的DHS基因，已知植物eIF-5A含有海普赖氨酸。用甲硫氨酰嘌呤霉素测定业已证实了海普赖氨酸的改性是eIF-5A活化所必需的。
海普赖氨酸仅存在于eIF-5A中，并且存在于所有真核生物、某些古细菌(似乎与真核生物相关)，但不存在于真杆菌中。另外，eIF-5A的氨基酸序列是高度保守的，特别是在海普赖氨酸残基周围的部分，这表明eIF-5A及其活化蛋白脱氧海普赖氨酸合成酶在真核细胞生理学中执行着在根本上很重要的步骤(Joe等，JBC，27022386-22392，1995)。业已从人、苜蓿、粘菌、粗糙链孢霉、烟草和酵母中克隆了eIF-5A。根据它是从兔网质红细胞裂解物的核糖体中分离的这一事实及其在促进甲硫氨酸嘌呤霉素合成方面的体外活性最初将其确定为一种普通的翻译起始因子。不过，最新的证据表明，eIF-5A不是球蛋白合成的翻译起始因子，而是起着促进特殊mRNA群体的特征的亚类的翻译的作用。例如，有来自用动物细胞和酵母所做实验的有利的证据表明，eIF-5A的一种或多种同种型在介导与细胞增殖相关的mRNA亚类的翻译中起着重要的作用。在酵母中有两种同种型，并且如果两个基因都是沉默的，该细胞就不能够分裂(Park等，生物学信号6，115-123，1997)。类似的，使能活化eIF-5A的酵母脱氧海普赖氨酸合成酶的表达沉默，能抑制细胞分裂。实际上，业已开发了脱氧海普赖氨酸合成酶的抑制剂，它很可能在过度增殖的症状的治疗中起重要作用(Wolff等，JBC，27215865-15871，1997)。其他研究业已证实，eIF-5A的另一种同种型是HIA-1复制的Rev功能或HTLLVV复制的Rex功能所必需的(Park等，生物学信号6115-123，1997)。在烟草中至少也有两种表达的eIF-5A基因。基因专一性检测表明，尽管这两种基因在所有检查过的组织中都能表达，但每一种基因具有不同的表达形式，它有可能调控特定转录物的翻译(Chamot等，核酸研究20625-669，1992)。
业已从大鼠睾丸、HeLa细胞、粗糙链孢霉和酵母中纯化了脱氧海普赖氨酸合成酶。脱氧海普赖氨酸合成酶的氨基酸序列是高度保守的，并且来自不同物种的这种酶具有类似的物理特性和催化特性，并且表现出与异源eIF-5A前体的交叉物种反应性(Park等，生物学信号6115-123，1997)。
植物多胺与多种生理学作用相关，包括花的诱导、胚胎发生、病原体抗性、细胞生长、分化和分裂(Evans等，1989，植物生理学植物分子生物学年度综述40，235-269；和Galston等，1990，植物生理学94，406-10)。业已证实，eIF-5A是一种中间介体，通过它多胺发生其作用(Chamot等，1992，核酸研究，20，4，665-69)。
业已鉴定了来自烟草的编码eIF-5A的同种型的两种基因(NeIF-5A1和NeIF-5A2)(Chamot等，1992，核酸研究，20，4，665-69)。业已证实这两种基因非常相似。不过，它们具有不同的表达方式。其中的一个基因似乎在mRNA水平上是组成型表达的，而另一种基因的表达形式与光合作用活性的存在或缺乏相关。根据基因结构和基因组Southern作图业已发现，在烟草中存在NeIF-5A基因的多基因家族。有可能存在一种eIF-5A同种型，它调控着衰老/坏死专一性mRNA转录物亚型的翻译。
目前，还没有能广泛应用的用来控制由内部因子或诸如环境胁迫的外部因子所导致的程序性细胞死亡(包括衰老)开始的方法。因此，人们有兴趣开发衰老调节技术，该技术适用于所有类型的植物，并且在导致衰老的一连串事件的最初阶段是有效的。
发明概述本发明基于编码番茄衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶(DHS)的完整长度cDNA克隆，以及源于拟南芥属叶片和香石竹花瓣的完整长度衰老诱导的DHS cDNA克隆的发现和克隆。本文披露了有关核苷酸序列和相应的氨基酸序列。
本发明还部分基于源于番茄、拟南芥属和香石竹的编码衰老诱导的eIF-5A基因的完整长度cDNA克隆的发现和克隆。本文披露了每一种eIF-5A cDNA克隆的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。
本发明提供了一种对植物进行遗传学修饰以便控制衰老开始的方法，所述衰老是与年龄相关的衰老或环境胁迫诱导的衰老。将本发明的衰老诱导的DHS核苷酸序列，其片段或所述片段的组合沿反方向导入植物细胞，以便抑制内源衰老诱导的DHS基因的表达，从而降低内源衰老诱导的DHS蛋白的含量，并降低和/或抑制eIF-5A的活化，并导致介导衰老的基因的表达。
在本发明的另一方面，本发明的衰老诱导的eIF-5A核苷酸序列、其片段或所述片段的组合沿反方向导入植物细胞，以便抑制内源衰老诱导的eIF-5A基因的表达，从而降低内源衰老诱导的eIF-5A蛋白的含量，并降低和/或抑制导致能介导衰老的基因的表达。另外，可以同时使用DHS和eIF-5A序列，以便降低内源DHS和eIF-5A蛋白的含量。
在另一方面，本发明涉及一种对植物进行遗传学修饰以便控制衰老开始的方法，所述衰老是与年龄相关的衰老或环境胁迫诱导的衰老，该方法是这样实现的将组合的本发明的衰老诱导的eIF-5A核苷酸序列和本发明的衰老诱导的DHS核苷酸序列沿反方向导入植物细胞，以便抑制内源衰老诱导的eIF-5A基因和衰老诱导的DHS基因的表达，从而降低内源衰老诱导的DHS蛋白的含量，并降低和/或抑制eIF-5A的活化，并导致能介导衰老的基因的表达。
利用本发明方法生产了转基因植物，并监测其生长、发育，以及自然的或提前诱导的衰老。选择由于衰老诱导的DHS、衰老诱导的eIF-5A或这两者的含量降低而表现出较长的寿命或货架寿命(例如，花的延长的寿命，果实或蔬菜腐烂的减少，增加了的生物物质，提高了的种子产量，减弱了的种子老化和/或减弱了的叶片黄化)的植物或植物的分离部分(例如，结穗、花、蔬菜、果实、种子或叶片)作为具有改善了的特性的理想产品，所述特性包括减弱了的叶片黄化、减弱了的花瓣脱落、在运输和储存期间减弱了的果实和蔬菜的腐烂。繁殖上述优良植物。类似地，选择对环境胁迫具有较高抗性，例如，受低温(冷害)、干旱、感染等的影响较小和/或对病原体具有较高抗性的植物作为优良产物。
在一方面，本发明涉及一种编码衰老诱导的DHS的分离的DNA分子，其中，该DNA分子能与SEQ ID NO1杂交，或者能与SEQ ID NO1杂交的所述分离的DNA分子的功能性衍生物。在本发明这一方面的一种实施方案中，所述分离的DNA分子具有SEQ ID NO1的核苷酸序列，即与SEQ ID NO1具有100％的互补性(序列相同性)。
本发明还涉及一种编码衰老诱导的DHS的分离的DNA分子，其中，该DNA分子能与SEQ ID NO9杂交，或者能与SEQ ID NO9杂交的所述分离的DNA分子的功能性衍生物。在本发明这一方面的一种实施方案中，所述分离的DNA分子具有SEQ ID NO9的核苷酸序列，即与SEQID NO9具有100％的互补性(序列相同性)。
本发明还涉及一种编码衰老诱导的eIF-5A的分离的DNA分子，其中，该DNA分子能与SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15杂交，或能与SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15杂交的所述分离的DNA分子的功能性衍生物。在本发明这一方面的一种实施方案中，所述分离的DNA分子具有SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15的核苷酸序列，即与SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15具有100％的互补性(序列相同性)。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种由上述DNA分子所编码的分离的蛋白，或其功能性衍生物。一种优选的蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者是它的功能性衍生物。另一种优选的蛋白具有SEQID NO10的氨基酸序列，或者是它的功能性衍生物。本发明的其他优选的蛋白具有SEQ ID NO12、SEQ ID NO14或SEQ ID NO16的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码RNA分子的反义寡核苷酸或多核苷酸，它互补于上文所述DNA分子的RNA转录物的相应部分，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸能与所述RNA转录物杂交，以便改变内源衰老诱导的DHS的表达。在本发明这一方面的另一种实施方案中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸是能与上文所述DNA分子的RNA转录物的相应部分杂交的RNA分子，以便改变内源衰老诱导的eIF-5A的表达。所述反义寡核苷酸或多核苷酸可以是完整长度的，或者优选具有大约6-大约100个核苷酸。
所述反义寡核苷酸或多核苷酸可以大体上互补于编码衰老诱导的DHS的DNA分子的一股链的相应部分，其中，编码衰老诱导的DHS的DNA分子能与SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9或其组合杂交，或者基本上互补于由编码衰老诱导的DHS的DNA分子所编码的RNA序列的至少一个相应部分。在本发明的一种实施方案中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸基本上互补于核苷酸SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9的一股链的相应部分或其组合杂交，或由SEQ ID NO1、SEQ ID NO5或SEQ ID NO9或其组合转录的RNA转录物。在另一种实施方案中，所述反义寡核苷酸基本上互补于编码衰老诱导的DHS的DNA分子的一股链的5’非编码部分或3’部分的相应部分，其中，所述DNA分子能与SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9或其组合杂交。
另外，所述反义寡核苷酸或多核苷酸可以基本上互补于编码衰老诱导的eIF-5A的DNA分子的一股链的相应部分，其中，编码衰老诱导的eIF-5A的DNA分子能与SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或其任意组合杂交，或者基本上互补于由SEQ ID NO11、SEQ IDNO13或SEQ ID NO15转录的RNA序列的至少一个相应部分。在本发明的一种实施方案中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸基本上互补于核苷酸SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或其组合的一股链的相应部分，或者所编码的RNA转录物基本上互补于由编码衰老诱导的eIF-5A的DNA分子所编码的RNA序列的相应部分。在另一种实施方案中，所述反义寡核苷酸基本上互补于编码衰老诱导的eIF-5A的DNA分子的一股链的5’非编码或3’非编码区的相应部分，其中，所述DNA能与SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或其组合杂交。
本发明还涉及一种用于转化植物细胞的载体，包括(a)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它基本上互补于(1)编码衰老诱导的DHS的DNA分子的一股链的相应部分，其中，所述编码衰老诱导的eIF-5A的DNA分子能与SEQ ID NO1、SEQ ID NO5或SEQ IDNO9杂交，或(2)由编码衰老诱导的DHS的DNA分子所编码的RNA序列的相应部分；和(b)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列，以便所述反义寡核苷酸或多核苷酸能在用它转化过的植物细胞中表达。
本发明还涉及用于转化植物细胞的载体，包括(a)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它基本上互补于(1)编码衰老诱导的eIF-5A的DNA分子的一股链的相应部分，其中，所述编码衰老诱导的eIF-5A的DNA分子能与SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO15杂交，(2)由编码衰老诱导的eIF-5A的DNA分子所编码的RNA序列的相应部分；和(b)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列，以便所述反义寡核苷酸或多核苷酸能在用它转化过的植物细胞中表达。
所述调控序列包括能在转化过的植物细胞中起作用的启动子，该启动子可以是诱导型的或组成型的，所述调控序列可选择性地包括一个聚腺苷酸化信号。
本发明还提供了一种用上文所述载体或所述载体的组合转化过的植物细胞、由所述细胞所产生的小植株或成熟植株，或所述小植株或植株的植物部分。
