专利名称：检测含鸟嘌呤的dna的电化学方法及利用其的防伪认证方法
技术领域：
本发明涉及基于DNA分子参与的电化学反应的传感和检测技术，即通过电化学反应系统使DNA分子因为杂交导致的电化学信号得以传输和检测。由于DNA分子序列的特殊性质，该技术尤其直接涉及基因序列在防伪认证领域的应用。具体地说，本发明涉及一种检测含鸟嘌呤的DNA的电化学方法及利用其的防伪认证方法。
背景技术：
基于DNA分子参与的电化学反应的传感和检测技术，即通过电化学反应系统使DNA分子因为杂交导致的电化学信号得以传输和检测，例如基于鸟嘌呤被催化氧化的原理。该原理为鸟嘌呤是四种碱基中最容易被氧化的基团，在适当的电子传递媒介体(如Ru(bpy)32+)存在下，鸟嘌呤能被催化氧化，而其余三种碱基则不能被氧化(Napter，M.E.，Thorp，H.H.，Langmuir，1997，13，6342-6344.)。电子传递媒介体Ru(bpy)32+，是钌与2，2’-联吡啶的配合物，在这儿作为在一定电压特异性地催化氧化DNA序列中鸟嘌呤。其反应为(1)(2)由于将捕获探针上的鸟嘌呤均为类似物次黄嘌呤取代，次黄嘌呤可以和鸟嘌呤一样与胞嘧啶配对，但是不能被Ru(bpy)33+催化氧化。因此，根据有无电化学变化来检测分析样品中是否具有该含鸟嘌呤的待检DNA。但这种方法用于DNA检测有一定的局限性，主要是杂质干扰很难排除，不适合与实际样品(如血样)的检测。
众所周知，DNA(即脱氧核糖核酸)从化学组成来看，是由AGTC四种碱基组成的具有高度复杂性的一段序列。由于DNA序列中每个位点都是四种碱基之一，根据组合数学知识，一段具有一定长度的DNA序列可能具有非常大数目的组合方式。例如，简单计算表明，一段17碱基的DNA序列，其组合方式高达160亿种。因此，当基因序列达到一定数目之后，其组合方式之多达到了几乎无法穷举的地步。正因为这样，我们可能利用基因的这种高度序列复杂性来实现基于基因密码的防伪认证。可以设想，我们在需要防伪保护的物品上标记一段仅仅是10多个碱基的DNA序列，就可能实现一个无法用现在的破译技术解密的防伪标记。而通过DNA传感技术，我们又可以方便地把这段序列阅读出来。
现在，防伪认证技术已经成为社会迫切要求的一项高端技术。我们可以看到，从假冒伪劣食品、药品的检验，到防伪文件认证、艺术品防伪等等都迫切需要一项具有高度防伪能力的新技术。美国的Clelland首先提出把DNA作为一种防伪标记。他们通过把一段信息隐藏在DNA序列中，然后通过PCR(polymerase chain reaction)和测序技术把这段标记序列阅读出来，从而实现防伪认证。然而由于PCR测序等生物技术耗时长、成本高，目前这一技术只能局限在对艺术品、纪念品等应用方面。
DNA生物传感器则提供了一种新型的检测方法。DNA传感分析技术检测快速，而且基于DNA分子杂交的传感检测技术准确性也较PCR扩增为高。用电化学方法进行DNA生物传感器则除了快速灵敏之外，检测成本也非常低廉，因而受到了研究者的关注(Drummond，T.G.，M.G.Hill，and J.K.Barton，Electrochemical DNA sensors.Nat.Biotechnol.，2003.21p.1192-1199；Fan，C.，K.W.Plaxco，and A.J.Heeger Electrochemical interrogation of conformationalchanges as a reagentless method for the sequence-specific detection of DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，2003.100p.9134-9137；Boon，E.M.