专利名称：B淋巴细胞刺激因子抑制肽及其筛选、制备方法
技术领域：
本发明涉及一种小肽及其筛选、制备方法，本发明尤其涉及一种B淋巴细胞刺激因子(BLyS)抑制性小肽及其筛选、制备方法。
背景技术：
系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)及干燥综合征(Sjgren′s syndrom，SS)是三种患病率较高的、严重威胁人类健康的自身免疫性疾病(以我国为例，SLE患病率为0.07％，女性约为0.1％；RA患病率为0.32％～0.36％；SS患病率为0.3％～0.7％，但在老年人群中患病率可高达3％～4％)。迄今为止，关于三种疾病的治疗措施主要是使用抗炎药物及免疫抑制剂，同时结合对症处理的一般性治疗。对于RA还可视情况采取滑膜切除或关节置换等外科手术治疗。但总体来讲，目前尚无特效疗法。因此，为几种疾病寻找特效治疗方法一直是有关这些疾病研究中的一个热点和难点问题。BLyS的发现及其作用的研究为上述热点和难点问题的解决带来了新的希望。
BLyS又称为BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family，TNF家族的B细胞活化因子)、TALL-1(TNF-and apoptosis ligand-related leukocyte expressedligand 1，TNF和凋亡配体相关的白细胞表达配体1)、THANK(TNF homologue thatactivates apoptosis，NF-κB and JNK，诱导凋亡并活化NF-κB和JNK的TNF同源物)、zTNF4等。该分子于1999年被发现和克隆，它是TNF超家族的一个新成员，其属II型跨膜蛋白，N端在胞内，C端在胞外。BLyS有膜结合型和可溶性两种形式，二者的生物学活性基本一致。人BLyS全长为285个氨基酸，其中47-73氨基酸为跨膜区，74-285氨基酸为胞外区，133-285氨基酸为其发挥功能的主要区域。BLyS可以以胞外区可溶片段形式存在，其生物学活性与全长膜结合蛋白基本一致。
BLyS主要表达于髓样单核细胞系，其不仅广泛参与调节B细胞发育和分化以及抗体的产生，而且最近发现其还广泛参与T细胞的活化和应答过程。另外，人的BLyS不仅可活化人B细胞，而且可使小鼠的B细胞活化。
BLyS单体是一含9个保守β-片层的结构，和其它许多TNF超家族成员一样，寡聚化形成同源三聚体形式表现活性。BLyS作为一种配体蛋白，通过与其受体结合而发挥其生物学作用。目前已发现的表达于B细胞膜上的BLyS受体至少有三个，它们是TACI(transmembrane activator and cyclophilin ligand interactor，跨膜激活剂和环孢素配体相互作用物)、BCMA(B cell maturation antigen，B细胞成熟抗原)及BR3(BLyS receptor3，BLyS受体3)。而关于表达于T细胞膜上的BLyS受体，目前仅发现了TACI，是否还有其它受体的存在，尚不完全清楚。
近年诸多研究表明，BLyS过表达在某些自身免疫性疾病的发病中起着独特的作用。目前已发现的证据主要有1.在SLE病人，血清中sBLyS水平明显升高，其与抗-双链DNA抗体的滴度呈正相关，血清中的BLyS能在体外刺激B细胞活化。BLyS转基因鼠可出现严重的B细胞增多症和典型的SLE样改变。
2.在RA病人，血清中sBLyS水平明显升高，且与病人RA因子滴度呈正相关。同时RA病人关节滑膜液中的sBLyS水平也升高，其与关节局部的病理损伤有关。
3.在SS(该综合征以重症唾液腺炎、唾液分泌减少、颌下腺破坏为特征)病人，血清中sBLyS水平明显升高，而且在发炎的唾液腺中，BLyS的表达水平明显上调。在BLyS转基因鼠，可出现SS样改变。
4.体外和动物体内实验证实，BLyS的可溶性受体(通常与抗体的Fc段融合)既可抑制人B细胞NF-κB的激活和免疫球蛋白的产生，也可阻断T细胞活化。在SLE模型鼠，给予BLyS的可溶性受体后，可使动物蛋白尿程度明显减轻，同时能延长动物的存活时间。在RA模型鼠，给予BLyS的可溶性受体后能使炎症大大减轻，同时能明显抑制骨和软骨的破坏以及疾病的发展。
5.抗-BLyS抗体可通过中和sBLyS或封闭(或空间位阻)膜结合型BLyS的功能位点而抑制B细胞活化和多种抗体的产生。
由于SLE、RA和SS等是同时涉及B、T淋巴细胞过度活化的自身免疫性疾病，而BLyS又同时参与了B、T淋巴细胞的过度激活，因而设法阻断BLyS的生物学活性，则可使两种淋巴细胞的活化受抑，从而有可能为上述多种自身免疫性疾病的治疗和复发预防提供新的(乃至特效的)方法和药物。