本发明还涉及一种生产与未修饰过的植物相比具有较低含量的衰老诱导的DHS、衰老诱导的eIF-5A或这两者的方法，包括(1)用上述载体或载体的组合转化植物；(2)让所述植物至少生长到小植株阶段；
(3)评估转化过的植株或小植株的改变了的衰老诱导的DHS活性和/或eIF-5A活性，和/或改变了的衰老和/或改变了的环境胁迫诱导的衰老和/或改变了的病原体诱导的衰老和/或乙烯诱导的衰老；和(4)筛选并生长与未转化过的植物相比具有改变了的衰老诱导的DHS活性和/或减少了的eIF-5A和/或改变了的衰老和/或改变了的环境胁迫诱导的衰老和/或改变了的病原体诱导的衰老和/或乙烯诱导的衰老的植株。
按上述方法的植株或后代、杂交种、克隆或植物部分优选具有降低了的衰老诱导的DHS表达，降低了的衰老诱导的eIF-5A活性，或同时具备这两者，以及推迟了的衰老和/或推迟了的胁迫诱导的衰老和/或病原体诱导的衰老和/或乙烯诱导的衰老。
本发明还涉及一种抑制植物细胞中内源衰老诱导的DHS表达的方法，该方法包括(1)将一种载体整合到植物基因组中，该载体包括(A)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它基本上互补于(i)编码内源衰老诱导的DHS的DNA分子的一股链的至少一部分，其中，所述编码内源衰老诱导的DHS的DNA分子能与SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO9杂交，或(ii)由内源衰老诱导的DHS基因所编码的RNA序列的至少一部分；和(B)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列，以便表达所述反义寡核苷酸或多核苷酸；和(2)生长所述植物，以便所述反义寡核苷酸或多核苷酸被转录并且转录物结合在所述内源RNA上，从而抑制所述衰老诱导的DHS基因的表达。
本发明还涉及一种抑制植物细胞中内源衰老诱导的eIF-5A表达的方法，该方法包括(1)将一种载体整合到植物基因组中，该载体包括(A)一种反义寡核苷酸或多核苷酸，它互补于(i)编码内源衰老诱导的eIF-5A的DNA分子的一股链的相应部分，其中，所述编码内源衰老诱导的eIF-5A的DNA分子能与SEQ ID NO11、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17或其组合杂交，或(ii)由所述内源衰老诱导的eIF-5A基因所编码的RNA序列的至少一部分；和
(B)可操作地连接于所述反义寡核苷酸或多核苷酸上的调控序列，以便表达所述反义寡核苷酸或多核苷酸；和(2)生长所述植物，以便所述反义寡核苷酸或多核苷酸被转录并且转录物结合在所述内源RNA上，从而抑制所述衰老诱导的eIF-5A基因的表达。
附图简述
图1表示从番茄叶片cDNA文库获得的衰老诱导的番茄叶片DHScDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO1)以及衍生的氨基酸序列(SEQID NO2)。
图2A表示通过将番茄DHS序列与拟南芥属基因库中的未鉴定的基因组序列进行排比所获得的拟南芥属DHS基因的核苷酸序列(http//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/)(SEQ ID NO5)。氨基酸序列之间的缺口是推测的内含子。图2B表示衍生的拟南芥属DHS氨基酸序列(SEQ ID NO6)。图2C表示通过PCR获得的600个碱基对的衰老诱导的拟南芥属DHS cDNA的核苷酸序列。图2D表示该衰老诱导的拟南芥属DHS cDNA衍生的氨基酸序列。
图3是衍生的完整长度番茄叶片衰老诱导的DHS氨基酸序列(SEQID NO2)和衍生的完整长度拟南芥属衰老诱导的DHS氨基酸序列与人、酵母、真菌和古细菌的DHS蛋白序列的排比。在三种序列或四种中相同的氨基酸用方框标出。
图4是番茄DHS cDNA的限制图。
图5是从番茄叶片中分离的并且用32P-dCTP标记的完整长度番茄衰老诱导的DHS cDNA检测的基因组DNA的Southern印迹。
图6是从不同发育阶段的番茄花中分离的RNA的Northern印迹。图6A是总RNA的溴化乙锭染色的凝胶。每一个泳道含有10微克RNA。图6B是用32P-dCTP标记的完整长度番茄衰老诱导的DHS cDNA检测的Northern印迹的放射性自显影。
图7是从各个成熟阶段的番茄果实中分离的用32P-dCTP标记的完整长度番茄衰老诱导的DHS cDNA检测的RNA的Northern印迹，每一个泳道含有10微克RNA。
图8是从通过用2M山梨醇处理6小时而受到干旱胁迫的番茄叶片中分离的RNA的Northern印迹。用32P-dCTP标记的完整长度番茄衰老诱导的DHS cDNA检测该印迹。
图9是从受到过冷害温度的番茄叶片中分离的RNA的Northern印迹。图9A是总RNA的溴化乙锭染色的凝胶。每一个泳道含有10微克RNA。图9B是用32P-dCTP标记的完整长度番茄衰老诱导的DHS cDNA检测的Northern印迹的放射性自显影。图9C表示相应的渗漏数据，是作为叶片扩散物的导电性测定的。
图10是香石竹DHS完整长度(1384bp)cDNA克隆核苷酸序列(SEQID NO9)，不包括聚腺苷酸尾巴和5’末端非编码区。衍生的氨基酸序列在核苷酸序列下面示出(373个氨基酸)(SEQ ID NO10)。
图11是来自衰老的拟南芥属叶片并用32P-dCTP标记的完整长度番茄衰老诱导的DHS cDNA检测的总RNA的Northern印迹。放射性自显影在上面，溴化乙锭染色的凝胶在下面。
图12是从各个时期的香石竹花瓣中分离的总RNA的Northern印迹。印迹是用32P-dCTP标记的完整长度番茄衰老诱导的DHS cDNA检测的。放射性自显影在上面，溴化乙锭染色的凝胶在下面。
图13是番茄果实衰老诱导的eIF-5A基因的核苷酸序列(顶部)(SEQID NO11)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO12)。
图14是香石竹衰老诱导的eIF-5A基因的核苷酸序列(顶部)(SEQID NO13)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO14)。
图15是拟南芥属衰老诱导的eIF-5A基因的核苷酸序列(顶部)(SEQID NO15)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO16)。
图16是从各个发育阶段的拟南芥属植物叶片中分离的总RNA的Northern印迹。用32P-dCTP标记的完整长度拟南芥属衰老诱导的DHScDNA和完整长度衰老诱导的eIF-5A检测该印迹。放射性自显影在上面，溴化乙锭染色的凝胶在下面。
图17是从处在发育的生硬(BK)、红-硬(RF)和红-软(RS)阶段的番茄果实中分离的总RNA的Northern印迹。用32P-dCTP标记的完整长度衰老诱导的DHS cDNA和完整长度衰老诱导的eIF-5A检测该印迹。与果实成熟吻合，在红-软果实中DHS和eIF-5A同时上调。放射性自显影在上部，溴化乙锭染色的凝胶在下部。
图18是从用山梨醇处理过的以便诱导干旱胁迫的番茄叶片中分离的总RNA的Northern印迹。C是对照，S是山梨醇处理。用32P-dCTP标记的完整长度衰老诱导的DHS cDNA和完整长度衰老诱导的eIF-5A检测该印迹。随着干旱胁迫，eIF-5A和DHS都被上调。放射性自显影在上部，溴化乙锭染色的凝胶在下部。
图19是从用番茄植物的花芽和开放的衰老的花中分离的总RNA的Northern印迹。用32P-dCTP标记的完整长度衰老诱导的DHS cDNA和完整长度衰老诱导的eIF-5A检测该印迹。在开放的/衰老的花中eIF-5A和DHS都被上调。放射性自显影在上部，溴化乙锭染色的凝胶在下部。
图20是从用冷害损伤的番茄叶片中分离的总RNA的Northern印迹。用32P-dCTP标记的完整长度衰老诱导的DHS cDNA和完整长度衰老诱导的eIF-5A检测该印迹。在回温期间随着冷害损伤的发展eIF-5A和DHS都被上调。放射性自显影在上部，溴化乙锭染色的凝胶在下部。
图21是3.1周龄拟南芥属野生型(左)和表达沿反义方向的衰老DHS基因的3’末端(如图36所述的序列)的转基因植物的照片，在转基因植物上表现出叶片大小的增加。
图22是4.6周龄拟南芥属野生型(左)和表达沿反义方向的衰老DHS基因的3’末端(如图36所述的序列)的转基因植物的照片，在转基因植物上表现出叶片大小的增加。
图23是5.6周龄拟南芥属野生型(左)和表达沿反义方向的衰老DHS基因的3’末端(如图36所述的序列)的转基因植物的照片，在转基因植物上表现出叶片大小的增加。
图24是6.1周龄拟南芥属野生型(左)和表达沿反义方向的衰老DHS基因的3’末端(如图36所述的序列)的转基因植物的照片，在转基因植株上表现出大小的增加。
图25是表示能表达沿反义方向衰老诱导的DHS基因的三个转基因拟南芥属植物品系组织产量提高的曲线图。种子产量以种子体积形式表示。给出了野生型植物的n＝30的SE。
图26是能表达沿反义方向的衰老DHS基因的3’末端(图36所示序列)的转基因番茄植物(左)和野生型植物(右)的照片，表示转基因植物叶片大小的增加和植株大小的增加。该照片是在将小植株移栽到土壤中18天之后拍摄的。
图27是能表达沿反义方向的衰老DHS基因的3’末端(图36所示序列)的转基因番茄植物(左)和野生型植物(右)的照片，表示转基因植物叶片大小的增加和植株大小的增加。该照片是在将小植株移栽到土壤中32天之后拍摄的。
图28-35是来自野生型的番茄果实(顶部照片)和能表达沿反义方向的完整长度衰老DHS基因的转基因植物的番茄果实(底部照片)的照片。果实是在发育的生硬阶段收获的，并在生长箱中熟化。收获后的天数在每一幅照片的左上角示出。
图36是用于沿反义方向转化植物的拟南芥属衰老诱导的DHS基因的3’末端的核苷酸序列(顶部)(SEQ ID NO30)和衍生的氨基酸序列(底部)。
图37是用于沿反义方向转化植物的番茄衰老诱导的DHS基因的3’末端的核苷酸序列(顶部)(SEQ ID NO31)和衍生的氨基酸序列(底部)。
图38是用于分离完整长度拟南芥属基因的600bp拟南芥属衰老诱导的DHS探针的核苷酸序列(顶部)(SEQ ID NO26)和衍生的氨基酸序列(底部)。
图39是用于分离完整长度香石竹基因的483bp香石竹衰老诱导的DHS探针的核苷酸序列(顶部)(SEQ ID NO27)和衍生的氨基酸序列(底部)。
发明详述提供了用于改变植物细胞中衰老诱导的DHS基因、衰老诱导的eIF-5A基因或这两种基因的表达的方法和组合物。植物中衰老诱导的DHS和衰老诱导的eIF-5A表达的单独的或组合的改变会导致衰老开始的推迟，并改善对环境胁迫和病原体的抗性，因此延长了该植物的货架寿命和/或生长期。
业已通过逆转录酶介导的聚合酶链式反应(RT-PCR)分离了具有衰老诱导的表达的编码番茄DHS基因的完整长度cDNA序列，用从冷害损伤的番茄叶片中分离的RNA作模板，并用RT-PCR产物筛选冷害损伤的、山梨醇处理过的番茄叶片cDNA文库。利用相当于分离的番茄叶片cDNA序列的特定部分以及完整长度番茄叶片cDNA的多核苷酸探针确定编码DHS基因的mRNA在环境胁迫的(冷害)番茄叶片、(脱水的)山梨醇处理过的番茄叶片、成熟的番茄果实和衰老的番茄花中的存在。
将由拟南芥属DHS基因组克隆设计的引物用于制备聚合酶链式反应(PCR)产物，使用衰老的拟南芥属叶片cDNA文库作模板。拟南芥属核苷酸序列和氨基酸序列分别与衰老诱导的番茄DHS的相应序列具有73％的相同性和81％的相同性。
本发明的衰老诱导的番茄DHS基因是通过RT-PCR分离的。用于分离番茄DHS基因的上游引物是24个核苷酸的引物5’AG TCT AGA AGGTGC TCG TCC TGA T3’(SEQ ID NO3)；下游引物含有34个核苷酸5’G ACT GCA GTC GAC ATC GAT(T)153’(SEQ ID NO4)。使用100皮摩尔的下游引物通过标准RT-PCR分离cDNA的第一股链。然后将这第一股链用作RT-PCR的模板，使用上游和下游引物。在琼脂糖凝胶上分离RT-PCR产物发现了大小在1.5kb至600bp范围内的三条不同带的存在。使用分别存在于上游和下游引物上的XbaI和SalI克隆位点将这三种片段亚克隆到质粒载体pBluescriptTM(Stratagene克隆系统，LaJolla，CA)上，并进行测序。比较所述片段的序列并与GeneBank数据库中的序列进行排比。结果证实1.5kb和1kb的片段是番茄DHS序列。600bp的片段还与人、酵母和链孢霉属DHS序列排比。
将600bp的RT-PCR片段用于筛选番茄(品种Match F1杂种)cDNA文库，该文库是用2M山梨醇处理了6小时以便诱导脱水的番茄叶片中获得的RNA制备的。所述cDNA文库是用λZapTM(Stratagene克隆系统，LaJolla，CA)cDNA文库试剂盒构建的。获得了三种相同的相应于衰老诱导的DHS基因的阳性完整长度cDNA克隆，并进行测序。衰老诱导的DHS cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。所述cDNA克隆编码具有381个氨基酸的多肽(SEQ ID NO2)，其分子量为42.1.