，et al.，Mutation detection by electrocatalysis at DNA-modified electrode.Nat.Biotechnol.，2000.18p.1096-1100.)。在我们的以前工作中，曾提出用基于DNA标记技术的E-DNA生物传感器作为基因访问认证的方法(Heeger，A.J.，Fan，C.，Plaxco，K.W.，U.S.Application No.10/678,760)。但现对无标记的电化学的传感检测方法而言，其检测成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题即为克服上述缺陷，解决上述课题，提供一种新型的用于检测含鸟嘌呤的DNA的电化学方法及利用其的防伪认证方法。
本发明解决上述技术问题的方案之一为一种检测含鸟嘌呤的DNA的电化学方法，其包括制备或选择捕获探针步骤，其中该捕获探针序列中所有鸟嘌呤均以次黄嘌呤代替，其还包括下列步骤1)将该捕获探针固定在磁性微粒表面，再将其予以磁性分离；将待检样品加入固定有捕获探针的磁性微粒中，如果该样品中含有靶向待检的含鸟嘌呤的DNA，该待检DNA与捕获探针相配对结合，从而使待检含鸟嘌呤的DNA从样品中富集和分离于磁性微粒上；2)将该磁性微粒置于浓度至少为0.1M的金属无机盐溶液中，并加入电化学电解池中，在该电化学电解池的工作电极下放置可吸附磁性微粒的磁体；3)在上述金属无机盐溶液中加入电子传递媒介体Ru(bpy)32+以催化氧化鸟嘌呤，利用电化学检测方法检测分析出该待检含鸟嘌呤的DNA。
其中，该步骤1)中将该捕获探针固定在磁性微粒表面是通过分别用能特异性结合的受体或供体包覆磁性微粒和标记该捕获探针，并将该磁性微粒和捕获探针相混合而实现。
上述磁性微粒与捕获探针的比例较佳的为1mg磁性微粒∶1～10nmol/L捕获探针。
该捕获探针最好在供体或受体标记端设有间隔序列以降低磁珠的表面效应和空间位阻，以提高核酸捕获的效率。
其中，该间隔序列较佳的为5～20个胸腺嘧啶。
而该步骤2)所说的金属无机盐可以是氯化钠、硝酸钠、硫酸钠、醋酸钠、碳酸钠、高氯酸钠或其相应钾盐、或氯化镁等，其在溶液中的浓度一般为0.1～2M、较佳浓度为0.5～2M，其作用为提供至少0.1M的离子强度以保证DNA杂交过程的进行。本发明中所说的金属无机盐溶液不仅仅指其单纯水溶液，还包括含有其的缓冲溶液，较佳的是pH值为5～9的缓冲溶液。
该步骤3)中Ru(bpy)32+在溶液中的浓度较佳为1～100uM。
所说的电化学检测方法为循环伏安法或交流伏安法、线性扫描伏安法、方波伏安法、示差脉冲伏安法等。
本发明通过供体与受体之间的高度特异性将核酸捕获探针固定到磁性微粒表面。这种探针可特异性地结合目标待检单链寡聚核苷酸，从而可实现其对互补单链核苷酸片段的高效快速分离和富集。在待测样品溶液中加入捕获探针标记的磁性微粒中，按碱基互补配对的原则，修饰在磁性微粒表面的核苷酸探针可与待测的互补DNA片段选择性结合，将互补DNA片段富集在磁性微粒的表面，在一定的外磁场作用下实现富集互补DNA片段的DNA富集器与溶液的分离。