如前所述，经体外或动物实验证实，该类策略是行之有效的。目前阻断BLyS生物学作用的制剂主要有两类，即BLyS的可溶性受体(通常与抗体的Fc段融合)和抗-BLyS抗体。另外，只能结合BLyS受体而不能活化淋巴细胞的BLyS突变体也有可能被用作BLyS的竞争抑制剂(只是目前尚缺乏有力实验证据)。在人类，抗-BLyS抗体已于2001年进入临床前试验，用以治疗BLyS功能亢进相关的自身免疫性疾病，目前已进入二期临床。然而以上这三类可能的BLyS抑制分子较大，制备和纯化相对不便，甚至在应用时有可能出现副作用，如与抗体Fc段融合的可溶性受体，由于Fc段的存在，有可能引起不必要的生物学效应，从而使制剂的作用效率降低。对于抗-BLyS抗体，在用于人体时，需使用人源化抗体，否则将会导致人抗异源性抗体反应，甚至过敏反应。然而，相应人源化抗体的制备费用高、难度大。因此，如果能将BLyS抑制剂的分子小型化，同时使其制备和纯化更加方便，则将使相应制剂在医学研究和临床实践中的实用性大大提高。
噬菌体呈现技术于1985年首先由Smith发明，在1988年由Parmley和Smith提出构建噬菌体随机肽库的设想，而在1990年则由三个研究小组构建并成功筛选了噬菌体肽库，从而标志着噬菌体肽库技术的诞生。噬菌体肽库的基本原理是将随机肽段的DNA序列插人到噬菌体衣壳蛋白的基因组，插入的DNA经噬菌体表达以后，以线性肽展示在噬菌体衣壳蛋白上，肽段与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白而呈现于噬菌体表面，并利用噬菌体能大量复制的特点，得到不同重组噬菌体的多个拷贝，而不影响噬菌体的侵染与扩增能力。这一技术使基因型与表型得以巧妙地结合，从而为不同的研究提供了有利工具。
生物大分子之间的相互作用，实质上是功能位点间的相互作用，并不需要整个分子的完全接触，BLyS与其受体间的相互作用以及BLyS与抗-BLyS抗体间的相互作用也都不例外。因此，只要能找到受体分子或封闭性抗体分子上与BLyS结合的肽序列(或模拟肽序列，即功能相同或相似，但氨基酸组成不同的肽序列)，就可利用相应肽(或模拟肽)来竞争性或封闭性抑制BLyS与淋巴细胞膜上的受体相结合，进而达到抑制BLyS活化B、T淋巴细胞的目的。
在噬菌体随机肽库中恰恰包含了极大量的、在氨基酸组成或序列上相互有差异的小肽，这些小肽呈现于噬菌体表面，它们可以在序列上充当或模拟生物大分子间相互作用的功能位点。噬菌体随机肽库技术的优势在于其筛选通量大，操作简便，从库中既可筛选到代表蛋白质功能位点的真实肽序列或模拟肽序列，也可筛选到模拟非蛋白质功能位点的肽序列。
目前已经商品化的噬菌体随机肽库最常用的是由美国New England Biolabs公司(简称NEB)在M13噬菌体基础上开发的噬菌体文库，M13噬菌体是一种溶源性噬菌体，它只感染而不裂解宿主菌，最终以分泌蛋白的形式排出，宿主菌保持其原有的活性，并不断分泌扩增的噬菌体。M13噬菌体电镜下呈长丝状结构，长约1μm，直径600-700nm，其基因组为一单链环状DNA，由6407个核苷酸组成，共编码10种蛋白，其中5种为病毒颗粒的结构蛋白。NEB公司通过分子生物学的手段在M13噬菌体的次要衣壳蛋白p3的基因中插入外源片段以表达外源蛋白，插入的外源基因表达后呈现于噬菌体P3蛋白的N端。NEB公司的产品包括7肽库，12肽库，环7肽库三种文库，其中前面两种属于非构象型肽库，第三种是一个构象型肽库。两类肽库的区别主要在于构象型肽库是将两个半胱氨酸的核苷酸序列加于随机肽DNA序列的两端，二硫键能够相结合成环从而使呈现的肽段形成具有功能活性的空间结构，进而模拟天然分子的相互作用；而非构象约束型肽库所呈现的肽段则为线形，则不使所呈现的随机肽形成二硫键。基于肽库筛选的基本原则，我们的研究选用构象型肽库，这将更加有利于筛选出与靶分子具有高亲和力的小肽。
研究显示，噬菌体呈现型小肽作用的发挥，有时涉及到了目的序列临近的噬菌体衣壳蛋白中的氨基酸残基。因此，噬菌体呈现型小肽与人工合成的相应游离小肽有时在功能上并不能完全吻合，所以必须对人工合成的游离小肽再次进行功能鉴定。另外，噬菌体呈现型小肽因有噬菌体成分的存在，不能用于在体研究，也就是说，只有对所筛选到的噬菌体呈现型小肽进行人工合成后才具有真正的开发和应用价值。
基于以上现有情况，为了克服目前BLyS的抑制剂的不足之处，如果能借助噬菌体随机肽库技术、人工合成肽技术以及免疫学功能试验以BLyS来筛选构象型肽库，筛选、鉴定并合成前述具有抑制人BLyS功能的小肽，将为进一步研发针对BLyS的新型抑制剂奠定基础，从而对B淋巴细胞相关的自身免疫性疾病的治疗有相当的帮助。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有以下氨基酸序列的小肽分子P-M-K-M-R-T-M，脯氨酸-甲硫氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-苏氨酸-甲硫氨酸；或Y-E-P-K-I-R-G，酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-精氨酸-甘氨酸。
本发明所提供的一种小肽分子与BlyS的结合具有高亲和力，能够与BLyS特异结合并抑制其活性，同时也能够拮抗重组BLyS肽段刺激淋巴细胞增殖的活性。