根据所述基因在发育中的和受到胁迫的番茄花、果实和叶片中的表达形式，它与衰老相关。
将番茄DHS cDNA序列拟南芥基因组文库(http//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/)中的未鉴定的基因组序列进行排比。该结果表示了与一种未鉴定的拟南芥属基因组序列(AB107060)的排比。利用该排比信息鉴定拟南芥属序列上的开放读框，并由此产生推测的氨基酸序列。所得到的排比拟南芥属DHS基因的核苷酸序列和氨基酸序列分别被称为SEQ ID NO5(图2A)和SEQ ID NO6。
制备了基于鉴定的拟南芥属DHS序列的短区域的两种引物引物1，5’GGTGGTGTTGAGGAAGATC3’(SEQ ID NO7)；和引物2，5’GGTGCACGCCCTGATGAAGC3’(SEQ ID NO8)。在标准PCR用拟南芥属衰老叶片cDNA文库作以上两种引物的模板。分离600bp的PCR产物并测序，并证实它具有与基因组DHS序列的相应片段相同的序列。
同样将完整长度衰老诱导的DHS cDNA克隆用于分离完整长度衰老诱导的拟南芥属和香石竹DHS cDNA克隆。所述拟南芥属和香石竹DHScDNA克隆是通过用完整长度番茄DHS cDNA克隆作探针分别筛选衰老拟南芥属叶片cDNA文库和衰老的香石竹花瓣cDNA文库分离的。然后对从cDNA文库获得的cDNA克隆进行测序。以这种方式分离的拟南芥属完整长度cDNA克隆的核苷酸序列与通过与番茄cDNA序列排比确定为编码拟南芥属DHS的拟南芥属基因组序列的编码区相同(图2A，SEQID NO5)。完整长度香石竹花瓣筛选衰老的DHS克隆核苷酸序列和衍生的氨基酸序列在图10中示出(分别为SEQ ID NO9和SEQ ID NO10)。
因此，本发明的源于番茄、香石竹和拟南芥属的编码DHS的cDNA序列能以相似的方式用作探针从其他植物中分离DHS基因，然后利用这些基因改变转基因植物的衰老。
衰老诱导的DHS基因似乎是DHS家族的一员。利用从杂交植物中提取的基因DNA进行番茄叶片DNA的基因组Southern印迹分析。所述DNA用各种限制酶进行裂解，所述酶能识别DHS基因的编码区内的单一位点，或者不能识别DHS基因的开放读框内的任何位点。番茄DHS限制图如图4所示。
用32P-dCTP标记过的完整长度番茄DHS cDNA检测限制酶消化过的番茄叶片基因组DNA。在高严格条件下进行的杂交发现了所述完整长度cDNA探针与每一种限制酶消化过的DNA样品的2-3种限制片段的杂交。特别要指出的是，当番茄叶片基因组DNA是用XbaI和EcoRI消化的时候，这两种酶在DHS的开放读框内有限制位点(图4)，在Southern印迹中可以检测到两种以上的限制片段(图5)。来自杂交品种Match F1和纯合品系UCT5的基因组DNA能产生相同形式的限制片段。上述结果表明，在番茄植物中存在两种或两种以上DHS基因的同种型。如图3所示，DHS基因在物种之间是高度保守的，因此可以预料在任何物种内的同种型之间存在明显的保守性。
用完整长度番茄cDNA检测的番茄花总RNA的Northern印迹表明，在番茄花中衰老诱导的DHS基因的表达被明显诱导，但在芽中的表达勉强可以检测到(图6)。
在番茄果实各个发育阶段的DHS表达的Northern印迹分析证实，在生硬的和粉红色的果实中DHS基因以低水平表达，而DHS表达在红色(熟的)番茄果实中明显增强(图7)。
Northern印迹分析还证实，衰老诱导的DHS基因是通过环境胁迫条件诱导的，例如，脱水(图8)和冷害(图9)。与未处理过的叶片相比，用2M山梨醇进行过处理以便诱导脱水的番茄叶片表现出在脱水叶片中DHS表达的诱导(图8)。接触过冷害温度并回温到环境温度的植物表现出与冷害损伤症状(例如，渗漏)的发展吻合的衰老诱导的DHS基因的诱导表达(图9)。在番茄植物和各种植物组织，例如，叶片、果实和花中基因表达的总体形式表明，本发明的DHS基因与这些植物和植物组织的衰老的开始相关。
就DHS基因表达的诱导而言，在拟南芥属叶片衰老和香石竹花瓣衰老的开始方面观察到了相似结果。从各种年龄的植物中分离的拟南芥属叶片总RNA的Northern印迹分析表明，衰老诱导的DHS基因的表达在幼苗期不明显(5周龄植物)，但在大约6周时开始出现。到第7周时，DHS基因的表达被明显诱导。Northern印迹分析表明，拟南芥属DHS基因随着植物的年龄明显增强(图11)。
Northern印迹分析还表明，DHS基因在诸如香石竹的显花植物中是以类似方式调控是的(图12)。从各种年龄的香石竹花瓣中分离的总RNA的Northern印迹分析证实，香石竹DHS的表达在来自具有年龄诱导的衰老症状的花的花瓣中被明显诱导，如花瓣卷曲，它是衰老的最初形态学证据，但在紧凑的花芽中的表达更低一些。来自将要开放的香石竹花的花瓣中DHS的表达明显高于在紧凑花芽阶段花中的表达，而完全开放的花的花瓣也表现出DHS的增强了的表达。
因此，预计通过明显抑制或改变衰老诱导的DHS基因在植物组织中的表达，可以推迟腐烂和变质，延长易坏果实、花卉和蔬菜的货架寿命，并使得植物及其组织更能耐受胁迫和更抗病原体。这一目的可以通过生产转基因植物而实现，其中，DHS cDNA或其寡核苷酸片段能以反义构型在果实、花、叶片和营养组织中表达，优选使用诸如CaMV35S启动子的组成型启动子，或使用组织专一性或衰老/胁迫诱导型启动子。
在本发明中还分离并测序了另一种基因eIF-5A，它参与诱导与植物形态改变相关的衰老，与DHS一样，可将其用于改变植物的衰老和与衰老相关的过程，优选沿反义方向导入植物。分别从成熟的番茄果实，衰老的拟南芥属叶片和衰老的香石竹花cDNA文库中分离完整长度衰老诱导的eIF-5A cDNA克隆。每一种完整长度克隆的核苷酸序列和推测的氨基酸序列示于图13(番茄衰老诱导的eIF-5A)、14(香石竹衰老诱导的eIF-5A)和15(拟南芥属衰老诱导的eIF-5A)。上述每一种cDNA的核苷酸序列还表现为SEQ ID NO11(番茄)(图13)、SEQ ID NO13(香石竹)(图14)和SEQ ID NO15(拟南芥属)(图15)。所述每一种基因的衍生的氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO12(图13)SEQ IDNO14(图14)和SEQ ID NO16(图15)。
与本文所披露的DHS基因序列一样，本发明的eIF-5A序列可用于从其他植物中分离eIF-5A基因。所分离的eIF-5A序列可用于改变植物的衰老和与衰老相关的过程。从植物中分离eIF-5A序列可以用已知方法根据物种之间至少大约70％的序列相似性完成。
在衰老期间，在植物中会同时发生eIF-5A和DHS的诱导。Northern印迹分析表明，在自然和胁迫诱导的衰老开始时，eIF-5A与DHS被同时上调(图16-20)。例如，从各种年龄的拟南芥属植物的叶片中分离的总RNA的Northern印迹分析表明，从植物上出现叶片衰老开始，eIF-5A的表达就被诱导，并且表达随着衰老的发展明显加强。在诸如番茄的结实植物中，在红色-软果实中eIF-5A和DHS被同时上调，与果实变软和腐烂一致(图17)。
Northern印迹分析还表明，在受到诸如干旱(图18)和冷害损伤(图20)的环境胁迫的植物中eIF-5A和DHS被同时上调。类似的，在显花植物中，在开放的花中eIF-5A和DHS被同时上调，并且两种基因的表达在随后的阶段持续增强。
在沿反方向(反义)导入受组成型启动子控制，如玄参花叶病毒35S启动子、花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S、双35S启动子或MAS启动子控制的克隆的衰老诱导的DHS基因、其片段或克隆的衰老诱导的eIF-5A基因或其片段、或eIF-5A和DHS序列的组合时，可用于对植物进行遗传学修饰，并改变修饰过的植物的衰老。来自其他植物的与番茄、拟南芥属或香石竹衰老诱导的DHS基因或衰老诱导的eIF-5A基因具有足够的序列相同性的特定反义序列可用于实现类似的遗传修饰。遗传学修饰的一个结果是，内源可翻译衰老诱导的DHS编码mRNA、eIF-5A编码mRNA或这两者的含量的降低。因此，降低了植物细胞中所产生的衰老诱导的DHS和衰老诱导的eIF-5A的量，从而降低了活化eIF-5A的量，后者又降低了衰老诱导蛋白的翻译，包括衰老诱导的脂酶，衰老诱导的蛋白酶和衰老诱导的核酸酶。由此抑制或推迟了衰老，因为衰老的开始需要从头开始的蛋白合成。
例如，用能沿反义方向表达完整长度拟南芥属衰老诱导的DHS基因(SEQ ID NO26)或3’部分(图38)，受双35S启动子调控的载体转化过的拟南芥属植物与对照植物相比表现出较高的生物量，例如，较大的叶片体积和在生长的所有阶段的总体上较大的植物生长，以及推迟了的叶片衰老，如图21-24所示。
由于在转基因拟南芥属植物中沿反义方向表达完整长度的拟南芥属衰老诱导的DHS基因或其3’编码区所引起的衰老诱导的DHS基因的减弱了的表达的结果还被视为转化过的植物的种子产量的增加。能表达拟南芥属衰老诱导的DHS基因的反义3’非编码区的拟南芥属植物品系所产生的种子比野生型种子多6倍(图25)。
用受双35S启动子调控的沿反义方向的番茄衰老诱导的DHS基因(SEQ ID NO27)的3’末端转化过的番茄植物获得了类似结果。与对照(未转化过的)番茄植物相比，用反义方向的该基因的3’末端转化过的植物表现出增加了的叶片大小和增加了的植株大小(图26和27)。
与野生型植物相比，用反义方向的完整长度番茄衰老诱导的DHS转化的番茄植物所产生的果实表现出推迟了的变软和腐烂(图28-35)。因此，本发明的方法和序列可用于推迟果实变软和腐烂，以及用于从总体上增加植物的生物量和种子产量，推迟植物衰老。本发明的分离的核苷酸序列可用于从其他植物或生物中分离基本上互补的DHS和/或eIF-5A核苷酸序列。上述序列反过来又可用于转化植物，并因此改变转化过的植物的衰老。与使用本文所述分离的核苷酸序列的使用方法相同。
通过用DHS、eIF-5A、其片段或其组合转化所实现的遗传学修饰可以实现在植物中衰老诱导的DHS、eIF-5A或这两者的含量的永久性改变，并可以通过自交或其他繁殖方法在后代植物中繁殖。将遗传学改变过的植物用于产生新的植物品种或品系，其中，所述改变在世代之间被稳定传递。本发明首次提供了合适的DNA序列，该序列可用于实现对多种不同植物的衰老进行稳定的遗传学修饰。
一般，为了鉴定并分离基因，使用本领域所公知的常规方法进行质粒DNA的制备、限制酶消化、DNA的琼脂糖凝胶电泳、蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳、PCR、RT-PCR、Southern印迹、Northern印迹、DNA连接和细菌转化。例如，参见Sambrook，J.等，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989，Sambrook披露了核酸杂交技术(同上)。
在本文中，术语“植物”是指全植株、植物部分、植物细胞或一组植物细胞。可用于本发明方法中的植物的类型不受限制，并且可以包括，例如，乙烯敏感型和乙烯不敏感型植物；结实植物，如杏、苹果、橙、香蕉、葡萄、梨、番茄、草莓、腭梨等；蔬菜，如胡萝卜、豌豆、莴苣、甘蓝、萝卜、马铃薯、花茎甘蓝、芦笋等；花卉，如香石竹、玫瑰、梅等；农业作用和森林植物，如玉米、水稻、大豆、和苜蓿等；并且总体上包括能摄取并表达本发明DNA分子的任何植物。它可以包括多种倍性水平的植物，包括半倍体、二倍体、四倍体和多倍体。所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物。
转基因植物在本文中被定义为通过某种方式进行过遗传学修饰的植物，包括，但不限于在其基因组中整合了异源或同源衰老诱导的DHSDNA或修饰过的DNA或异源衰老诱导的DHS DNA或同源衰老诱导的DHS DNA的某些部分植物。另外，本发明的转基因植物可以在其基因组中整合了异源或同源衰老诱导的eIF-5A DNA或修饰过的DNA或异源衰老诱导的eIF-5A DNA或同源衰老诱导的eIF-5A DNA的某些部分。本发明的转基因植物可以在其基因组中整合了异源或同源衰老诱导的DHS和eIF-5A DNA或修饰过的DNA或异源衰老诱导的eIF-5A DNA或同源衰老诱导的DHS DNA的某些部分或异源和同源DHS和eIF-5A序列的组合。改变了的遗传材料可以编码一种蛋白，包括一种调控或控制序列，或者可以是或包括一种反义序列或编码一种反义RNA，该RNA是与该植物的内源衰老诱导的DNA或eIF-5A DNA或mRNA序列或其部分反义的。“转基因”或“转基因序列”被定义为业已整合到转基因植物中的外源基因或部分序列。
本文所使用的术语“杂交”一般被用于表示在适当严格的条件下核酸的杂交，本领域技术人员可以根据探针序列和靶序列的性质方便地确定所述合适条件。杂交和洗涤条件为本领域所熟知，根据所需要的严格度而进行的条件的调整可以通过改变培养时间、温度和/或溶液的离子强度而方便地实现。例如，参见Sambrook J.等，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989。条件的选择是由被杂交的序列长度，特别是探针序列的长度，核酸的相对G-C含量和允许的错配量决定的。当需要在具有较低程度的互补性的链之间进行部分杂交时，优选低严格条件。当需要完全或接近完全的互补性时，优选高严格条件。对于典型的高严格条件来说，杂交溶液含有6×SSC、0.01M EDTA、1×denhardt’s溶液和0.5％SDS。对于克隆DNA片段来说，杂交是在大约68℃下进行大约3-4小时，而对于总真核DNA来说，进行大约12-16小时。对于较低的严格条件来说，杂交温度被降低到大约42℃，低于双链体的解链温度(Tm)。已知Tm受G-C含量和双链体长度以及溶液的离子强度的影响。
在本文中，术语“明显的序列相同性”或“明显的同源性”被用于表示与另一种核苷酸或氨基酸序列有明显的结构或功能相同性的核苷酸序列或氨基酸序列。具有明显的序列相同性或结构同源性的序列之间的任何结构或功能的差异都不微不足道的；就是说这些差异不会影响该序列在所需要的用途中发挥预期作用的能力。例如，这些差异可能是由于在不同物种之间密码子利用方面所固有的差异所导致。如果在两种或两种以上不同序列之间存在大量的序列重叠或相似性，或者如果不同的序列具有相似的物理特征，即使这些序列在长度或结构上不同，其结构差异也被视为微不足道。例如，所述特征包括在特定条件下杂交的能力，或者对于蛋白来说，免疫交叉反应性、类似的酶促活性等。上述每一种特征可以由本领域技术人员通过本领域所公知的方法方便地加以确定。
另外，如果两个核苷酸序列之间的序列相似性至少为大约70％，更优选80％，最优选大约90％的话，这两种核苷酸序列就是“基本上互补的”。如果两种多肽活性之间的相似性至少为50％，优选70％的话，这认为这两种氨基酸基本是同源的。
在本文中，短语与DNA或RNA分子的相应部分杂交表示杂交的分子，例如寡核苷酸、多核苷酸、或任何核苷酸序列(有义或反义方向)能识别并与另一种核酸分子上的序列杂交，它们具有大体上相同的大小，并具有足够的序列相似性，以便实现在合适条件下的杂交。例如，源于番茄DHS的3’编码或非编码区的100个核苷酸长度的反义分子能够识别并与分别来自香石竹DHS基因或任何其他植物DHS基因的3’编码或非编码区的核苷酸序列的大约100个核苷酸的部分杂交，只要在这两种序列之间具有大约70％或更高的序列相似性。可以理解的是，“相应部分”的大小允许在杂交中有某些错配，因此，所述“相应部分”可以比要杂交的分子小或大，例如，大或小20-30％，优选大或小不超过大约12-15％。
术语核酸(或多核苷酸或寡核苷酸)的“功能性衍生物”在本文中被用于表示编码衰老诱导的DHS或衰老诱导的eIF-5A的基因或核苷酸序列的片段、变体、同系物、或类似物。功能性衍生物可能至少保留了衰老诱导的DHS或eIF-5A编码DNA的一部分功能，这使得它能用于本发明中。所述功能可以包括在低严格条件下与天然番茄、拟南芥属或香石竹衰老诱导的DHS或eIF-5A或源于其他植物的编码衰老诱导的DHS或eIF-5A的基本上同源的DNA或与其mRNA转录物杂交的能力，或在反义方向上抑制植物衰老诱导的DHS或eIF-5A mRNA转录和/或翻译的能力等。
基因或DNA序列的“片段”是指任何分子的亚类，例如更短的多核苷酸或寡核苷酸。“变体”是指基本上类似于完整基因或其片段的分子，如具有一个或多个取代的核苷酸的核苷酸取代变体，不过它保留了与特定基因杂交的能力或编码与能天然DNA杂交的mRNA转录物的能力。“同系物”是指来自不同植物属或种的片段或变体序列。“类似物”是指基本上类似于完整分子、其变体或片段或以与之相关的方式起作用的非天然分子。
一种基因，例如，衰老诱导的DHS基因或衰老诱导的eIF-5A基因的“改变了的表达”或“修饰过的表达”是指以某种方式改变了所述基因的正常表达，例如，在未修饰过的结实、开花或其他植物中的表达的任何过程或结果。在本文中，基本表达的改变是衰老诱导的DHS基因或衰老诱导的eIF-5A基因或这两者表达的完全或部分减弱，但还可以包括表达时序的改变，或其他状态，其中，衰老诱导的DHS基因或衰老诱导的eIF-5A基因或这两者的表达不同于在未修饰过的植物或栽培种中天然发生的表达。优选的改变是这样的，与在未修饰过的植物中的产量相比，这种改变会导致衰老诱导的DHS产量、衰老诱导的eIF-5A产量或这两者的降低。
在生产本发明的进行过遗传学改变的植物时，优选根据所需形状、总体上减弱了的衰老诱导的DHS表达或产量或减弱了的衰老诱导的eIF-5A表达或这两者选择单个的小植株或植株。例如，衰老诱导的DHS和衰老诱导的eIF-5A的表达可以通过观察在转基因植物上衰老的推迟或减弱来确定。还可以用已知测定方法定量相对对照(正常的非转基因)植物而言，转基因植物中DHS和/或eIF-5A的活性。
为了让新插入的基因或DNA序列表达，导致它所编码的蛋白的产生，或者对于要转录的反义DNA来说，导致反义RNA分子的产生，相对所述基因或DNA序列而言，应当在正确的位置上存在正确方向的正确的调控因子。所述调控区可以包括一个启动子、一个5’-非翻译前导序列和一个3’-聚腺苷酸化信号，以及增强子和其他调控序列。可用于与衰老诱导的DHS基因组合使用以便制备该基因的有义或反义转录物的启动子调控因子包括常见的任何植物启动子，更具体地讲，包括组成型启动子，如玄参花叶病毒35S启动子，花椰菜花叶病毒启动子，CaMV35S启动子，或MAS启动子，或组织专一性或衰老诱导的启动子，如香石竹花瓣GST1启动子或拟南芥属SAG12启动子(例如，参见J.C.Palaqui等，植物生理学，1121447-1456，1996；Morton等，分子育种，1123-132，1995；Fobert等，植物杂志，6567-577，1994；和Gan等，植物生理学，113313，1997，被收作本文参考)。用于本发明的启动子优选是组成型启动子，最优选使用双35S启动子。
用于本发明的启动子的表达水平可以用常规表达系统测定，例如，通过测定报导基因产物的含量，例如，导入了该启动子/报导基因的转基因植物的叶片、花、果实或其他组织的提取物中的蛋白或mRNA。
本发明提供了互补于编码番茄衰老诱导的DHS、香石竹衰老诱导的DHS、拟南芥属衰老诱导DHS的基因或互补于源于其他植物的能与番茄、香石竹或拟南芥属衰老诱导的DHS基因在低至高严格条件下杂交的基因或基因片段的反义寡核苷酸或多核苷酸。本发明提供了互补于编码番茄衰老诱导的eIF-5A、香石竹衰老诱导的eIF-5A、拟南芥属衰老诱导eIF-5A的基因或互补于源于其他植物的能与番茄、香石竹或拟南芥属衰老诱导的eIF-5A基因在低至高严格条件下杂交的基因或基因片段的反义寡核苷酸或多核苷酸。所述反义寡核苷酸的长度至少为大约6个核苷酸，以便提供最低的杂交专一性，并可互补于编码衰老诱导的基因或其部分的一股DNA或mRNA，或互补于与调控衰老诱导的DHS或eIF-5A基因表达相关的基因组DNA上的旁侧序列。所述反义寡核苷酸可以大到100个核苷酸或更大，并可以延伸到和超过反义的完整编码序列的长度。所述反义寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物形式，它是单链的或双链的。
所述反义寡核苷酸的作用可能会导致细胞中衰老诱导的DHS表达、衰老诱导的eIF-5A表达或这两者的改变，主要是抑制。对反义的一般性描述可以参见Alberts等，细胞分子生物学，第2版，Garland出版公司，纽约，1989(特别是195-196页，收作本文参考)。
所述反义寡核苷酸可以互补于衰老诱导的DHS或eIF-5A基因的任何相应部分。在一种实施方案中，所述反义寡核苷酸的长度可以是6-100个核苷酸，并可以互补于例如，衰老诱导的DHS或eIF-5A序列的5’非编码序列或3’末端的序列。已知主要互补于5’非编码序列的反义寡核苷酸是编码转录因子基因表达的有效抑制剂，Branch，M.A.分子细胞生物学，134284-4290，1993。
优选的反义寡核苷酸基本上互补于编码衰老诱导的DHS或衰老诱导的eIF-5A的mRNA的一部分，所述mRNA部分的大小大体上与该反义寡核苷酸相同。例如，将编码衰老诱导的DHS或eIF-5A的完整长度cDNA克隆沿反义方向导入植物，预计会导致衰老诱导的DHS和/或eIF-5A基因表达的成功改变。另外，如图21-35所示，将部分序列定向导入衰老诱导的DHS基因或衰老诱导的eIF-5A基因或这两者的特定部分可能是同样有效的。
本发明所需要的最低程度的同源性是足于产生足够的互补性，以便能识别特定的靶RNA或DNA，并抑制或减弱其翻译或功能而不影响其他RNA或DNA分子的功能以及其他基因的表达。尽管本发明的反义寡核苷酸包括互补于衰老诱导的DHS基因或衰老诱导的eIF-5A基因的RNA转录物的相应部分的序列，但绝对的互补性是没有必要的，不过是优选的。杂交的能力可能取决于反义寡核苷酸的长度和互补程度。一般，杂交的核酸越长，与衰老诱导的DHS靶序列所包含的碱基错配就越多，但仍然能形成稳定的双链体。本领域技术人员可以用标准方法确定错配的允许程度，例如，通过测定杂交复合体的解链温度。
反义RNA寡核苷酸序列可以通过由外源导入的核酸序列转录而在细胞内产生。这种反义分子可以通过用一种载体转化或转染或感染而输送到细胞内，如在它上面整合了编码所述反义衰老诱导的DHS序列的DNA的质粒或病毒。所述DNA可操作地连接于合适的调控因子上，包括启动子。所述外源DNA序列在细胞内表达，产生衰老诱导的DHS基因的反义RNA。