然后观测电化学检测认证信号。本发明可使用常规电化学电解池，其工作电极放置在电化学电解池底部，其反应面朝上，工作电极可为碳电极、导电玻璃(ITO)电极、金属电极、半导体电极等无特殊要求。磁体放置在工作电极下方。由于磁场作用，磁珠被吸到电极表面。而Ru(bpy)32+在这儿作为电子传递媒介体，在一定电压(一般≤1.5V)特异性地催化氧化DNA序列中鸟嘌呤。由于捕获探针上的鸟嘌呤均为类似物次黄嘌呤取代，次黄嘌呤可以和鸟嘌呤一样与胞嘧啶配对，但是不能被Ru(bpy)33+催化氧化。因此，检测情况会有如下两种结果A)在捕获到基因认证探针时，由于探针序列中含有一个以上的鸟嘌呤，可以被Ru(bpy)33+催化氧化，可以在电化学循环伏安法中看到特征性的催化氧化峰或电流出现，即氧化峰电流与还原峰电流的比值大于1，这表示样品中具有该含鸟嘌呤的待检DNA；B)如果样品中不具有该含鸟嘌呤的待检DNA，磁性微粒不能捕获到特定探针序列，而磁性微粒上的捕获序列也不带有鸟嘌呤，因而不能看到特征性的催化氧化峰或电流，而只有对应于Ru(bpy)32+的本底电流，即氧化峰与还原峰是对称的一对峰，其电流的比值为1。显然，根据上述电化学反应原理，上述循环伏安法可换用交流伏安法、线性扫描伏安法、方波伏安法或示差脉冲伏安法等，均可得到两种不同的检测结果以分析检测出样品中是否具有含鸟嘌呤的待检DNA。
本发明的另一技术方案为一种DNA电化学防伪认证方法，其包括下列步骤1)将包含至少一个鸟嘌呤的DNA防伪认证标记固定于需防伪认证的物品上；2)需认证时从步骤1)中的物品上采集防伪认证标记作为待测样品；3)利用上述的检测含鸟嘌呤的DNA的电化学方法对步骤2)中采集的标记进行防伪认证。
其中，该步骤1)中的DNA防伪认证标记的序列长度为5～100个碱基，标记种类为1～n种，n为任意自然数序列，具体选用几种则取决于认证产品的要求。序列可以通过计算机选择或人工选择，当然目前一般均通过计算机选择，然后通过固相合成的方式用DNA合成仪合成出这些DNA序列作为DNA防伪认证标记(基因认证探针)。
而将DNA认证标记可按常规方法固定在需要防伪认证的产品上。认证产品包括重要信函、文件，字画等艺术品，纪念品，保健品，药片与药剂，酒类、烟类的防伪标签等。固定方法包括物理吸附、包埋和化学键合等。例如方法一、将含基因认证探针的溶液滴加在物品、纸张表面的特定位置，然后晾干或烘干；方法二、将基因认证探针溶解在墨水中，然后用这种特殊墨水书写或打印在纸张、标签上；方法三、将基因认证探针直接溶解在药剂或酒类中。当然，固定方法并不仅限于这几种方法。通过这些方法，可实现对物品或产品的防伪标记。
至于在基因认证标记的采集步骤中，可针对不同需要认证的物品或产品，用合适的方法将基因认证标记溶出。例如，对纸张、标签类，则将其上含有基因认证标记的特定位置切下并剪碎，然后用适量溶液，如上述金属无机盐溶液浸泡，浸出液作为待检样品；对药片等固体，研磨成粉末后用上述盐溶液浸泡，然后过滤，滤液作为待检样品。
对该待检样品进行防伪认证，结果有两种在电化学循环伏安法中看到特征性的催化氧化峰或电流出现，即氧化峰电流与还原峰电流的比值大于1，则表示该物品或产品是经过正确标记的；而如果物品或产品是未经基因认证探针标记或标记为假时，则只有对应于Ru(bpy)32+的本底电流，即氧化峰与还原峰是对称的一对峰，其电流的比值为1。
本发明是一种无标记的电化学的传感检测技术，实现了DNA杂交的电学信号输出，进一步降低了检测成本，且可用于少量DNA的检测，选择性佳，因此，其为基因(DNA)防伪认证技术的普及应用奠定了基础；另外，本发明是一种即时检测技术，其尤可适用于基于DNA序列识别的安全保卫和反恐领域。
图1为应用本发明测得的循环伏安图。其中，实线图为Ru(bpy)32+的本底信号，虚线图为检测到认证探针后的催化氧化信号。
具体实施例方式
下面用具体实施例结合附图来进一步说明本发明检测DNA的电化学方法的工作流程，以及其应用功效。
下列实施例中的材料及装置为试验用待检目的DNA序列5’-AGT CGG AAT CAG GCC TAG-3’；捕获探针序列为5’-biotin-T(15)-CTA IIC CTI ATT CCI ACT-3’，其中I为次黄嘌呤；不配对任意序列5’-ACA TCC CAT TTT TAC CAG TGC-3’电化学电解池、电化学工作站(CHI 660型，CH公司)未特殊注明的为常规市售产品。