本发明的另一目的在于提供一种本发明的小肽分子的制备方法，采用Fmoc固相合成法合成本发明所述的小肽分子。
本发明的再一目的在于提供一种B淋巴细胞刺激因子抑制肽的筛选方法。
为实现本发明的目的，提供一种本发明小肽分子的制备方法，包括以下步骤①用Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团对氨基酸的α-氨基进行保护，通过一个支臂将其连结到一个不溶性高分子树脂支持物载体上，随后用哌啶碱基将α-氨基脱保护，去除Fmoc的保护性，洗涤氨基酸—支臂—树脂；②将预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接到氨基酸—支臂—树脂，然后重复进行脱保护、洗涤、耦联，直到得到目的肽；③最后将肽—支臂—树脂裂解，经树脂切割和脱保护后，对合成小肽进行纯化。
本发明具P-M-K-M-R-T-M序列的小肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤①用9-芴甲氧羰基基团对脯氨酸的α-氨基进行保护，通过一个支臂将其连结到一个不溶性高分子树脂支持物载体上，随后用哌啶碱基将α-氨基脱保护，去除Fmoc的保护性，用二氯甲烷溶液洗涤氨基酸—支臂—树脂；②将预先活化的α-氨基保护的甲硫氨酸通过耦联反应连接到氨基酸—支臂—树脂，然后进行脱保护、洗涤；③重复②，对预先活化的α-氨基保护的赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、苏氨酸、和甲硫氨酸依次进行耦联，直到得到具P-M-K-M-R-T-M序列的小肽；最后将肽—支臂—树脂裂解，经树脂切割和脱保护后，对合成小肽进行纯化。本发明的小肽也可以用其他的合成方法制备得到。
本发明具Y-E-P-K-I-R-G序列的小肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤①用9-芴甲氧羰基基团对酪氨酸的α-氨基进行保护，通过一个支臂将其连结到一个不溶性高分子树脂支持物载体上，随后用哌啶碱基将α-氨基脱保护，去除Fmoc的保护性，用二氯甲烷溶液洗涤氨基酸—支臂—树脂；②将预先活化的α-氨基保护的谷氨酸通过耦联反应连接到氨基酸—支臂—树脂，然后进行脱保护、洗涤；③重复②，对预先活化的α-氨基保护的脯氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、精氨酸、和甘氨酸依次进行耦联，直到得到具Y-E-P-K-I-R-G序列的小肽；最后将肽—支臂—树脂裂解，经树脂切割和脱保护后，对合成小肽进行纯化。
人工合成本发明所述的小肽后对其进行抑制淋巴细胞增殖的检测显示，它们与BlyS的结合具有高亲和力，并且能够拮抗重组BLyS肽段(rhBLyS112-285)刺激淋巴细胞增殖的活性。
本发明同时提供一种B淋巴细胞刺激因子抑制肽的筛选方法，包括以下步骤①将B淋巴细胞刺激因子，即BLyS，与噬菌体肽库孵育，然后洗脱特异结合噬菌体并扩增；②重复上述操作进行2-5次亲和筛选，得到与BLyS亲和力较高的一个噬菌体集合；③确定特异结合噬菌体的DNA序列即得该抑制肽。
优选的，用重组的人可溶性BLyS胞外区112到285氨基酸片段，即rhBLyS112-285，筛选人噬菌体构象型7肽库。
优选的，本发明所述的一种B淋巴细胞刺激因子抑制肽的筛选方法包括以下步骤①将重组的人可溶性BLyS胞外区112到285氨基酸片段，即rhBLyS112-285，加到培养皿或其他容器中培养，经洗涤后加入人噬菌体构象型7肽库孵育；②经TBS/Tween20洗涤、HCl-Gly和牛血清白蛋白缓冲液解离洗脱和Tris-HCl中和缓冲液中和后，从培养皿或其他容器中收集特异结合噬菌体，扩增后用于下一轮的筛选，用同样方法共进行2-5轮亲和筛选；③对筛选得到的单克隆噬菌体进行扩增，通过DNA测序结果推导出BLyS的结合肽序列，并对其抑制淋巴细胞增殖的情况进行检测后，即可确定该抑制肽。
其中，在洗涤时，用1-5mL/L的TBS/Tween20洗涤6-10次，在第二轮及其后的筛选中Tween20的浓度为5mL/L。
其中，洗脱时用pH值为2.2的0.2mol/L的HCl-Gly洗脱缓冲液在室温下解离5-10min；用140-160μL pH值为8.9-9.3的1mol/L Tris-HCl中和缓冲液进行中和。
更优选的，本发明的制备方法包括以下步骤①将100-200mg/L的rhBLyS112-285加到培养皿或其他容器中培养，经1-5mL/L的TBS/Tween20洗涤7-8次后，加入8-12μL人噬菌体构象型7肽库，于室温轻摇吸附30-60min；
②洗脱特异结合噬菌体，经1-5mL/L的TBS/Tween20洗涤6-10次后，加入1mL pH值为2.2的0.2mol/L HCl-Gly洗脱缓冲液和1g/L的牛血清白蛋白，室温解离5-10min，再加入140-160μL pH值为8.9-9.3的1mol/L Tris-HCl中和缓冲液，中和并收集，重复进行3轮亲和筛选；③对筛选得到的单克隆噬菌体进行扩增，通过DNA测序结果推导出BLyS的结合肽序列，并对其抑制淋巴细胞的增殖进行检测后，即可确定该抑制肽。