载体优选是质粒，或者可以是本领域已知的病毒或其他载体，以便在植物细胞或细菌细胞中复制并表达它所编码的基因。所述载体被整合到染色体上，以便它能够转录，产生所需要的反义衰老诱导的DHSRNA。所述质粒或病毒载体可以通过本领域的标准重组DNA技术构建，例如，所述载体可以是含有能够在原核宿主中起作用的复制系统和本发明的反义寡核苷酸或多核苷酸的质粒载体。另外，所述载体可以是含有能在农杆菌属中起作用的复制系统和本发明的反义寡核苷酸或多核苷酸的质粒。能够在农杆菌属中起作用的质粒为本领域所公知。参见Miki等，将外源DNA导入植物的方法，植物分子生物学和生物技术方法，B.R.Glick和J.E.Thompson著，CRC出版社，1993，67-83页。
按以下方法将番茄DHS基因沿反义方向克隆到一种质粒载体上。PCD质粒是从pUC18主链构建而成的，并含有源于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，随后是一个多克隆位点和一个章鱼氨酸合成酶终止序列，将该质粒用于克隆番茄DHS基因。通过利用XhoI和SacI限制位点将完整长度番茄DHS基因沿反义方向亚克隆到pCD质粒上构建pCd-DHS(反义)质粒。
长度优选为大约6-100个核苷酸并互补于衰老诱导的DHS或衰老诱导的eIF-5A基因的寡核苷酸可以通过重组核苷酸技术制备或者由单核苷酸或较短的寡核苷酸合成。自动化合成仪可用于本发明寡核苷酸和多核苷酸的化学合成。用于构建本发明重组核苷酸分子的方法披露于Sambrook等的文献中，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，NY，1989，该文献被全文收作本文参考。编码衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶序列的反义RNA的寡核苷酸可以用本领域所熟知的方法制备。有关该方法的细节披露于以下文献中Maniatis，T.等，控制基因表达的分子机制，Nierlich等著，学术出版社，纽约，1976。
在本发明的另一种实施方案中，内源植物衰老诱导的DHS、衰老诱导的eIF-5A或这两者的表达的抑制是通过导入植物细胞的外源衰老诱导的DHS或eIF-5A基因或基因片段或这两者的超量表达的共抑制所导致的。在本发明的该实施方案中，以本文所披露的用于反义分子的相同方法将编码衰老诱导的DHS、衰老诱导的eIF-5A或这两者的载体沿有义方向导入细胞。所述衰老诱导的DHS或衰老诱导的eIF-5A优选可操作地与强的组成型启动子可操作地连接，如玄参花叶病毒启动子或CaMV35S或双35S启动子。
在本发明的另一种实施方案中，内源植物衰老诱导的DHS、衰老诱导的eIF-5A或这两者的表达的抑制是通过使用核酶实现的。核酶是具有序列专一性内切核糖核酸酶活性的RNA分子。一种例子是锤头核酶，它能裂解靶RNA上的UH(其中H是A、C或U残基)识别位点，并含有碱基配对区，它能引导核酶的催化域至底物RNA的靶位点。核酶是高度定向专一性的，并可以设计成使多基因家族的一个成员失活，或针对相关mRNA的保守区(参见Merlo等，植物细胞，101603-1621，1998)。可以通过用诸如质粒或病毒的载体转化、转染或感染将核酶分子输送到细胞中，在所述载体上整合了可操作地与合适的调控因子，包括启动子连接的核酶。所述核酶结构含有碱基配对臂，该臂能将它引导至衰老诱导的DHS mRNA或衰老诱导的eIF-5A mRNA上的裂解位点，导致DHS或eIF-5A mRNA的裂解，并抑制衰老诱导的DHS和/或eIF-5A表达。
按照本发明生产的转基因植物可以通过本领域所公知的任何植物转化方法通过DNA转化而制备。植物转化方法包括用根癌农杆菌与植物、组织或细胞直接共培养或直接感染(Miki等，植物分子生物学和生物技术方法，1993)直接将基因转入原生质体或原生质体吸收(Paszkowski等，EMBO杂志，122717，1984)；电穿孔(Fromm等，自然，319719，1986)；粒子轰击(Klein等，生物技术，6559-563，1988)；注射到幼苗和植物的分生组织中(De LaPena等，自然，325274-276，1987)；注射到培养细胞或组织的原生质体中(Reich等，生物技术，41001-1004，1986)。
一般，完整植株是通过转化方法获得的。植株是从原生质体、愈伤组织、组织部分或外殖体等再生的。本文所使用的“植物”的定义包括从再生植株获得的植物部分，其中，衰老诱导DHS、衰老诱导的eIF-5A或这两者的表达改变了，如叶片、花、果实和种子等。“植物”的定义还包括再生植物的后代，变体和突变体。
番茄、香石竹或拟南芥属衰老诱导的DHS蛋白或其功能衍生物，和番茄、香石竹或拟南芥属衰老诱导的eIF-5A蛋白或其功能衍生物优选是通过重组技术生产，选择性地与化学合成方法组合。在本发明的一种实施方案中，衰老诱导的DHS是作为一种融合蛋白表达的，它优选包括与麦芽糖结合蛋白融合的衰老诱导的DHS。
本文所披露的衰老诱导DHS或衰老诱导的eIF-5A蛋白的“功能性衍生物”分别是衰老诱导DHS或衰老诱导的eIF-5A的片段、变体、类似物或化学衍生物，它至少保留了一部分衰老诱导DHS或eIF-5A活性或能与分别对衰老诱导DHS或衰老诱导的eIF-5A专一的抗体有免疫交叉反应性。衰老诱导DHS或衰老诱导的eIF-5A蛋白的片段是指所述分子的任何亚型。变体肽可以通过直接化学合成制备，例如，使用本领域所熟知的方法。衰老诱导DHS或衰老诱导的eIF-5A的类似物是指基本上与所述完整蛋白或其片段类似的非天然蛋白。衰老诱导DHS或衰老诱导的eIF-5A的化学衍生物含有正常情况下不是所述肽或肽片段的一部分的额外的化学部分。通过让能够与特定侧链或末端残基起反应的有机衍生剂与所述肽的特定氨基酸残基反应将修饰引入这种肽或其片段。
本发明的衰老诱导DHS或老诱导的eIF-5A蛋白或肽可以这样生产培养用本发明的核苷酸序列(有义方向)转化过的细胞，让所述细胞合成所述蛋白，然后根据所使用的克隆方法以游离蛋白形式或融合蛋白形式从培养基或从细胞提取物中分离所述蛋白。另外，所述蛋白可以在无细胞系统中产生。Ranu等，酶学方法，60459-484，1979。
已经对本发明作了一般性说明，通过结合下面的实施例可以更好地理解本发明，这些实施例是用于说明目的的，而不是要限定本发明的范围。
实施例1mRNA分离从各种发育阶段的番茄花和番茄果实中并且从叶片中分离总RNA(未处理过或者在冷害或山梨醇处理之后)。简单地讲，在液氮研磨组织(5克)。将磨碎的粉与30毫升胍缓冲液(4M异硫氰酸胍，2.5mM乙酸钠，pH8.5，0.8％β-巯基乙醇)混合。混合物通过四层纱布过滤，并在4℃下以10000×g的速度离心30分钟。然后将上清液放在氯化铯密度梯度上然后以26000×g的速度离心20小时。沉淀的RNA用75％乙醇漂洗，重新悬浮在600微升DEPC处理过的水中，并在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸钠使RNA沉淀。在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离10微克RNA，并转移到尼龙膜上。在42℃下用随机启动的32P-dCTP标记的完整长度DHS cDNA(SEQ ID NO1)检测该膜移液。然后用含有1％SDS的1×SSC在室温下洗涤该膜1次，15分钟，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗涤3次，每次15分钟。在-70℃下让该膜对X光胶片进行曝光一夜。
用购自pROMEGA的PolyA+片段mRNA分离系统从总RNA中分离PolyA+mRNA。用PolyA+mRNA作模板利用购自Stratagene(La Jolla，加州)的ZAP ExpresscDNA合成系统进行cDNA合成。
番茄叶片cDNA文库筛选将用从用2M山梨醇处理了6小时的Match F1杂交番茄叶片中分离的mRNA制备的cDNA文库稀释到大约5×106PFU/毫升。用32P标记过的600bp RT-PCR片段筛选该cDNA文库。切除3个阳性cDNA克隆，并利用生产商说明书中推荐的方法将其重新环化pBK-CMV(Stratagene)噬菌粒。将完整长度pBK-CMV载体上。
质粒DNA分离，DNA测序利用Sambrook等(同上)所披露的碱性裂解方法分离质粒DNA。用双脱氧测序方法对完整长度阳性cDNA进行测序。Sanger等，美国科学院院报，745463-5467。利用BLAST检索(GenBank，Bethesda，MD)编辑并分析开放读框，五种最同源的蛋白与编码基因的衍生氨基酸序列的排比是利用BCM Search LAUNCHER实现的多重序列排比方式诱导的多重排比方法(参见F.Corpet核酸研究1610881-10890，1987)。通过MultiFinder鉴定存在于衍生氨基酸序列上的功能基序。
番茄RNA的Northern印迹杂交在1％变性的甲醛琼脂糖凝胶上分离从各种阶段的番茄花(花芽和花以及充分展开或干燥的衰老的花瓣)、番茄叶片、和各种成熟阶段的番茄果实(生硬，即花色少于10％的绿色果实，粉红，即整个果实是橘红和粉红色，和红色，软或硬)中分离的10微克总RNA，并固定在尼龙膜上。将利用随机引物试剂盒(Boehringer Mannheim)通过32P-dCTP标记的完整长度番茄cDNA用于检测该滤膜(7×107cpm)。在室温下用1×SSC，0.1％SDS洗涤该滤膜1次，在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤该膜3次。让该滤，膜干燥并在-70℃下让该膜对X光胶片进行曝光一夜。结果如图6、7、8和9所示。
拟南芥属RNA的Northern印迹杂交在1％变性的甲醛琼脂糖凝胶上分离按上述方法从5周龄(泳道1)、6周龄(泳道2)和7周龄(泳道3)拟南芥属植物的叶片中分离的总RNA，并固定在尼龙膜上。将利用随机引物试剂盒(Boehringer Mannheim)通过32P-dCTP标记的完整长度拟南芥属衰老诱导的DHS cDNA用于检测该滤膜(7×107cpm)。在室温下用1×SSC，0.1％SDS洗涤该滤膜1次，在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤该膜3次。让该滤膜干燥并在-70℃下让该膜对X光胶片进行曝光一夜。结果如图所示。
香石竹RNA的Northern印迹杂变在1％变性的甲醛琼脂糖凝胶上分离按上述方法从在花的各种发育阶段的香石竹植物花瓣，即紧凑的花芽(泳道1)、开始开放(泳道2)、完全开放的花(泳道3)、具有向内翻卷的花瓣的花(泳道4)中分离的总RNA，并固定在尼龙膜上。将利用随机引物试剂盒(BoehringerMannheim)通过32P-dCTP标记的完整长度香石竹衰老诱导的DHS cDNA用于检测该滤膜(7×107cpm)。在室温下用1×SSC，0.1％SDS洗涤该滤膜1次，在65℃下用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤该膜3次。让该滤，膜干燥并在-70℃下让该膜对X光胶片进行曝光一夜。结果示于图12中。
实施例2番茄衰老透导的DHS基因的山梨醇诱导在密封空间用2M山梨醇处理番茄叶片6小时。按以下方法从山梨醇处理过的叶片中提取RNA。
在液氮中研磨叶片(5克)。将磨碎的粉与30毫升胍缓冲液(4M异硫氰酸胍，2.5mM乙酸钠，pH8.5，0.8％β-巯基乙醇)混合。混合物通过四层纱布过滤，并在4℃下以10000×g的速度离心30分钟。然后将上清液放在氯化铯密度梯度上然后以26000×g的速度离心20小时。沉淀的RNA用75％乙醇漂洗，重新悬浮在600微升DEPC处理过的水中，并在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸钠使RNA沉淀。在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离10微克RNA，并转移到尼龙膜上。在42℃下用随机启动的32P-dCTP标记的完整长度DHS cDNA(SEQ ID NO1)检测该膜移液。然后用含有1％SDS的1×SSC在室温下洗涤该膜1次，15分钟，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗涤3次，每次15分钟。在-70℃下让该膜对X光胶片进行曝光一夜。
结果如图8所示。如图所示，通过山梨醇在叶片中诱导的DHS的转录。
实施例3在衰老中的花中诱导番茄DHS基因采集番茄植物的紧凑的花瓣和开放的花、衰老的花，并按例2所述方法分离RNA。在1.2％变性的甲醛琼脂糖凝胶上分离10微克RNA，并转移到尼龙膜上。在42℃下用随机启动的32P-dCTP标记的完整长度DHScDNA(SEQ ID NO1)检测该膜移液。然后用含有1％SDS的1×SSC在室温下洗涤该膜1次，15分钟，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗涤3次，每次15分钟。在-70℃下让该膜对X光胶片进行曝光一夜。
结果如图6所示。如图所示，在衰老的花中诱导了DHS的转录。
实施例4在成熟的果实中诱导番茄DHS基因按例2所述方法从生硬、粉红色和成熟果实中分离RNA。在1.2％变性的甲醛琼脂糖凝胶上分离10微克RNA，并转移到尼龙膜上。在42℃下用随机启动的32P-dCTP标记的完整长度DHS cDNA(SEQ ID NO1)(图1)检测该膜移液。然后用含有1％SDS的1×SSC在室温下洗涤该膜1次，15分钟，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗涤3次，每次15分钟。在-70℃下让该膜对X光胶片进行曝光一夜。
结果如图7所示。如图所示，在导致腐烂的衰老即将开始之前DHS的转录在成熟的、红色果实中最强。
实施例5通过冷害诱导番茄衰老诱导的DHS基因在生长箱中，在6℃下处理花盆中的番茄植物(7-8周龄)2天、3天或6天。将光照周期设定为8小时黑暗和16小时光照。通过将植物重新送回温室进行回温。不回温的植物在从所述生长箱中取出后马上收获。按以下方法从叶片中提取RNA。在液氮中研磨叶片(5克)。将磨碎的粉与30毫升胍缓冲液(4M异硫氰酸胍，2.5mM乙酸钠，pH8.5，0.8％β-巯基乙醇)混合。混合物通过四层纱布过滤，并在4℃下以10000×g的速度离心30分钟。然后将上清液放在氯化铯密度梯度上然后以26000×g的速度离心20小时。沉淀的RNA用75％乙醇漂洗，重新悬浮在600微升DEPC处理过的水中，并在-70℃下用0.75毫升95％乙醇和30微升3M乙酸钠使RNA沉淀。在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离10微克RNA，并转移到尼龙膜上。在42℃下用随机启动的32P-dCTP标记的完整长度DHS cDNA(SEQ ID NO1)检测该膜移液。然后用含有1％SDS的1×SSC在室温下洗涤该膜1次，15分钟，用含有0.1％SDS的0.2×SSC在65℃下洗涤3次，每次15分钟。在-70℃下让该膜对X光胶片进行曝光一夜。
结果如图9所示。如图所示，通过接触冷害温度然后再回温在叶片中诱导了DHS转录，并且增强了的转录与冷害损伤相关，这种损害是以膜渗漏形式测定的。
实施例6利用基于未鉴定的拟南芥属基因组序列的引物制备拟南芥属PCR产物利用一对由拟南芥属基因组序列设计的寡核苷酸引物通过PCR由拟南芥属cDNA模板制备部分长度衰老诱导的DHS序列。5’引物是十九聚体，其序列为5’-GGTGGTGTTGAGGAAGATCSEQ ID NO7)；3’引物是二十聚体，其序列为GGTGCACGCCCTGATGAAGC-3’(SEQ ID NO8)。利用扩增高保真PCR系统(Boehringer Mannheim)按照以下方法进行PCR，并用拟南芥属衰老的叶片cDNA文库作模板。
反应成分cDNA 1微升(5×107PFU)
dNTP(各10mM) 1微升氯化镁(5mM)+10倍缓冲液5微升引物1和2(各100μM)2微升扩增高保真DNA聚合酶 1.75U反应体积 50微升反应参数94℃30分钟94℃1分钟，58℃1分钟，72℃2分钟，进行45轮72℃15分钟。
实施例7基因组DNA的分离和Southern分析通过在液氮中将10克番茄叶片组织研磨成细粉从番茄叶片中提取基因组DNA。将预先加热到60℃的含有25毫升匀浆缓冲液[100mMTris-HCl，pH8.0，100mM EDTA，250mM氯化钠、1％十二烷基肌氨酸钠，1％2-巯基乙醇，10微克/毫升RNase和12.5毫升苯酚]的37.5毫升混合物加入研磨过的组织中。摇动该混合物15分钟。再将12.5毫升氯仿/异戊醇(24∶1)添加到该混合物中，并再摇动15分钟。对该混合物进行离心，并用25毫升苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)和氯仿/异戊醇(24∶1)对水相进行再次提取。通过在室温下用15毫升异丙醇沉淀回收核酸。将沉淀重新悬浮在1毫升水中。
按以下方法对基因组DNA进行限制酶消化。
让10微克基因组DNA、40微升10倍反应缓冲液和100U限制酶(XbaI、EcoRI、EcoRV或HindIII)在400微升总反应体积中反应5-6小时。然后对该混合物进行苯酚提取并用乙醇沉淀。对消化过的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，在0.8％琼脂糖凝胶上以15伏的电压电泳大约5小时。将凝胶在变性缓冲液[87.66克氯化钠和20克氢氧化钠/升]中浸没30分钟，同时轻微振动，用蒸馏水漂洗，并浸没在中和缓冲液[87.66克氯化钠和60.55ke Tris-HCl，pH7.5/升]中，同时轻微振动，通过毛细吸印将DNA转移到Hybond-N+尼龙膜上。
用1×106CPM/毫升32P-dCTP标记的完整长度DHS cDNA或DHScDNA克隆的3’非编码区在42℃下进行杂交过夜。预杂交和杂交是在含有50％甲酰胺、6×SSC、5×denhardt’s溶液、0.1％SDS和100毫克/毫升变性的鲑鱼精DNA的缓冲液中进行的。将所述膜预杂交2-4小时；杂交进行一夜。
在杂交结束之后，然后在室温下用2×SSC和0.1％SDS漂洗膜，然后用2×SSC和0.1％SDS洗涤15分钟，并用0.2×SSC和0.1％SDS洗涤15分钟。然后在-80℃让该膜对X光胶片曝光一夜。结果如图5所示。
实施例8从拟南芥属中分离衰老诱导的eIF-5A基因用拟南芥属衰老的叶片cDNA文库作模板通过PCR获得在拟南芥属叶片中表达的衰老诱导的eIF-5A基因的完整长度cDNA克隆。首先，利用与载体T7引物<AATACGACTCACTATAG>(SEQ ID NO18)配对的简并上游引物<AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(SEQ ID NO17)和与载体T3引物<ATTAACCCTCACTAAAG>(SEQ ID NO20)配对的简并下游引物<TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC>(SEQ ID NO19)制备相应于该基因的5’和3’末端的PCR产物。将该PCR产物亚克隆到pBluescript上进行测序。然后用与3’-专一性引物<AGAAGAAGTATAAAAACCATC>(SEQ ID NO22)配对的5’-专一性引物<CTGTTACCAAAAAATCTGTACC>(SEQ ID NO21)获得完整长度cDNA，并亚克隆到pBluescript上进行测序。
实施例9从番茄果实中分离衰老诱导的eIF-5A基因用番茄果实cDNA文库作模板通过PCR获得在番茄果实中表达的衰老诱导的eIF-5A基因的完整长度cDNA克隆。首先，利用与载体T7引物(SEQ ID NO18)配对的简并上游引物(SEQ ID NO17)和与载体T3引物(SEQ ID NO20)配对的简并下游引物(SEQ ID NO19)制备相应于该基因的5’和3’末端的PCR产物。将该PCR产物亚克隆到pBluescript上进行测序。然后用与载体T7引物(SEQ ID NO18)配对的5’-专一性引物<AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG>(SEQ ID NO23)获得完整长度cDNA，并亚克隆到pBluescript上进行测序。
实施例10从香石竹中分离衰老诱导的eIF-5A基因用香石竹衰老的花cDNA文库作模板通过PCR获得在香石竹花中表达的衰老诱导的eIF-5A基因的完整长度cDNA克隆。首先，利用与载体T7引物(SEQ ID NO18)配对的简并上游引物(SEQ ID NO17)和与载体T3引物(SEQ ID NO20)配对的简并下游引物(SEQ ID NO19)制备相应于该基因的5’和3’末端的PCR产物。将该PCR产物亚克隆到pBluescript上进行测序。然后用与3’专一性引物<ACAAAACCTGTGTTATAACTCC>(SEQ ID NO25)配对的5’专一性引物<TTTTACATCAATCGAAAA>(SEQ ID NO24)获得完整长度cDNA，并亚克隆到pBluescript上进行测序。
实施例11从拟南芥属中分离衰老诱导的DHS基因通过筛选拟南芥属衰老叶片的cDNA文库获得在拟南芥属叶片中表达的衰老诱导的DHS基因的完整长度cDNA克隆。用于筛选的探针的序列(SEQ ID NO26)如图38所示。该探针是利用所述衰老叶片cDNA文库作模板和由GeneBank中的未鉴定的基因组序列(AB017060)设计的引物(在图38中表示为加下划线的部分)通过PCR获得的。将该PCR产物亚克隆到pBluescript上进行测序。
实施例12从香石竹中分离衰老诱导的DHS基因通过筛选香石竹衰老花瓣cDNA文库获得在香石竹花瓣中表达的衰老诱导的DHS基因的完整长度cDNA文库。用于筛选的探针的序列(SEQID NO27)如图39所示。该探针是利用衰老花瓣cDNA文库作模板和简并引物(上游5’TTGARGAAGATYCATMAARTGCCT3’，SEQ ID NO28；下游5’CCATCAAAYTCYTGKGCRGTGTT3’，SEQ ID NO29)通过PCR获得的。将该PCR产物亚克隆到pBluescript上进行测序。
实施例13用反义方向的完整长度的拟南芥属DHS或其3’片段部分转化拟南芥属用二元载体pKYLX71转化农杆菌，该载体含有完整长度的衰老诱导的拟南芥属DHS cDNA序列或该DHS基因的3’末端(SEQ ID NO30)(图36)，这两者都是以反义形式表达的，受双35S启动子的控制。通过真空渗滤用转化过的农杆菌转化拟南芥属植物，并在氨苄青霉素上筛选来自所得到的T0植株的转化的种子。
图21-24是转化过的拟南芥属植物的照片，表示在转化过的植物中DHS基因或其3’末端沿反义方向的表达会导致生物量的增加，例如，较大的叶片和较大的植物体积。图25表示转基因拟南芥属植物具有较高的种子产量。