实施例1将市售链亲和素包覆的磁珠(购于Promega公司，磁珠直径1μm左右)按其要求用0.5×SSC缓冲液洗涤三次后与生物素标记的人工合成寡核苷酸链(捕获探针)混合(1.25nmol/L捕获探针1mg磁珠)，轻微振动20分钟，利用亲和素和生物素的高度特异性结合(Kd＝10-15M)将DNA探针固定在磁性粒子上，磁性分离并用95μL TTA(250mM Tris-HCl，0.1％Tween 20 and 5％BSA)洗涤磁珠两次。磁珠中加入45μL杂交液((750mM NaCl，150mMSodium citrate)，然后加入能与生物素标记的捕获探针发生杂交反应的待检目的DNA序列，反应20分钟，将目的DNA片段富集在磁性微粒的表面，在一定的外磁场作用下实现富集互补DNA片段的DNA富集器与溶液的分离。
将以上收集的磁珠放入0.5mL含有1M(mol/L)NaCl、pH7.0、50mM的磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后加到电化学电解池中。工作电极放置在电化学电解池底部，其反应面朝上，工作电极为碳电极。磁铁放置在工作电极下方。由于磁场作用，磁珠被吸到电极表面。在上述溶液中加入Ru(bpy)32+，至其在溶液中的浓度为25uM，在0～1.35V进行循环伏安扫描，扫描速率25mV/s，记录图谱，如图1所示虚线图。
实施例2
将磁珠与捕获探针以1nmol/L捕获探针1mg磁珠相混合，上述收集的磁珠放入0.5mL含有0.1mol/L MgCl2、pH5.0、50mM PBS中，再加入能与生物素标记的捕获探针发生杂交反应的待检目的DNA序列，然后加到电化学电解池中，工作电极为导电玻璃电极，加入Ru(bpy)32+至其浓度为1uM，余同实施例1，其结果如图1所示虚线图。
实施例3将磁珠与捕获探针以10nmol/L捕获探针1mg磁珠相混合，上述收集的磁珠放入0.5mL含有2mol/L KCl、pH9.0、50mM PBS中，再加入能与生物素标记的捕获探针发生杂交反应的待检目的DNA序列，然后加到电化学电解池中，工作电极为金属电极，加入Ru(bpy)32+至其浓度为100uM，余同实施例1，其结果如图1所示虚线图。
实施例4将磁珠与捕获探针以5nmol/L捕获探针1mg磁珠相混合，上述收集的磁珠放入0.5mL 0.5mol/L KNO3溶液中，再加入能与生物素标记的捕获探针发生杂交反应的待检目的DNA序列，然后加到电化学电解池中，工作电极为半导体电极，加入Ru(bpy)32+至其浓度为10uM，余同实施例1，其结果如图1所示虚线图。
实施例5换用不能与生物素标记的捕获探针发生杂交反应的不配对任意DNA序列，余同实施例1，其结果如图1所示实线图。
上述实施例仅以循环伏安法来具体说明，但本发明并不受其限制，本领域技术人员很容易根据其原理换用其它电化学检测方法；而金属盐溶液则可换用其他能提供至少0.1M离子强度的溶液，在此就不再一一赘述。
应用实施例1将试验用待检目的DNA序列作为基因认证探针，将含该基因认证探针的溶液滴加在信函上的特定位置，然后晾干。通过邮局寄出，在收回信函后，把含有基因认证标记特定位置切下并剪碎，然后用适量盐水(1mol/L的氯化钠)浸泡15分钟，浸出液备用。
再用实施例1的方法对浸出液进行检测，其结果如图1所示虚线图。
应用实施例2将上述基因认证探针溶在墨水中，用该墨水在文件上签名。然后同上法将签名文件处理，并用实施例1的方法对浸出液进行检测，其结果如图1所示虚线图。