最优选的，本发明的制备方法包括以下步骤①将1.5ml 100-200mg/L的rhBLyS112-285加到全塑培养皿或其他聚苯乙烯容器中，4℃过夜，弃蛋白液，加入5g/L牛血清白蛋白室温封闭1-2h。
经1-5mL/L的TBS/Tween20洗涤6-10次后，加入8-12μL人噬菌体构象型7肽库，其中含2×1011噬菌体病毒颗粒，于室温轻摇吸附30-60min。
②洗脱特异结合噬菌体，经1-5mL/L的TBS/Tween20洗涤6-10次后，加入1mL pH值为2.2的0.2mol/L HCl-Gly洗脱缓冲液和1g/L的BSA，室温解离5-10min，再加入140-160μL pH值为8.9-9.3的1mol/L Tris-HCl中和缓冲液，中和并收集，重复进行3轮亲和筛选。
③从所得到的噬菌体集合中分离出单个的噬菌体单克隆，并对其与BlyS的结合活性进行ELISA实验、竞争抑制实验鉴定，观察阳性噬菌体克隆抑制BLyS与淋巴细胞结合的情况，对能够抑制BlyS促进淋巴细胞增殖活性的阳性噬菌体进行DNA测序，并分析对比序列。
本发明的小肽在联合作用时的抑制效应强于各自单独作用，这可能是由于BLyS结合和活化B、T细胞涉及其多个功能位点，联合应用多个不同的功能位点结合小肽或功能位点封闭小肽，能够增强小肽抑制BLyS的功能。
这种拮抗肽的获得为小肽型BLyS抑制剂的研发奠定了基础，通过动物实验、体外活性试验和临床试验证明，该小肽可作为BLyS的抑制肽用于制备治疗BLyS相关疾病的药物，从而可以用来治疗系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)及干燥综合征(Sjgren′s syndrom，SS)等BLyS相关的疾病，可以作为防治BlyS相关疾病的新型候选分子。
本发明所述的BLyS抑制性小肽具备以下优点1.本发明的小肽能够阻断BLyS的生物学活性，因而可使两种淋巴细胞的活化受抑，应用于临床将能够竞争性(或封闭性)地抑制BLyS与淋巴细胞上受体的结合，达到抑制BLyS活化B、T淋巴细胞的目的，从而为进一步研发针对BLyS的小肽型抑制剂创造了条件。
由于SLE、RA和SS等是同时涉及B、T淋巴细胞过度活化的自身免疫性疾病，而BLyS又同时参与了B、T淋巴细胞的过度激活，从而本发明的小肽为发展防治BLyS功能亢进相关的SLE、RA和SS等多种自身免疫性疾病的新型制剂提供候选对象，可为上述多种自身免疫性疾病的治疗和复发预防提供新的(乃至特效的)方法和药物。
2.本发明的小肽与现有的阻断BLyS生物学作用的三类可能制剂(BLyS的可溶性受体、抗-BLyS抗体以及只结合BLyS受体而不活化淋巴细胞的BLyS突变体)相比通过筛选噬菌体构象型肽库获得的BLyS结合小肽的人工合成和纯化简便，容易实现规模化生产，同时在合成时可加入非天然氨基酸改进和提高小肽的某些特性。因为用于产生前三类制剂的原核与真核细胞都只能使用20种天然氨基酸，所以这是前三类制剂无法做到的。
3.本发明的小肽分子小，渗透能力强，容易到达全身各组织和器官；同时小肽在肾脏的蓄积少，不易引起毒副作用，使用相对较为安全。所得到的游离小肽的免疫原性极低，一般不会引起抗小肽的免疫应答。
图1为YG-克隆60-DNA测序2为PM-克隆67-DNA测序3为阳性噬菌体克隆与BLyS结合活性的ELISA鉴定图4为阳性噬菌体克隆的竞争抑制ELISA鉴定图5为阳性噬菌体对BLyS增殖淋巴细胞功能的抑制作用图6为合成的小肽对BLyS增殖淋巴细胞功能的抑制作用具体实施方式
实施例1一.以BLyS为靶分子筛选噬菌体构象型肽库1、噬菌体肽库的亲和筛选
①将1.5ml 100mg/L的rhBLyS112-285加到全塑培养皿中，4℃过夜。弃蛋白液，加入5g/LBSA(牛血清白蛋白)室温封闭1h。
②经1mL/L的TBS/Tween20洗涤8次后，加入10μL人噬菌体构象型7肽库(含2×1011病毒颗粒)，人噬菌体构象型7肽库包括宿主菌ER2738，购自NewEngland Biolabs公司，于室温轻摇吸附55min。
其中TBS缓冲液的配方为Tris-HCl 50mmol/L，NaCl150mM/L。
③经1mL/L的TBS/Tween20洗涤7次后，加入1mLpH值为2.2的0.2mol/LHCl-Gly(甘氨酸)洗脱缓冲液和1g/L的BSA，室温解离7min，再加入150μLpH值为9.1的1mol/L Tris-HCl中和缓冲液，中和并收集。
其中的Tris为tris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷。
④收集噬菌体测定滴度，扩增后用于下一轮的筛选。
