针对丙型肝炎病毒e1e2复合体的抗体、hcv颗粒的组合物和药物组合物的制作方法

专利名称：针对丙型肝炎病毒e1e2复合体的抗体、hcv颗粒的组合物和药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗HCV的新构象(conformational)抗体以及更特别地涉及单克隆抗体。本发明还涉及易于(liable)被所述抗体识别的颗粒的组合物，以及涉及包含它们的药物组合物。本发明还涉及HCV有包膜的亚病毒颗粒或纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒，以及制备它们的方法。
丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎和肝硬化的主要原因，并且可导致肝细胞癌。世界范围内约200百万人慢性感染HCV，这种疾病已经作为一种严重的全球健康问题显现出来。HCV是一种有包膜的RNA病毒，属于黄病毒科的肝炎病毒属。其基因组是9.6kb正极性单链RNA，具有作为内部核糖体进入位点起作用的5’非翻译区(UTR)，编码大约3,000个氨基酸的多蛋白(polyprotein)的单一可读框以及3′UTR(Bartenschlager等，2000)。这种多蛋白在翻译同时和之后通过宿主细胞肽酶切割产生包括核心蛋白及包膜糖蛋白E1和E2的结构蛋白，以及通过病毒蛋白酶产生非结构蛋白(NS)2-5B(Bartenschlager等，2000)。与相关的正链RNA病毒类似，通过负链RNA中间体的方式发生复制并且由NS蛋白催化，其形成质膜附着的复制酶复合体。
患者血浆样品中存在的HCV颗粒的水平低以及缺乏支持有效HCV复制或颗粒装配的细胞培养系统妨碍了表征与病毒体相关的糖蛋白。当前关于HCV包膜糖蛋白的知识是基于利用病毒或非病毒表达载体的细胞培养物瞬时表达试验。这些研究已经显示了E1和E2糖蛋白相互作用形成复合体(Dubuisson，2000中的综述)。存在非离子去污剂时，检测到两种形式的E1E2复合体通过非共价相互作用稳定的E1E2异二聚体和异质的二硫键连接的聚集物，后者被认为代表错误折叠的复合体。以前，通过用合成肽或重组抗原免疫已经获得了包膜糖蛋白特异性抗体。然而，构象敏感性E2反应性单克隆抗体(mAb)(H2)-其识别被认为是HCV糖蛋白异二聚体的天然萌芽前(prebudding)形式的非共价连接的E1E2异二聚体-不与血清来源的HCV RNA阳性颗粒反应(Deleersnyder等，1997)。此外，WO 92/07001公开了通过用从感染的黑猩猩中提取的HCV颗粒制剂免疫小鼠而制备的抗体，然而这些抗体未曾在天然HCV颗粒(即，源自感染患者)上进行测试。此外，WO00/05266公开了从感染患者B细胞制备的抗体，然而这些抗体是根据它们结合重组E2蛋白的能力选择的。因此，所有这些抗体的应用都有限，或者用于诊断目的，或者用于治疗或预防目的，因此它们是用非天然HCV或其部分生产或选择的，而且未显示出可与天然HCV颗粒相互作用。
缺乏含有足够量和浓度的天然有包膜的HCV颗粒的HCV制剂，是迄今为止无法获得易于识别天然HCV颗粒的抗体的原因之一。实际上，血浆样品中低水平的HCV颗粒使表征和显现观察这种病毒变得困难。先前已经显示了在感染的急性期从自然感染患者的血浆中回收的病毒在蔗糖中具有大约1.06g/ml的浮力密度(Hijikata等，1993)。相比之下，体外复制后从细胞培养物中回收的HCV在蔗糖中具有1.12g/ml的浮力密度(Yoshikura等，1996)。最后，从慢性感染个体中回收的HCV在蔗糖中具有大约1.17g/ml的浮力密度(Hijikata等，1993)。血清来源病毒的低密度归因于其结合血清低密度脂蛋白(Thomssen等，1992)。已经显示高密度病毒与抗原-抗体复合物中结合到病毒的抗体有关(Kanto等，1995)。尽管有这些数据，但是仍然没有表明这些不同HCV群的蛋白组成，以及是否低密度级分(＜1.0g/ml)含有包膜、RNA和核壳作为完整病毒体。
因此，本发明的一个目的是提供与天然HCV颗粒反应的抗体。
本发明的另一方面是提供天然HCV颗粒的组合物，其量和浓足以允许有效免疫抗体产生动物。
本发明的另一方面是提供缺乏感染性，易于用作药物组合物的活性物质的特定HCV组合物。
发明详述本发明涉及能特异性结合天然HCV病毒包膜的构象抗体。
措辞“构象抗体”指识别具有由其分子环境所限定的三维结构的表位的抗体。