实施例14用反义方向的完整长度的番茄DHS或其3’片段部分转化番茄植物用二元载体pKYLX71转化农杆菌，该载体含有完整长度的衰老诱导的番茄DHS cDNA序列或该DHS基因的3’末端(SEQ ID NO31)(图37)，用所述农杆菌产生番茄叶片外殖体，并制备转化过的愈伤组织和小植株，通过标准组织培养方法筛选。在温室条件下将转化过的小植株生长成成熟的结实的T1植株。
图26-35是照片，表示衰老诱导的番茄DHS基因在转化过的植物中的减弱了的表达会导致较高的生物量，例如，较大的叶片和较大的植株，正如在转化过的拟南芥属植物中所看到的，以及番茄果实推迟了的软化和腐烂。
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<221>CDS<222>(54..1196)<220>
<223>DHS<400>1cgcagaaact cgcggcggca gtcttgttcc ctacataatc ttggtctgca ata atg 56Met1gga gaa gct ctg aag tac agt atc atg gac tca gta aga tcg gta gtt 104Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Ile Met Asp Ser Val Arg Ser Val Val5 10 15ttc aaa gaa tcc gaa aat cta gaa ggt tct tgc act aaa atc gag ggc 152Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Ser Cys Thr Lys Ile Glu Gly20 25 30tac gac ttc aat aaa ggc gtt aac tat gct gag ctg atc aag tcc atg 200Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Val Asn Tyr Ala Glu Leu Ile Lys Ser Met
35 40 45gtt tcc act ggt ttc caa gca tct aat ctt ggt gac gcc att gca att 248Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Ala Ile50 55 60 65gtt aat caa atg cta gat tgg agg ctt tca cat gag ctg ccc acg gag 296Val Asn Gln Met Leu Asp Trp Arg Leu Ser His Glu Leu Pro Thr Glu70 75 80gat tgc agt gaa gaa gaa aga gat gtt gca tac aga gag tcg gta acc 344Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Val Ala Tyr Arg Glu Ser Val Thr85 90 95tgc aaa atc ttc ttg ggg ttc act tca aac ctt gtt tct tct ggt gtt 392Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val100 105 110aga gac act gtc cgc tac ctt gtt cag cac cgg atg gtt gat gtt gtg 440Arg Asp Thr Val Arg Tyr Leu Val Gln His Arg Met Val Asp Val Val115 120 125gtt act aca gct ggt ggt att gaa gag gat ctc ata aag tgc ctc gca 488Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala130 135 140 145cca acc tac aag ggg gac ttc tct tta cct gga gct tct cta cga tcg 536Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Ser Leu Arg Ser150 155 160aaa gga ttg aac cgt att ggt aac tta ttg gtt cct aat gac aac tac 584Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr165 170 175tgc aaa ttt gag aat tgg atc atc cca gtt ttt gac caa atg tat gag 632Cys Lys Phe Glu Asn Trp Ile Ile Pro Val Phe Asp Gln Met Tyr Glu180 185 190gag cag att aat gag aag gtt cta tgg aca cca tct aaa gtc att gct 680Glu Gln Ile Asn Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Val Ile Ala195 200 205cgt ctg ggt aaa gaa att aat gat gaa acc tca tac ttg tat tgg gct 728Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala210 215 220 225tac aag aac cgg att cct gtc ttc tgt cct ggc ttg acg gat gga tca 776Tyr Lys Asn Arg Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser
230 235 240ctt ggt gac atg cta tac ttc cat tct ttc aaa aag ggt gat cca gat 824Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Lys Lys Gly Asp Pro Asp245 250 255aat cca gat ctt aat cct ggt cta gtc ata gac att gta gga gat att 872Asn Pro Asp Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Asp Ile Val Gly Asp Ile260 265 270agg gcc atg aat ggt gaa gct gtc cat gct ggt ttg agg aag aca gga 920Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Gly Leu Arg Lys Thr Gly275 280 285atg att ata ctg ggt gga ggg ctg cct aag cac cat gtt tgc aat gcc 968Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Val Cys Asn Ala290 295 300 305aat atg atg cgc aat ggt gca gat ttt gcc gtc ttc att aac acc gca 1016Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Phe Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala310 315 320caa gag ttt gat ggt agt gac tct ggt gcc cgt cct gat gaa gct gta 1064Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val325 330335tca tgg gga aag ata cgt ggt ggt gcc aag act gtg aag gtg cat tgt 1112Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys340 345 350gat gca acc att gca ttt ccc ata tta gta gct gag aca ttt gca gct 1160Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala355 360 365aag agt aag gaa ttc tcc cag ata agg tgc caa gtt tgaacattga 1206Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile Arg Cys Gln Val370 375 380ggaagctgtc cttccgacca cacatatgaa ttgctagctt ttgaagccaa cttgctagtg1266tgcagcacca tttattctgc aaaactgact agagagcagg gtatattcct ctaccccgag1326ttagacgaca tcctgtatgg ttcaaattaa ttatttttct ccccttcaca ccatgttatt1386tagttctctt cctcttcgaa agtgaagagc ttagatgttc ataggttttg aattatgttg1446gaggttggtg ataactgact agtcctctta ccatatagat aatgtatcct tgtactatga1506
gattttgggt gtgtttgata ccaaggaaaa tgtttatttg gaaaacaatt ggatttttaa1566tttatttttt cttgtttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1609<210>2<211>381<212>PRT<213>番茄属种(Lycopersicon sp.)<220>
<223>DHS<400>2Met Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Ile Met Asp Ser Val Arg Ser Val1 5 10 15Val Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Ser Cys Thr Lys Ile Glu20 25 30Gly Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Val Asn Tyr Ala Glu Leu Ile Lys Ser35 40 45Met Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Ala50 55 60Ile Val Asn Gln Met Leu Asp Trp Arg Leu Ser His Glu Leu Pro Thr65 70 75 80Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Val Ala Tyr Arg Glu Ser Val85 90 95Thr Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly100 105 110Val Arg Asp Thr Val Arg Tyr Leu Val Gln His Arg Met Val Asp Val115 120 125Val Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu130 135 140Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Ser Leu Arg145 150 155 160Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn165 170 175Tyr Cys Lys Phe Glu Asn Trp Ile Ile Pro Val Phe Asp Gln Met Tyr
180 185 190Glu Glu Gln Ile Asn Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Val Ile195 200 205Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr Trp210 215 220Ala Tyr Lys Asn Arg Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly225 230 235 240Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Lys Lys Gly Asp Pro245 250 255Asp Asn Pro Asp Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Asp Ile Val Gly Asp260 265 270Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Gly Leu Arg Lys Thr275 280 285Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Val Cys Asn290 295 300Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Phe Ala Val Phe Ile Asn Thr305 310 315 320Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala325 330 335Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly Ala Lys Thr Val Lys Val His340 345 350Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala355 360 365Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile Arg Cys Gln Val370 375 380<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>3agtotagaag gtgctcgtcc tgat24
<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>4gactgcagtc gacatcgatt tttttttttt tttt 34<210>5<211>2272<212>DNA<213>拟南芥属种(Arabidopsis sp.)<220>
<221>CDS<222>(68..265，348..536，624..842，979..1065，1154..1258，1575..1862)<400>5gaactcccaa aaccctctac tactacactt tcagatccaa ggaaatcaat tttgtcattc 60gagcaac atg gag gat gat cgt gtt ttc tct tcg gtt cac tca aca gtt 109Met Glu Asp Asp Arg Val Phe Ser Ser Val His Ser Thr Val1 5 10ttc aaa gaa tcc gaa tca ttg gaa gga aag tgt gat aaa atc gaa gga 157Phe Lys Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys Ile Glu Gly15 20 25 30tac gat ttc aat caa gga gta gat tac cca aag ctt atg cga tcc atg 205Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asp Tyr Pro Lys Leu Met Arg Ser Met35 40 45ctc acc acc gga ttt caa gcc tcg aat ctc ggc gsa gct att gat gtc 253Leu Thr Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Glu Ala Ile Asp Val50 55 60gtc aat caa atg gttcgtttct cgaattcatc aaaaataaaa attccttctt 305Val Asn Gln Met65tttgttttcc tttgttttgg gtgaattagt aatgacaaag ag ttt gaa ttt gta359Phe Glu Phe Val70
ttg aag cta gat tgg aga ctg gct gat gaa act aca gta gct gaa gac 407Leu Lys Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu Thr Thr Val Ala Glu Asp75 80 85tgt agt gaa gag gag aag aat cca tcg ttt aga gag tct gtc aag tgt 455Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asn Pro Ser Phe Arg Glu Ser Val Lys Cys90 95 100aaa atc ttt cta ggt ttc act tca aat ctt gtt tca tct ggt gtt aga 503Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val Arg105 110 115gat act att cgt tat ctt gtt cag cat cat atg gtttgtgatt tttgctttat 556Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met120 125caccctgctt ttttatagat gttaaaattt tcgagcttta gttttgattt caatggtttt 616tctgcag gtt gat gtt ata gtc acg aca act ggt ggt gtt gag gaa gat 665Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp130 135 140ctc ata aaa tgc ctt gca cct aca ttt aaa ggt gat ttc tct cta cct 713Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro145 150 155gga gct tat tta agg tca aag gga ttg aac cga att ggg aat ttg ctg 761Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu160 165 170 175gtt cct aat gat aac tac tgc aag ttt gag gat tgg atc att ccc atc 809Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile180 185 190ttt gac gag atg ttg aag gaa cag aaa gaa gag gtattgcttt atctttcctt 862Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu Glu195 200tttatatgat ttgagatgat tctgtttgtg cgtcactagt ggagatagat tttgattcct 922ctcttgcatc attgacttcg ttggtgaatc cttctttctc tggtttttcc ttgtag 978aat gtg ttg tgg act cct tct aaa ctg tta gca cgg ctg gga aaa gaa 1026Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys Glu205 210 215atc aac aat gag agt tca tac ctt tat tgg gca tac aag gtatccaaaa 1075Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys
220 225 230ttttaacctt tttagttttt taatcatcct gtgaggaact cggggattta aattttccgc1135ttcttgtggt gtttgtag atg aat att cca gta ttc tgc cca ggg tta aca 1186Met Asn Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr235 240gat ggc tct ctt ggg gat atg ctg tat ttt cac tct ttt cgt acc tct 1234Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser245 250 255ggc ctc atc atc gat gta gta caa ggtacttctt ttactcaata agtcagtgtg 1288Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln260 265ataaatattc ctgctacatc tagtgcagga atattgtaac tagtagtgca ttgtagcttt1348tccaattcag caacggactt tactgtaagt tgatatctaa aggttcaaac gggagctagg1408agaatagcat aggggcattc tgatttaggt ttggggcact gggttaagag ttagagaata1468ataatcttgt tagttgttta tcaaactctt tgatggttag tctcttggta atttgaattt1528tatcacagtg tttatggtct ttgaaccagt taatgtttta tgaaca gat atc aga 1583Asp Ile Arggct atg aac ggc gaa gct gtc cat gca aat cct aaa aag aca ggg atg 1631Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys Lys Thr Gly Met270 275 280 285ata atc ctt gga ggg ggc ttg cca aag cac cac ata tgt aat gcc aat 1679Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn290 295 300atg atg cgc aat ggt gca gat tac gct gta ttt ata aac acc ggg caa 1727Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Gly Gln305 310 315gaa ttt gat ggg agc gac tcg ggt gca cgc cct gat gaa gcc gtg tct 1775Glu Phe Asp Gly Set Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser320 325 330tgg ggt aaa att agg ggt tct gct aaa acc gtt aag gtc tgc ttt tta 1823Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu335 340 345att tct tca cat cct aat tta tat ctc act cag tgg ttt tgagtacata 1872
Ile Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr Leu Thr Gln Trp Phe350 355 360tttaatattg gatcattctt gcaggtatac tgtgatgcta ccatagcctt cccattgttg1932gttgcagaaa catttgccac aaagagagac caaacctgtg agtctaagac ttaagaactg1992actggtcgtt ttggccatgg attcttaaag atcgttgctt tttgatttta cactggagtg2052accatataac actccacatt gatgtggctg tgacgcgaat tgtcttcttg cgaattgtac2112tttagtttct ctcaacctaa aatgatttgc agattgtgtt ttcgtttaaa acacaagagt2172cttgtagtca ataatccttt gccttataaa attattcagt tccaacaaca cattgtgatt2232ctgtgacaag tctcccgttg cctatgttca cttctctgcg 2272<210>6<211>362<212>PRT<213>拟南芥属种(Arabidopsis sp.)<400>6Met Glu Asp Asp Arg Val Phe Ser Ser Val His Ser Thr Val Phe Lys1 5 10 15Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys Ile Glu Gly Tyr Asp20 25 30Phe Asn Gln Gly Val Asp Tyr Pro Lys Leu Met Arg Ser Met Leu Thr35 40 45Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Glu Ala Ile Asp Val Val Asn50 55 60Gln Met Phe Glu Phe Val Leu Lys Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu65 70 75 80Thr Thr Val Ala Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asn Pro Ser Phe85 90 95Arg Glu Ser Val Lys Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu100 105 110Val Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His115120 125Met Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu
130 135 140Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly145 150 155 160Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val165 170 175Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe180 185 190Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro195 200 205Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser210 215 220Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly225 230 235 240Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg245 250 255Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn260 265 270Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu275 280 285Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg290 295 300Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp305 310 315 320Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys325 330 335Ile Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser340 345 350His Pro Asn Leu Tyr Leu Thr Gln Trp Phe355 360<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明引物<400>7ggtggtgttg aggaagatc19<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>8ggtgcacgcc ctgatgaagc 20<210>9<211>1660<212>DNA<213>石竹属种(Dianthus sp.)<220>
<223>DHS<220>
<221>CDS<222>(256)..(1374)<400>9gtcattacaa tgcataggat cattgcacat gctaccttcc tcattgcact tgagcttgcc 60atacttttgt ttttgacgtt tgataataat actatgaaaa tattatgttt tttcttttgt 120gtgttggtgt ttttgaagtt gtttttgata agcagaaccc agttgtttta cacttttacc 180attgaactac tgcaattcta aaactttgtt tacattttaa ttccatcaaa gattgagttc 240agcataggaa aaagg atg gag gat gct aat cat gat agt gtg gca tct gcg 291Met Glu Asp Ala Asn His Asp Ser Val Ala Ser Ala1 5 10cac tct gca gca ttc aaa aag tcg gag aat tta gag ggg aaa agc gtt 339His Ser Ala Ala Phe Lys Lys Ser Glu Asn Leu Glu Gly Lys Ser Val15 20 25
aag att gag ggt tat gat ttt aat caa ggt gta aac tat tcc aaa ctc 387Lys Ile Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu30 35 40ttg caa tct ttc gct tct aat ggg ttt caa gcc tcg aat ctt gga gat 435Leu Gln Ser Phe Ala Ser Asn Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp45 50 55 60gcc att gaa gta gtt aat cat atg cta gat tgg agt ctg gca gat gag 483Ala Ile Glu Val Val Asn His Met Leu Asp Trp Ser Leu Ala Asp Glu65 70 75gca cct gtg gac gat tgt agc gag gaa gag agg gat cct aaa ttc aga 531Ala Pro Val Asp Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Pro Lys Phe Arg80 85 90gaa tct gtg aag tgc aaa gtg ttc ttg ggc ttt act tca aat ctt att 579Glu Ser Val Lys Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Ile95 100 105tcc tct ggt gtt cgt gac aca att cgg tat ctc gtg caa cat cat atg 627Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met110 115 120gtt gac gtg ata gta acg aca acc gga ggt ata gaa gaa gat cta ata 675Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile125 130 135 140aaa gga aga tcc atc aag tgc ctt gca ccc act ttc aaa ggc gat ttt 723Lys Gly Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe145 150 155gcc tta cca gga gct caa tta cgc tcc aaa ggg ttg aat cga att ggt 771Ala Leu Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly160 165 170aat ctg ttg gtt ccg aat gat aac tac tgt aaa ttt gag gat tgg atc 819Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile175 180 185att cca att tta gat aag atg ttg gaa gag caa att tca gag aaa atc 867Ile Pro Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile190 195 200tta tgg aca cca tcg aag ttg att ggt cga tta gga aga gaa ata aac 915Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn205 210 215 220
gat gag agt tca tac ctt tac tgg gcc ttc aag aac aat att cca gta 963Asp Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val225 230 235ttt tgc cca ggt tta aca gac ggc tca ctc gga gac atg cta tat ttt 1011Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe240 245 250cat tct ttt cgc aat ccg ggt tta atc gtc gat gtt gtg caa gat ata 1059His Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Val Asp Val Val Gln Asp Ile255 260 265aga gca gta aat ggc gag gct gtg cac gca gcg cct agg aaa aca ggc 1107Arg Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly270 275 280atg att ata ctc ggt gga ggg ttg cct aag cac cac atc tgc aac gca 1155Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala285 290 295 300aac atg atg aga aat ggc gcc gat tat gct gtt ttc atc aac act gcc 1203Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala305 310315gaa gag ttt gac ggc agt gat tct ggt gct cgc ccc gat gag gct att 1251Glu Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Ile320 325 330tca tgg ggc aaa att agc gga tct gct aag act gtg aag gtg cat tgt 1299Ser Trp Gly Lys Ile Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys335 340 345gat gcc acg ata gct ttc cct cta cta gtc gct gag aca ttt gca gca 1347Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala350 355 360aaa aga gaa aaa gag agg aag agc tgt taaaactttt ttgattgttg 1394Lys Arg Glu Lys Glu Arg Lys Sar Cys365 370aaaaatctgt gttatacaag tctcgaaatg cattttagta attgacttga tcttatcatt 1454tcaatgtgtt atctttgaaa atgttggtaa tgaaacatct cacctcttct atacaacatt 1514gttgatccat tgtactccgt atcttgtaat tttggaaaaa aaaaaccgtc tattgttacg 1574agagagtaca tttttgaggt aaaaatatag gatttttgtg cgatgcaaat gctggttatt 1634
cccttgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1660<210>10<211>373<212>PRT<213>石竹属种(Dianthus sp.)<220>
<223>DHS<400>10Met Glu Asp Ala Asn His Asp Ser Val Ala Ser Ala His Ser Ala Ala1 5 10 15Phe Lys Lys Ser Glu Asn Leu Glu Gly Lys Ser Val Lys Ile Glu Gly20 25 30Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Gln Ser Phe35 40 45Ala Ser Asn Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Glu Val50 55 60Val Asn His Met Leu Asp Trp Ser Leu Ala Asp Glu Ala Pro Val Asp65 70 75 80Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Pro Lys Phe Arg Glu Ser Val Lys85 90 95Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Ile Ser Ser Gly Val100 105 110Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met Val Asp Val Ile115 120 125Val Thr Thr Thr Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Gly Arg Ser130 135 140Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala Leu Pro Gly145 150 155 160Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val165 170 175Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Leu180 185 190
Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile Leu Trp Thr Pro195 200 205Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn Asp Glu Ser Ser210 215 220Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly225 230 235 240Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg245 250 255Asn Pro Gly Leu Ile Val Asp Val Val Gln Asp Ile Arg Ala Val Asn260 265 270Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu275 280 285Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg290 295 300Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala Glu Glu Phe Asp305 310 315 320Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Ile Ser Trp Gly Lys325 330 335Ile Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile340 345 350Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Arg Glu Lys355 360 365Glu Arg Lys Ser Cys370<210>11<211>780<212>DNA<213>番茄属种(Lycopersicon sp.)<220>
<223>eif-5A<220>
<221>CDS<222>(43)..(522)