2、单克隆噬菌体的扩增①以第3轮筛选所获噬菌体按不同稀释度铺板(LB/IPTG/X-Gal琼脂平板)，从克隆数小于100的平板上挑取蓝斑加入到对数期的ER2738细菌(本次筛选所选用的噬菌体文库的特异宿主菌)中，以200-300r/min振摇培养4-5h。
②离心取上清，加入PEG8000/NaCl沉淀过夜，离心弃上清再沉淀，溶于PBS(Phosphate-buffered saline，一种磷酸盐缓冲液，每1000ml PBS中含有NaCl 8g，KCl0.2g，Na2HPO4·7H2O0.5g，KH2PO40.2g，pH7.4)中，测定各单克隆噬菌体的滴度。
③为了得到与rhBLyS112-285具有高亲和力结合的噬菌体，以rhBLyS112-285为目标分子，在噬菌体环7肽库中进行亲和筛选，共进行3轮亲和筛选。在第二轮筛选中将Tween20的浓度由1mL/L加大为3mL/L，洗涤次数增加至10次。经筛选后，回收率(指在每一轮亲和筛选中，洗脱下来的噬菌体克隆与投入筛选的噬菌体克隆数之比)从8.5×10-4增加到2.1×10-2，说明噬菌体得到有效的富集(表1)。
表1BLyS高亲和力结合噬菌体的富集
二.鉴定BLyS的结合肽亲和筛选中回收的噬菌体均是与筛选配基牢固结合且能耐受漂洗过程的克隆。因此具有一定的特异性和亲和力。亲和筛选中，即使经过多轮筛选，也不能排除非特异性结合噬菌体克隆的存在，因而进一步挑取单个克隆，确定它与筛选靶分子的特异性吸附是实验必不可少的步骤。ELISA(enzyme linked immunosorbent assay酶联免疫吸附实验)能够半定量测定筛选靶分子与噬菌体克隆间的结合常数，是较为常用的方法。采用牛血清白蛋白作为对照，避免了由于噬菌体用量过大和洗涤强度不够所可能造成的假阳性。
1.阳性克隆的ELISA鉴定将rhBLyS112-285(20mg/L)加入到96孔酶标板中，每孔200μL，在湿盒中于4℃过夜。次日弃蛋白液，每孔加入200μL20g/L脱脂奶粉室温封闭1h。
将扩增的单克隆噬菌体上清(约含1×1012病毒颗粒)分别与等体积的20g/L脱脂奶粉混匀，室温孵育30min后，加至酶标板的各孔中(每孔100μL)，于室温轻摇吸附1h。
经PBST洗5次后，加HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗M13抗体(抗M13噬菌体的抗体，HRP酶标小鼠抗M13单抗，购自Pharmacia公司)(100μL/孔)室温孵育1h，用PBST洗6次后，加邻苯二胺(OPD)(100μL/孔)显色，以酶标仪(奥地利Tecan公司Sunrise酶标仪)读取A492nm值(吸光度为492nm时的数值)。每个单克隆噬菌体均以PBS包被对照孔，同时设第一次亲和筛选未与rhBLyS112-285结合的噬菌体作为阴性噬菌体对照，其余操作相同。
从第3轮筛选噬菌体的平板中，挑取80个噬菌体克隆，扩增后铺板测定其滴度。用ELISA鉴定各噬菌体单克隆与rhBLyS112-285的结合活性，每个单克隆噬菌体以不含蛋白的包被液包被对照孔，阴性对照噬菌体(negative control phage，NP)为第一次筛选的未结合的阴性噬菌体。结果表明，15个克隆可与rhBLyS112-285产生高亲和力结合，而与不含蛋白的包被液无结合反应(A492nm值P/N≥2，见图3)。
2.噬菌体克隆的竞争ELISA鉴定包被rhBLyS112-285并封闭(方法同上)。
将rhBLyS112-28550mg/L与已鉴定的各阳性噬菌体(约含1×1012病毒颗粒)等体积混合，37℃孵育1h，加入96孔酶标板各孔中(每孔100μL)，于室温轻摇吸附1h。
经PBST洗5次后，加HRP标记的抗M13抗体(100μL/孔)，室温孵育1-2h。
加OPD(100μL/孔)显色，以酶标仪读取A492nm值。对照孔加入未与rhBLyS112-285孵育的相同数量的噬菌体颗粒，其余操作均相同。
以rhBLyS112-285竞争抑制噬菌体与包被rhBLyS112-285的结合，来判断噬菌体与rhBLyS112-285结合的特异性，对照孔加入未与rhBLyS112-285预先结合的噬菌体。结果表明，15个ELISA鉴定阳性的克隆中，与rhBLyS112-285的预先结合能够阻断12个克隆与包被rhBLyS112-285的结合(以A492nm值P/N≥2为阳性噬菌体，见图4)。
3.阳性噬菌体的测序将扩增筛选所得阳性噬菌体克隆用PEG8000/NaCl沉淀，提取噬菌体单链DNA，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送交上海生物工程技术有限公司进行测序。对筛选得到的12个阳性噬菌体克隆进行序列分析后，发现3组序列，其中一组有7个相同的克隆，另一组有3个相同的克隆，最后一组有2个相同的克隆。在GenBank数据库中检索BLyS的3个受体均未发现与上述3组同源的序列。
对筛选得到的噬菌体克隆提取单链DNA，M13噬菌体单链DNA抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。进行DNA测序使用的是双脱氧测序法，是由上海生物工程公司所完成。