措辞“特异性结合”意思是抗体结合到基本上仅在形成天然HCV病毒包膜的元件之一上发现的表位，也就是说，基本上不存在抗体与除形成天然HCV包膜的元件外的元件的结合。例如，可通过本领域技术人员公知的方法检验抗体的结合特异性，如Western印迹实验，其中生物样品在凝胶上通过电泳迁移，然后转移到膜上并且与所述抗体共孵育，其然后通过二抗检测。如果实质上所检测的所有电泳条带都含有靶化合物或其部分，则称所述抗体“特异性结合”所述生物样品中包含的靶化合物。
“HCV”意思是“丙型肝炎病毒”，其具体描述于Choo等(1989，1991)中。HCV特别地包括RNA、由核心蛋白构成的衣壳以及包含脂质和蛋白特别是糖蛋白的包膜。
“HCV病毒包膜”由脂质和蛋白特别是糖蛋白如HCV蛋白E1和E2构成(Clarke，1997)。
“天然的”意思是HCV，或其部分，是如同在生物样品中发现的，可能地是如同从生物样品中分离的以及-如果需要的话-纯化的。这种样品可以是感染HCV的患者的血液、血浆或者血清。特别地，“天然的”指HCV，或其部分，其不是通过重组方法，或者通过使用细胞系或动物生产的，并且不同于在例如Schalich等(1996)，Blanchard等，(2002)或WO 92/07001中所描述的HCV元件。
本发明更特别地涉及能特异性结合天然HCV E2蛋白的构象抗体。
HCV E2特别地描述于Dubuisson(2000)和Op De Beeck等(2001)中。其作为多蛋白(3012个氨基酸)产生，经过切割产生E2(384到714位氨基酸)。
措辞“特异性结合”意思是抗体结合基本上仅在HCV E2蛋白上发现的表位，或其部分。特别地，在其中抗体-E2复合物与其它蛋白共同存在的竞争试验中，不能将该抗体从HCV E2蛋白上脱离下来。
措辞“天然HCV E2蛋白”意思是该蛋白是如同在感染HCV患者的生物样品中发现的，特别地天然HCV E2蛋白不是重组蛋白。
本发明涉及如上所定义的构象抗体，其能够中和患者中的HCV感染。
“中和HCV感染”意思是该抗体能够改善感染HCV患者的健康，例如，可通过血液、血浆或血清中检测到的HCV的减少得到证实，或者该抗体能预防个体被HCV感染。
可在模型动物中监测所述抗体中和HCV感染的能力，如黑猩猩或小鼠，特别是人源化小鼠，其慢性感染HCV，或者其在所述抗体存在时首先感染(primo-infected)HCV。所监测的抗体应当能够分别诱导减少HCV相关的病毒血症或者预防HCV感染。
本发明涉及如上所定义的构象抗体，能够沉淀在其共价或非共价形式下的HCV E1E2复合体。
HCV E1E2复合体可以是非共价的，也就是说，E1和E2通过弱键的方式结合，如氢键，离子键，范德瓦耳斯键或疏水键；或所述复合体可以是共价的，也就是说E1和E2通过共价键的方式结合，例如二硫键。在Deleersnyder等(1997)中特别地描述或提出了E1E2复合体的共价和非共价形式。
“沉淀”意思是抗体可致使HCV E1E2复合体不溶。例如可根据Dubuisson和Rice(1996)所述发生沉淀。
本发明涉及如上所定义的构象抗体，能够特异性结合天然HCV E1蛋白。
特别地在Dubuisson(2000)和Op De Beeck等(2001)中描述了HCV E1。其作为多蛋白产生(3012个氨基酸)，经过切割产生E1(192到383位氨基酸)。
措辞“特异性结合”意思是抗体结合基本上仅在HCV E1蛋白上发现的表位，或其部分。特别地在其中抗体-E1复合物与其它蛋白一起存在的竞争试验中，不能将该抗体从HCV E1蛋白上脱离下来。
措辞“天然HCV E1蛋白”意思是蛋白如在感染HCV患者的生物样品中发现的，特别是该天然HCV E1蛋白不是重组蛋白。
本发明更具体地涉及构象抗体，能够特异性结合天然HCV E1蛋白，结合天然HCV E2蛋白，并且能沉淀在其共价或非共价形式下的HCVE1E2复合体。
本发明涉及如上所定义的构象抗体，能够特异性结合由至少下列序列之一构成的表位HCV蛋白E1的297到306位氨基酸；HCV蛋白E2的480到494位氨基酸；HCV蛋白E2的613到621位氨基酸。
根据本发明的抗体能够结合-呈现(presenting)包含HCV蛋白E1的297到306位氨基酸的肽的分子，对应以下序列RHWTTQGCNC(SEQ ID NO1)；和/或-呈现包含HCV蛋白E2的480到494位氨基酸的肽的分子，对应以下序列PDQRPYCWHYPPKPC(SEQ ID NO2)；和/或-呈现包含HCV蛋白E2的613到621位氨基酸的肽的分子，对应以下序列YRLWHYPCT(SEQ ID NO3)可通过合成含有任何前述序列的肽以及通过本领域技术人员公知的方法例如ELISA或EIA测定抗体结合所述合成肽的能力，检验所述抗体与至少一种前述序列的结合。
首字母缩略词“ELISA”意思是酶联免疫吸附测定。
首字母缩略词“EIA”意思是酶免疫测定。