应用实施例3将上述基因认证探针溶解在一瓶保健品(黄金搭档)中。取1ml溶液稀释10倍后，同应用实施例1法进行认证检测，其结果如图1所示虚线图。
权利要求
1.一种检测含鸟嘌呤的DNA的电化学方法，其包括制备或选择捕获探针步骤，其中该捕获探针序列中所有鸟嘌呤均以次黄嘌呤代替，其特征在于其还包括下列步骤1)将该捕获探针固定在磁性微粒表面，再将其予以磁性分离；将待检样品加入固定有捕获探针的磁性微粒中，如果该样品中含有靶向待检的含鸟嘌呤的DNA，该待检DNA与捕获探针相配对结合，从而使待检含鸟嘌呤的DNA从样品中富集和分离于磁性微粒上；2)将该磁性微粒置于浓度至少为0.1M的金属无机盐溶液中，并加入电化学电解池中，在该电化学电解池的工作电极下放置可吸附磁性微粒的磁体；3)在上述金属无机盐溶液中加入电子传递媒介体Ru(bpy)32+以催化氧化鸟嘌呤，利用电化学检测方法检测分析出该待检含鸟嘌呤的DNA。
2.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于该步骤1)中将该捕获探针固定在磁性微粒表面是通过分别用能特异性结合的受体或供体包覆磁性微粒和标记该捕获探针，并将该磁性微粒和捕获探针相混合而实现。
3.根据权利要求2所述的电化学方法，其特征在于该磁性微粒与捕获探针相混合的比例为1mg磁性微粒∶1～10nmol/L捕获探针。
4.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于该捕获探针在供体或受体标记端设有间隔序列。
5.根据权利要求4所述的电化学方法，其特征在于该间隔序列为5～20个胸腺嘧啶。
6.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于该步骤2)中所说的金属无机盐为氯化钠、硝酸钠、硫酸钠、醋酸钠、碳酸钠、高氯酸钠或其相应钾盐、或氯化镁，其在溶液中的浓度为0.5～2M，该溶液为pH值为5～9的缓冲溶液。
7.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于该步骤3)中所说的Ru(bpy)32+在溶液中的浓度为1～100uM。
8.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于该步骤3)中所说的电化学检测方法为循环伏安法。
9.一种DNA电化学防伪认证方法，其包括下列步骤1)将包含至少一个鸟嘌呤的DNA防伪认证标记固定于需防伪认证的物品上；2)需认证时从步骤1)中的物品上采集防伪认证标记作为待测样品；3)利用权利要求1～8任一项所述的检测含鸟嘌呤的DNA的电化学方法对步骤2)中采集的标记进行防伪认证。
10.根据权利要求9所述的DNA电化学防伪认证方法，其特征在于该步骤1)中的DNA防伪认证标记的序列长度为5～100个碱基，标记种类为1～n种，n为任意自然数。
全文摘要
本发明公开一种检测含鸟嘌呤的DNA的电化学方法，其包括制备或选择序列中所有鸟嘌呤均以次黄嘌呤代替的捕获探针步骤，其还包括下列步骤1)将该捕获探针固定在磁性微粒表面，再予以磁性分离；将待检样品加入固定有捕获探针的磁性微粒中，如该待检DNA与捕获探针相配对结合，则使待检DNA从样品中富集和分离于磁性微粒上；2)将该磁性微粒置于加有浓度至少为0.1M金属无机盐、pH值为5～9的缓冲溶液中，并加入工作电极下放置磁体的电化学电解池中；3)在上述缓冲溶液中加入Ru(bpy)
文档编号C12Q1/68GK1734263SQ20041009929
公开日2006年2月15日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者樊春海, 张治洲 申请人:中国科学院上海应用物理研究所