三.噬菌体克隆抑制淋巴细胞增殖的检测用淋巴细胞分离液分离正常人外周血淋巴细胞，用RPMI1640培养液(用于体外培养淋巴细胞的一种液体，购于GIBCO公司)将淋巴细胞配成105/L的悬液，按每孔200μL细胞悬液加入96孔圆底细胞培养板中，于37℃、50mL/L CO2条件下培养。
将5μg/μL rhBLyS112-285与三个噬菌体克隆不同数目(分别为0、1010、1011、1012及1013个病毒颗粒)的噬菌体混合后，37℃孵育1-2h，加入到细胞培养板中，每组设两个复孔，继续培养14h。
然后按20μL/孔加入MTT(噻唑蓝，MTT可作用于活细胞，生成的黑蓝色产物与细胞的代谢程度成正比，用于分析细胞增生水平)溶液(5g/L)，8h后离心弃培养液，每孔加入150μL的DMSO(二甲基亚枫)振荡15-20min，用酶标仪于波长570nm测定光吸收(A)值。对照组为经ELISA检测证实不与rhBLyS112-285结合的阴性噬菌体，同时设单加噬菌体或细胞组，以RP MI1640培养液作为空白对照。
加入的rhBLyS112-285在未与噬菌体克隆预先结合时，均有刺激淋巴细胞增殖的活性。结果表明，对照的无关噬菌体对rhBLyS112-285刺激细胞增殖的活性无明显影响。在3个克隆中，克隆1对rhBLyS112-285刺激细胞增殖的活性无明显影响；克隆2、克隆3随着加入噬菌体颗粒数目的增多，对rhBLyS112-285刺激细胞增殖的活性的抑制作用增强(见图5)。单独加入噬菌体颗粒组则与细胞独立生长组无明显差异(结果略)，说明噬菌体颗粒能够抑制rhBLyS112-285刺激淋巴细胞增殖的活性。
其中能够抑制BlyS促进淋巴细胞增殖的克隆2序列为P-M-K-M-R-T-M，克隆3序列为Y-E-P-K-I-R-G，参考图1.YG-克隆60-DNA测序图和图2.PM-克隆67-DNA测序图。
四.人工合成小肽及对其抑制淋巴细胞的增殖进行检测1、人工合成小肽将具有抑制作用的两条噬菌体呈现型小肽的氨基酸序列交由上海博亚生物技术公司，采用Fmoc固相合成法，在肽合成仪上合成相应游离小肽，经树脂切割和脱保护后，对合成小肽进行纯化，然后测定其浓度。
2、人工合成小肽对抑制淋巴细胞增殖的检测用淋巴细胞分离液分离正常人外周血淋巴细胞，用RPMI1640培养液将淋巴细胞配成105/L的悬液，按每孔200μL细胞悬液加入96孔圆底细胞培养板中，于37℃、50mL/L CO2条件下培养。
将5μg/μL rhBLyS112-285与小肽不同浓度混合后，37℃孵育1h，加入到细胞培养板中，每组设三个复孔，继续培养14h。
然后按20μL/孔加入MTT溶液(5g/L)，8h后离心弃培养液，每孔加入150μL的DMSO振荡15min，用酶标仪于波长570nm测定光吸收(A)值。以未溶解小肽的溶液为对照，同时设单加小肽细胞组，以RPMI1640培养液作为空白对照。
合成的两个小肽均为HPLC95％以上纯度，命名为P-A和P-B。加入的rhBLyS112-285在未与小肽预先结合时，均有刺激淋巴细胞增殖的活性。结果表明，P-A随着加入浓度的增高，对rhBLyS112-285刺激细胞增殖的活性的抑制作用增强；P-B对rhBLyS112-285刺激细胞增殖的活性抑制作用相对较弱；当P-A和P-B同时加入时对rhBLyS112-285刺激细胞增殖的活性抑制作用高于P-A和P-B单独加入(见图6)。单独加小肽组则与细胞独立生长组无明显差异，说明小肽是在与BlyS片段先相互作用的前提下发挥作用的，如果不与BlyS预先作用对淋巴细胞未见明显影响(结果略)，说明小肽与rhBLyS112-285的预先结合抑制了rhBLyS112-285刺激淋巴细胞增殖的活性。
实施例2一.以BLyS为靶分子筛选噬菌体构象型肽库1、噬菌体肽库的亲和筛选①将120mg/L的rhBLyS112-285加到聚苯乙烯容器中，4℃过夜。弃蛋白液，加入5g/LBSA(牛血清白蛋白)室温封闭1h。
②经1mL/L的TBS/Tween20洗涤9次后，加入10μL人噬菌体构象型7肽库(含2×1011病毒颗粒)，人噬菌体构象型7肽库包括宿主菌ER2738，购自NewEngland Biolabs公司，于室温轻摇吸附60min。
其中TBS缓冲液的配方为Tris-HCl 50mmol/L，NaCl150mM/L。
③经1mL/L的TBS/Tween20洗涤6次后，加入1mLpH值为2.2的0.2mol/LHCl-Gly(甘氨酸)洗脱缓冲液和1g/L的BSA，室温解离8min，再加入150μLpH值为9.1的1mol/L Tris-HCl中和缓冲液，中和并收集。
其中的Tris为tris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷。
④收集噬菌体测定滴度，扩增后用于下一轮的筛选。
重复以上步骤共进行5轮亲和筛选，在后4轮筛选中将Tween20的浓度由1mL/L加大为3mL/L。洗涤次数增加至10次。