<400>11aaagaatcct agagagagaa agggaatcct agagagagaa gc atg tcg gac gaa54Met Ser Asp Glu1gaa cac cat ttt gag tca aag gca gat gct ggt gcc tca aaa act ttc 102Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser Lys Thr Phe5 10 15 20cca cag caa gct gga acc atc cgt aag aat ggt tac atc gtt atc aaa 150Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile Val Ile Lys25 30 35ggc cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtc tcc act tca aaa act gga aaa 198Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys40 45 50cac gga cat gct aaa tgt cac ttt gtg gca att gac att ttc aat gga 246His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe Asn Gly55 60 65aag aaa ctg gaa gat atc gtt ccg tcc tcc cac aat tgt gat gtg cca 294Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp Val Pro70 75 80cat gtt aac cgt acc gac tat cag ctg att gat atc tct gaa gat ggt 342His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu Asp Gly85 90 95 100ttt gtc tca ctt ctt act gaa agt gga aac acc aag gat gac ctc agg 390Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Ser Gly Asn Thr Lys Asp Asp Leu Arg105 110 115ctt ccc acc gat gaa aat ctg ctg aag cag gtt aaa gat ggg ttc cag 438Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gln Val Lys Asp Gly Phe Gln120 125 130gaa gga aag gat ctt gtg gtg tct gtt atg tct gcg atg ggc gaa gag 486Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly Glu Glu135 140 145cag att aac gcc gtt aag gat gtt ggt acc aag aat tagttatgtc532Gln Ile Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn150 155 160atggcagcat aatcactgcc aaagctttaa gacattatca tatcctaatg tggtactttg 592
atatcactag attataaact gtgttatttg cactgttcaa aacaaaagaa agaaaactgc 652tgttatggct agagaaagta ttggctttga gcttttgaca gcacagttga actatgtgaa 712aattctactt tttttttttt gggtaaaata ctgctcgttt aatgttttgc aaaaaaaaaa 772aaaaaaaa 780<210>12<211>160<212>PRT<213>番茄属种(Lycopersicon sp.)<220>
<223>eif-5A<400>12Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala1 5 10 15Ser Lys Thr Phe Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr20 25 30Ile Val Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser35 40 45Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp50 55 60Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn65 70 75 80Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile85 90 95Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Ser Gly Asn Thr Lys100 105 110Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gln Val Lys115 120 125Asp Gly Phe Gln Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala130 135 140Met Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn145 150 155 160
<210>13<211>812<212>DNA<213>石竹属种(Dianthus sp.)<220>
<223>eif-5A<220>
<221>CDS<222>(67)..(546)<400>13ctcttttaca tcaatcgaaa aaaaattagg gttcttattt tagagtgaga ggcgaaaaat 60cgaacg atg tcg gac gac gat cac cat ttc gag tca tcg gcc gac gcc108Met Ser Asp Asp Asp His His Phe Glu Ser Ser Ala Asp Ala1 5 10gga gca tcc aag act tac cct caa caa gct ggt aca atc cgc aag agc 156Gly Ala Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Ser15 20 25 30ggt cac atc gtc atc aaa aat cgc cct tgc aag gtg gtt gag gtt tct 204Gly His Ile Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser35 40 45acc tcc aag act ggc aag cac ggt cat gcc aaa tgt cac ttt gtt gcc 252Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala50 55 60att gac att ttc aac ggc aag aag ctg gaa gat att gtc ccc tca tcc 300Ile Asp Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser65 70 75cac aat tgt gat gtt cca cat gtc aac cgt gtc gac tac cag ctg ctt 348His Asn Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Leu80 85 90gat atc act gaa gat ggc ttt gtt agt ctg ctg act gac agt ggt gac 396Asp Ile Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp95 100 105 110acc aag gat gat ctg aag ctt cct gct gat gag gcc ctt gtg aag cag 444Thr Lys Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gln115 120 125
atg aag gag gga ttt gag gcg ggg aaa gac ttg att ctg tca gtc atg 492Met Lys Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu Ile Leu Ser Val Met130 135 140tgt gca atg gga gaa gag cag atc tgc gcc gtc aag gac gtt agt ggt 540Cys Ala Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly145 150 155ggc aag tagaagcttt tgatgaatcc aatactacgc ggtgcagttg aagcaatagt596Gly Lys160aatctcgaga acattctgaa ccttatatgt tgaattgatg gtgcttagtt tgttttggaa 656atctctttgc aattaagttg taccaaatca atggatgtaa tgtcttgaat ttgttttatt 716tttgttttga tgtttgctgt gattgcatta tgcattgtta tgagttatga cctgttataa 776cacaaggttt tggtaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 812<210>14<211>160<212>PRT<213>石竹属种(Dianthus sp.)<220>
<223>eif-5A<400>14Met Ser Asp Asp Asp His His Phe Glu Ser Ser Ala Asp Ala Gly Ala1 5 10 15Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Ser Gly His20 25 30Ile Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser35 40 45Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp50 55 60Ile Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn65 70 75 80Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Leu Asp Ile85 90 95
Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp Thr Lys100 105 110Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gln Met Lys115 120 125Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu Ile Leu Ser Val Met Cys Ala130 135 140Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly Gly Lys145 150 155 160<210>15<211>702<212>DNA<213>拟南芥属种(Arabidopsis sp.)<220>
<223>eif-5A<220>
<221>CDS<222>(56)..(529)<400>15ctgttaccaa aaaatctgta ccgcaaaatc ctcgtcgaag ctcgctgctg caacc atg 58Met1tcc gac gag gag cat cac ttt gag tcc agt gac gcc gga gcg tcc aaa 106Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser Lys5 10 15acc tac cct caa caa gct gga acc atc cgt aag aat ggt tac atc gtc 154Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile Val20 25 30atc aaa aat cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtt tca acc tcg aag act 202Ile Lys Asn Arg Prc Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45ggc aag cat ggt cat gct aaa tgt cat ttt gta gct att gat atc ttc 250Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe50 55 60 65acc agc aag aaa ctc gaa gat att gtt cct tct tcc cac aat tgt gat 298
Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp70 75 80gtt cct cat gtc aac cgt act gat tat cag ctg att gac att tct gaa 346Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu85 90 95gat gga tat gtc agt ttg ttg act gat aac ggt agt acc aag gat gac 394Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp Asp100 105 110ctt aag ctc cct aat gat gac act ctg ctc caa cag atc aag agt ggg 442Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gln Gln Ile Lys Ser Gly115 120 125ttt gat gat gga aaa gat cta gtg gtg agt gta atg tca gct atg gga 490Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly130 135 140 145gag gaa cag atc aat gct ctt aag gac atc ggt ccc aag tgagactaac539Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys150 155aaagcctccc ctttgttatg agattcttct tcttctgtag gcttccatta ctcgtcggag 599attatcttgt ttttgggtta ctcctatttt ggatatttaa acttttgtta ataatgccat 659cttcttcaac cttttccttc tagatggttt ttatacttct tct 702<210>16<211>158<212>PRT<213>拟南芥属种(Arabidopsis sp.)<220>
<223>eif-5A<400>16Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser1 5 10 15Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile20 25 30Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys35 40 45Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile
50 55 60Phe Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys65 70 75 80Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser85 90 95Glu Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp100 105 110Asp Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gln Gln Ile Lys Ser115 120 125Gly Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met130 135 140Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys145 150 155<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>17aaarrycgmc cytgcaaggt20<210>18<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>18aatacgactc actatag 17<210>19<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<220>
<223>″n″ bases represent a，t，c，g，other or unknown<400>19tcyttnccyt cmkctaahcc 20<210>20<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>20attaaccctc actaaag17<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>21ctgttaccaa aaaatctgta cc 22<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>22agaagaagta taaaaaccat c 21
<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>23aaagaatcct agagagagaa agg 23<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>24ttttacatca atcgaaaa 18<210>25<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>25accaaaacct gtgttataac tcc 23<210>26<211>581<212>DNA<213>拟南芥属种(Arabidopsis sp.)<220>
<223>DHS<220>
<221>CDS<222>(1)..(579)
<400>26ggt ggt gtt gag gaa gat ctc ara aaa tgc ctt gca cct aca ttt aaa 48Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys1 5 10 15ggt gat ttc tct cta cct gga gct tat tta agg tca aag gga ttg aac 96Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn20 25 30cga att ggg aat ttg ctg gtt cct aat gat aac tac tgc aag ttt gag 144Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu35 40 45gat tgg atc att ccc atc ttt gac gag atg ttg aag gaa cag aaa gaa 192Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu50 55 60gag aat gtg ttg tgg act cct tct aaa ctg tta gca cgg ctg gga aaa 240Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys65 70 75 80gaa atc aac aat gag agt tca tac ctt tat tgg gca tac aag atg aat 288Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn85 90 95att cca gta ttc tgc cca ggg tta aca gat ggc tct ctt agg gat atg 336Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Arg Asp Met100 105 110ctg tat ttt cac tct ttt cgt acc tct ggc ctc atc atc gat gta gta 384Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val115 120 125caa gat atc aga gct atg aac ggc gaa gct gtc cat gca aat cct aaa 432Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys130 135 140aag aca ggg atg ata atc ctt gga ggg ggc ttg cca aag cac cac ata 480Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile145 150 155 160tgt aat gcc sat atg atg cgc aat ggt gca gat tac gct gta ttt ata 528Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile165 170 175aac acc ggg caa gaa ttt gat ggg agc gac tcg ggt gca cgc cct gat 576Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp
180185190gaa gc 581Glu<210>27<211>522<212>DNA<213>石竹属种(Dianthus sp.)<220>
<223>DHS<220>
<221>CDS<222>(3)..(521)<400>27ga aga tcc atc aag tgc ctt gca ccc act ttc aaa ggc gat ttt gcc47Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala1 5 10 15tta cca gga gct caa tta cgc tcc aaa ggg ttg aat cga att ggt aat 95Leu Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn20 25 30ctg ttg gtt ccg aat gat aac tac tgt aaa ttt gag gat tgg atc att 143Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile35 40 45cca att tta gat aag atg ttg gaa gag caa att tca gag aaa atc tta 191Pro Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile Leu50 55 60tgg aca cca tcg aag ttg att ggt cga tta gga aga gaa ata aac gat 239Trp Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn Asp65 70 75gag agt tca tac ctt tac tgg gcc ttc aag aac aat att cca gta ttt 287Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val Phe80 85 90 95tgc cca ggt tta aca gac ggc tca ctc gga gac atg cta tat ttt cat 335Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His100 105 110tct ttt cgc aat ccg ggt tta atc atc gat gtt gtg caa gat ata aga 383
Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg115 120 125gca gta aat ggc gag gct gtg cac gca gcg cct agg aaa aca ggc atg 431Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met130 135 140att ata ctc ggt gga ggg ttg cct aag cac cac atc tgc aac gca aac 479Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn145 150 155atg atg aga aat ggc gcc gat tat gct gtt ttc atc aac acc g 522Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr160 165 170<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>28ttgargaaga tycatmaart gcct24<210>29<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明引物<400>29ccatcaaayt cytgkgcrgt gtt 23<210>30<211>484<212>DNA<213>拟南芥属种(Arabidopsis sp.)<220>
<223>DHS
<220>
<221>CDS<222>(2)..(112)<400>30t gca cgc cct gat gaa gct gtg tct tgg ggt aaa att agg ggt tct gct 49Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala1 5 10 15aaa acc gtt aag gtc tgc ttt tta att tct tca cat cct aat tta tat 97Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr20 25 30ctc act cag tgg ttt tgagtacata tttaatattg gatcattctt gcaggtatac 152Leu Thr Gln Trp Phe35tgtgatgcta ccatagcctt cccattgttg gttgcagaaa catttgccac aaagagagac 212caaacctgtg agtctaagac ttaagaactg actggtcgtt ttggccatgg attcttaaag 272atcgttgctt tttgatttta cactggagtg accatataac actccacatt gatgtggctg 332tgacgcgaat tgtcttcttg cgaattgtac tttagtttct ctcaacctaa aatgatttgc 392agattgtgtt ttcgtttaaa acacaagagt cttgtagtca ataatccttt gccttataaa 452attattcagt tccaacaaaa aaaaaaaaaa aa 484<210>31<211>559<212>DNA<213>番茄属种(Lycopersicon sp.)<220>
<223>DHS<220>
<221>CDS<222>(1)..(156)<220>
<223>″n″ bases represent a，t，c，g，other or unknown<400>31ggt gct cgt cct gat gaa gct gta tca tgg gga aag ata cgt ggt ggt 48Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly1 5 10 15
gcc aag act gtg aag gtg cat tgt gat gca acc att gca ttt ccc ata 96Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile20 25 30tta gta gct gag aca ttt gca gct aag agt aag gaa ttc tcc cag ata 144Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile35 40 45agg tgc caa gtt tgaacattga ggaagctgtc cttccgacca cacatatgaa 196Arg Cys Gln Val50ttgctagctt ttgaagccaa cttgctagtg tgcagcacca tttattctgc aaaactgact 256agagagcagg gtatattcct ctaccccgag ttagacgaca tcctgtatgg ttcaaattaa 316ttatttttct ccccttcaca ccatgttatt tagttctctt cctcttcgaa agtgaagagc 376ttagatgttc ataggttttg aattatgttg gaggttggtg ataactgact agtcctctta 436ccatatagat aatgtatcct tgtactatga gattttgggt gtgtttgata ccaaggaaaa 496atgtttattt ggaaaacaat tggattttta atttaaaaaa aattgnttaa aaaaaaaaaa 556aaa 559<210>32<211>193<212>PRT<213>拟南芥属种(Arabidopsis sp.)<220>
<223>DHS<400>32Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys1 5 10 15Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn20 25 30Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu35 40 45Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu50 55 60
Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys65 70 75 80Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Ash85 90 95Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Arg Asp Met100 105 110Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val115 120 125Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys130 135 140Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile145 150 155 160Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile165 170 175Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp180 185 190Glu<210>33<211>173<212>PRT<213>石竹属种(Dianthus sp.)<220>
<223>DHS<400>33Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala Leu1 5 10 15Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu20 25 30Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro35 40 45Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile Leu Trp50 55 60
Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn Asp Glu65 70 75 80Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val Phe Cys85 90 95Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser100 105 110Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg Ala115 120 125Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met Ile130 135 140Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met145 150 155 160Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr165 170<210>34<211>37<212>PRT<213>拟南芥属种(Arabidopsis sp.)<220>
<223>DHS<400>34Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala1 5 10 15Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr20 25 30Leu Thr Gln Trp Phe35<210>35<211>52<212>PRT<213>番茄属种(Lycopersicon sp.)<220>
<223>DHS<400>35Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly1 5 10 15Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile20 25 30Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile35 40 45Arg Cys Gln Val50
权利要求
1.一种分离的编码衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶的DNA分子，其中，所述DNA分子能在高严格条件下与SEQ ID NO9的互补序列杂交，其前提是，所述DNA分子不具有SEQ ID NO5的序列。
2.一种编码衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶的分离的DNA分子，其中，其中所述DNA分子具有SEQ ID NO9的核苷酸序列。
3.一种由能在高严格条件下与SEQ ID NO9杂交的核苷酸序列所编码的分离的衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶。
4.如权利要求3的衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶，其中，所述脱氧海普赖氨酸合成酶具有SEQ ID NO10的氨基酸序列。
5.一种衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶的反义寡核苷酸，其中所述脱氧海普赖氨酸合成酶具有SEQ ID NO9的核苷酸序列，并且其中所述寡核苷酸在植物细胞中表达时抑制内源衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶基因的表达。
6.SEQ ID NO9的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸在植物细胞中表达时抑制内源衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶基因的表达。
7.如权利要求5或6的反义寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包括大约6-100个核苷酸。
8.如权利要求5或6的反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸互补于所述RNA转录物的5’非编码区的相应部分。
9.如权利要求5或6的反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸互补于所述RNA转录物的3’末端的相应部分。
10.如权利要求5或6的反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸互补于拟南芥属衰老诱导的DHS基因的3’末端。
11.如权利要求9的反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸互补于SEQ ID NO30。
12.一种用于转化植物细胞的载体，包括(a)权利要求6的反义核苷酸，和(b)可操作地连接于所述反义核苷酸序列上的调控序列。
13.一种用于转化植物细胞的载体，包括(a)权利要求5的反义核苷酸序列，和(b)可操作地连接于所述反义核苷酸序列上的调控序列。
14.如权利要求12或13的载体，其中，所述调控序列包括一个启动子和一个转录终止区。
15.如权利要求12或13的载体，其中，所述调控序列包括一个组成型启动子。
16.如权利要求12或13的载体，其中，所述调控序列包括一个植物组织专一性启动子。
17.如权利要求12或13的载体，其中，所述调控序列包括一个衰老诱导的植物启动子。
18.如权利要求12或13的载体，其中，所述调控序列包括一个病毒启动子。
19.如权利要求18的载体，其中，所述调控序列还包括一个组成型启动子。
20.一种用于转化植物细胞的载体，包括(a)一种编码衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子能在高严格条件下与SEQ ID NO9的互补序列杂交；和(b)可操作地与所述DNA分子连接的调控序列。
21.一种用于转化植物细胞的载体，包括(a)一种编码衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子具有SEQ ID NO9的核苷酸序列；和(b)可操作地与所述DNA分子连接的调控序列。
22.一种用权利要求13、20或21中任一项的载体转化过的细菌细胞。
23.一种用权利要求13、20或21中任一项的载体转化过的植物细胞。
24.一种抑制植物中内源衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶表达的方法，该方法包括(1)将权利要求12或13的载体整合到植物基因组中；和(2)生长所述植物，以便所述反义核苷酸序列被转录并且结合在由内源衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶基因编码的RNA序列上，从而抑制所述衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶基因的表达。
25.如权利要求24的方法，其中，所述反义核苷酸序列互补于SEQ IDNO30。
26.如权利要求24的方法，其中，所述抑制会导致植物衰老的改变。
27.如权利要求24的方法，其中，所述抑制会导致所述植物对环境胁迫诱导的和/或病原体诱导的衰老的抗性的增强。
28.如权利要求24的方法，其中，所述抑制会导致所述植物生物量的增加。
29.如权利要求24的方法，其中，所述抑制会导致所述植物果实变软和腐烂的推迟。
30.如权利要求24的方法，其中，所述抑制会导致所述植物种子产量的增加。
31.如权利要求24的方法，其中，所述调控序列包括能在所述植物中起作用的组成型启动子。
32.如权利要求24的方法，其中，所述调控序列包括能在所述植物中起作用的组织专一性启动子。
33.如权利要求24的方法，其中，所述调控序列包括能在所述植物中起作用的衰老诱导的启动子。
34.如权利要求24的方法，其中，所述植物选自下列一组结实植物、显花植物、蔬菜、农业作物和林木。
35.如权利要求24的方法，其中，所述植物是番茄。
36.如权利要求24的方法，其中，所述植物是显花植物。
37.一种抑制植物细胞中内源衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶基因表达的方法，该方法包括(1)将权利要求20或21的载体整合到植物的至少一个细胞的基因组中；和(2)生长所述植物，以便所述脱氧海普赖氨酸合成酶基因DNA分子超量表达，并且由外源衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶抑制内源衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶基因。
38.如权利要求37的方法，其中，所述调控序列包括一种组成型启动子。
39.一种改变植物的与年龄相关的衰老和/或与环境胁迫相关的衰老的方法，该方法包括(1)将权利要求12或13的载体整合到植物基因组中；和(2)生长所述植物，以便所述反义核苷酸序列被转录并且结合在由内源衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶基因编码的RNA序列上，从而抑制所述衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶基因的表达。
40.一种转基因植物细胞，包括权利要求13、20、21中任一项的载体或所述载体的组合。
41.一种质粒，含有能在原核宿主中起作用的复制系统和权利要求5或6的反义寡核苷酸或多核苷酸。
42.一种质粒，含有能在农杆菌属起作用的复制系统，和权利要求5或6的反义寡核苷酸或多核苷酸。
43.一种提高植物种子产量的方法，所述方法包括(1)将权利要求12或13的载体整合到植物基因组中；和(2)生长所述植物，以便所述反义核苷酸序列被转录并且结合在由内源衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶基因编码的RNA序列上，从而抑制所述衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶基因的表达。
全文摘要
通过将编码衰老诱导的脱氧海普赖氨酸合成酶、衰老诱导的eIF－5A的基因或基因片段或它们二者沿反义方向整合到植物基因组中，实现了对植物程序性细胞死亡的表达，包括衰老的调控。鉴定了编码衰老诱导脱氧海普赖氨酸合成酶和衰老诱导的eIF－5A的植物基因，并将每一种基因的核苷酸序列单独和组合用于改变转基因植物的衰老。
文档编号C12N7/00GK1624135SQ20041009620
公开日2005年6月8日 申请日期2000年7月6日 优先权日1999年7月6日
发明者J·E·汤普森, T·-W·王, D·L·卢 申请人:森尼斯科公司