其余的操作同实施例1。
实施例3一.以BLyS为靶分子筛选噬菌体构象型肽库1、噬菌体肽库的亲和筛选①将150mg/L的rhBLyS112-285加到聚苯乙烯容器中，4℃过夜。弃蛋白液，加入5g/LBSA(牛血清白蛋白)室温封闭1h。
②经1mL/L的TBS/Tween 20洗涤10次后，加入10μL人噬菌体构象型7肽库(含2×1011病毒颗粒)，人噬菌体构象型7肽库包括宿主菌ER2738，购自NewEngland Biolabs公司，于室温轻摇吸附50min。
其中TBS缓冲液的配方为Tris-HCl 50mmol/L，NaCl150mM/L。
③经1mL/L的TBS/Tween 20洗涤9次后，加入1mLpH值为2.2的0.2mol/LHCl-Gly(甘氨酸)洗脱缓冲液和1g/L的BSA，室温解离6min，再加入150μLpH值为9.1的1mol/L Tris-HCl中和缓冲液，中和并收集。
其中的Tris为tris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷。
④收集噬菌体测定滴度，扩增后用于下一轮的筛选。
重复以上步骤共进行3轮亲和筛选，在后两轮筛选中将Tween20的浓度由1mL/L加大为4mL/L。洗涤次数增加至10次。
其余的操作同实施例1。
实施例4一.以BLyS为靶分子筛选噬菌体构象型肽库1、噬菌体肽库的亲和筛选①将200mg/L的rhBLyS112-285加到聚苯乙烯容器中，4℃过夜。弃蛋白液，加入5g/LBSA(牛血清白蛋白)室温封闭2h。
②经1mL/L的TBS/Tween20洗涤7次后，加入10μL人噬菌体构象型7肽库(含2×1011病毒颗粒)，人噬菌体构象型7肽库包括宿主菌ER2738，购自NewEngland Biolabs公司，于室温轻摇吸附30min。
其中TBS缓冲液的配方为Tris-HCl 50mmol/L，NaCl150mM/L。
③经1mL/L的TBS/Tween20洗涤10次后，加入1mL pH值为2.2的0.2mol/LHCl-Gly(甘氨酸)洗脱缓冲液和1g/L的BSA，室温解离5min，再加入150μL pH值为9.1的1mol/L Tris-HCl中和缓冲液，中和并收集。
其中的Tris为tris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷。
④收集噬菌体测定滴度，扩增后用于下一轮的筛选。
重复以上步骤共进行4轮亲和筛选，在后3轮筛选中将Tween20的浓度由1mL/L加大为5mL/L。洗涤次数增加至10次。
其余的操作同实施例1。
实施例5一.以BLyS为靶分子筛选噬菌体构象型肽库l、噬菌体肽库的亲和筛选①将180mg/L的rhBLyS112-285加到聚苯乙烯容器中，4℃过夜。弃蛋白液，加入5g/LBSA(牛血清白蛋白)室温封闭2h。
②经1mL/L的TBS/Tween 20洗涤6次后，加入10μL人噬菌体构象型7肽库(含2×1011病毒颗粒)，人噬菌体构象型7肽库包括宿主菌ER2738，购自NewEngland Biolabs公司，于室温轻摇吸附40min。
其中TBS缓冲液的配方为Tris-HCl 50mmol/L，NaCl 150mM/L。
③经1mL/L的TBS/Tween20洗涤8次后，加入1mLpH值为2.2的0.2mol/LHCl-Gly(甘氨酸)洗脱缓冲液和1g/L的BSA，室温解离10min，再加入150μLpH值为9.1的1mol/L Tris-HCl中和缓冲液，中和并收集。
其中的Tris为tris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷。
④收集噬菌体测定滴度，扩增后用于下一轮的筛选。
重复以上步骤共进行5轮亲和筛选，在后4轮筛选中将Tween 20的浓度由1mL/L加大为5mL/L。洗涤次数增加至10次。
其余的操作同实施例1。
权利要求
1.一种小肽分子，其特征在于，具有如下氨基酸序列P-M-K-M-R-T-M或Y-E-P-K-I-R-G。
2.权利要求1所述的一种小肽分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤①用9-芴甲氧羰基基团对氨基酸的α-氨基进行保护，通过一个支臂将其连接到一个不溶性高分子树脂支持物载体上，随后用哌啶碱基将α-氨基脱保护，去除Fmoc的保护性，洗涤氨基酸—支臂—树脂；②将预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接到氨基酸—支臂—树脂，然后重复进行脱保护、洗涤、耦联，直到得到目的肽；最后将肽—支臂—树脂裂解，经树脂切割和脱保护后，对合成小肽进行纯化。
3.根据权利要求2所述的一种小肽分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤①用9-芴甲氧羰基基团对脯氨酸的α-氨基进行保护，通过一个支臂将其连结到一个不溶性高分子树脂支持物载体上，随后用哌啶碱基将α-氨基脱保护，去除Fmoc的保护性，用二氯甲烷溶液洗涤氨基酸—支臂—树脂；②将预先活化的α-氨基保护的甲硫氨酸通过耦联反应连接到氨基酸—支臂—树脂，然后进行脱保护、洗涤；③重复②，对预先活化的α-氨基保护的赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、苏氨酸、和甲硫氨酸依次进行耦联，直到得到具P-M-K-M-R-T-M序列的小肽；最后将肽—支臂—树脂裂解，经树脂切割和脱保护后，对合成小肽进行纯化。
4.根据权利要求2所述的一种小肽分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤①用9-芴甲氧羰基基团对酪氨酸的α-氨基进行保护，通过一个支臂将其连结到一个不溶性高分子树脂支持物载体上，随后用哌啶碱基将α-氨基脱保护，去除Fmoc的保护性，用二氯甲烷溶液洗涤氨基酸—支臂—树脂；②将预先活化的α-氨基保护的谷氨酸通过耦联反应连接到氨基酸—支臂—树脂，然后进行脱保护、洗涤；③重复②，对预先活化的α-氨基保护的脯氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、精氨酸、和甘氨酸依次进行耦联，直到得到具Y-E-P-K-I-R-G序列的小肽；最后将肽—支臂—树脂裂解，经树脂切割和脱保护后，对合成小肽进行纯化。
5.一种B淋巴细胞刺激因子抑制肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤①将B淋巴细胞刺激因子，即BLyS，与噬菌体肽库孵育，然后洗脱特异结合噬菌体并扩增；②重复上述操作进行2-5次亲和筛选，得到与BLyS亲和力较高的一个噬菌体集合；③确定特异结合噬菌体的DNA序列即得该抑制肽。
6.根据权利要求5所述的一种B淋巴细胞刺激因子抑制肽的筛选方法，其特征在于，用重组的人可溶性BLyS胞外区112到285氨基酸片段，即rhBLyS112-285，筛选人噬菌体构象型7肽库。
7.根据权利要求5所述的一种B淋巴细胞刺激因子抑制肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤①将重组的人可溶性BLyS胞外区112到285氨基酸片段，即rhBLyS112-285，加到培养皿或其他容器中培养，经洗涤后加入人噬菌体构象型7肽库孵育；②经TBS/Tween 20洗涤、HCl-Gly和牛血清白蛋白缓冲液洗脱解离和Tris-HCl中和缓冲液中和后，从培养皿或其他容器中收集特异结合噬菌体，扩增后用于下一轮的筛选，用同样方法共进行2-5轮亲和筛选；③对筛选得到的单克隆噬菌体进行扩增，通过DNA测序结果推导出BLyS的结合肽序列，并对其抑制淋巴细胞的增殖进行检测后，即可确定该抑制肽。
8.根据权利要求5所述的一种B淋巴细胞刺激因子抑制肽的筛选方法，其特征在于，在洗涤时，用1-5mL/L的TBS/Tween20洗涤6-10次，在第二轮及其后的筛选中Tween 20的浓度为5mL/L。
9.根据权利要求5所述的一种B淋巴细胞刺激因子抑制肽的筛选方法，其特征在于，洗脱时用pH值为2.2的0.2mol/L的HCl-Gly洗脱缓冲液在室温下解离5-10min；用140-160μL pH值为8.9-9.3的1mol/L Tris-HCl中和缓冲液进行中和。
10.根据权利要求5-9的任意一种所述的一种B淋巴细胞刺激因子抑制肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤①将100-200mg/L的rhBLyS112-285加到培养皿或其他容器中培养，经1-5mL/L的TBS/Tween 20洗涤7-8次后，加入8-12μL人噬菌体构象型7肽库，于室温轻摇吸附30-60min；②洗脱特异结合噬菌体，经1-5mL/L的TBS/Tween 20洗涤6-10次后，加入1mL pH值为2.2的0.2mol/L HCl-Gly洗脱缓冲液和1g/L的牛血清白蛋白，室温解离5-10min，再加入140-160μL pH值为8.9-9.3的1mol/L Tris-HCl中和缓冲液，中和并收集，重复进行3轮亲和筛选；③对筛选得到的单克隆噬菌体进行扩增，通过DNA测序结果推导出BLyS的结合肽序列，并对其抑制淋巴细胞的增殖进行检测后，即可确定该抑制肽。
全文摘要
本发明公开了一种小肽分子，具有如下氨基酸序列P－M－K－M－R－T－M或Y－E－P－K－I－R－G。同时还公开了其制备方法，该方法以B淋巴细胞刺激因子为靶分子筛选噬菌体肽库，得到与B淋巴细胞刺激因子特异结合小肽并确定其序列，然后人工合成相应小肽。该小肽可用于制备治疗B淋巴细胞刺激因子相关疾病的药物。
文档编号C12Q1/68GK1781936SQ20041009663
公开日2006年6月7日 申请日期2004年12月3日 优先权日2004年12月3日
发明者何凤田, 吉清, 郑英如 申请人:中国人民解放军第三军医大学