本发明涉及如上所定义的构象抗体，能够特异性结合由下列序列中的每一个构成的表位HCV蛋白E1的297到306位氨基酸；HCV蛋白E2的480到494位氨基酸；HCV蛋白E2的613到621位氨基酸。
根据本发明的抗体能够结合呈现表位的分子，所述的表位包含
-包含HCV蛋白E1的297到306位氨基酸的肽，对应下列序列RHWTTQGCNC(SEQ ID NO1)；和-包含HCV蛋白E2的480到494位氨基酸的肽，对应下列序列PDQRPYCWHYPPKPC(SEQ ID NO2)；和-包含HCV蛋白E2的613到621位氨基酸的肽，对应下列序列YRLWHYPCT(SEQ ID NO3)。
可通过本领域技术人员公知的方法，例如ELISA或EIA，通过测定抗体结合一种分子，特别是包含序列RHWTTQGCNC(SEQ ID NO1)的蛋白，结合一种分子，特别是包含序列PDQRPYCWHYPPKPC(SEQ ID NO2)的蛋白，以及结合一种分子，特别是包含序列YRLWHYPCT(SEQ ID NO3)的蛋白的能力，检验所述抗体与包含每种前述序列的表位的结合。
本发明涉及如上所定义的构象抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
措辞“单克隆抗体”意思是所述抗体实质上仅结合一个表位，或结合所述表位的部分。
可从来源于永生化抗体分泌细胞例如杂交瘤的单克隆细胞系获得单克隆抗体。
单克隆细胞系来源于独特细胞的培养。
可根据例如Kohler和Milstein(1975)或者根据Buttin等(1978)，通过抗体分泌细胞如B细胞与永生细胞的融合生产杂交瘤。
根据本发明的另一个方面，如上所定义的单克隆抗体由根据布达佩斯条约的规定于2003年3月19在CNCM(Collection Nationale deCulture de Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2983的杂交瘤分泌。
所述单克隆抗体特别地结合天然HCV病毒包膜，结合天然HCV E2蛋白，结合天然HCV E1蛋白，并且能够沉淀在其共价或非共价形式下的HCV E1E2复合体，并能够结合由至少一种或者由所有上述定义序列构成的表位。所述的单克隆抗体此后特别地称作D32.10。
根据本发明的另一个方面，如上所定义的单克隆抗体由根据布达佩斯条约的规定于2003年3月19在CNCM(Collection Nationale deCulture de Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2982的杂交瘤分泌。
所述单克隆抗体特别地结合天然HCV病毒包膜并且结合HCV E2蛋白。所述单克隆抗体此后特别地称作D4.12.9。
本发明也涉及根据本发明抗体的片段或衍生物。本发明抗体的片段特别地包括Fab、F(ab′)2或scFv(单链Fv)片段，其对于本领域技术人员来说是公知的。本发明抗体的衍生物包括-如果适当的话-人源化抗体。人源化抗体例如可以是嵌合抗体，其中-如果适当的话-用人抗体的相应部分例如Fc片段置换根据本发明抗体的部分。可选择地，可将根据本发明的抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体，例如根据在美国专利5,824,307中所述。
根据另一个实施方案，本发明涉及根据布达佩斯条约的规定于2003年3月19在CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2983的杂交瘤。
根据另一个实施方案，本发明涉及根据布达佩斯条约的规定于2003年3月19在CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2982的杂交瘤。
根据另一个实施方案，本发明涉及包含至少一种上述所定义的抗体作为活性物质和药学上可接受载体的药物组合物。
药学上可接受的载体特别是如在Remington′s PharmaceuticalSciences第16版/Mack Publishing Co.中所定义。
可在上述定义的组合物中包括其它化合物，特别是抗病毒化合物，如其它抗HCV抗体及其片段或衍生物、干扰素、RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或解旋酶抑制剂。
可以单剂量或多剂量施用上面所提到的药物组合物。假设是单剂量，该组合物可包括从每公斤体重约0.1mg抗体到每公斤体重约1g抗体，特别地从约1mg/kg到约100mg/kg。假设是多剂量，可以每天每公斤体重约0.1mg抗体到每天每公斤体重约1g抗体的剂量，特别是从约1mg/kg/天到约100mg/kg/天，施用该组合物。
根据另一个实施方案，本发明涉及至少一种如上所定义的抗体用于制备诊断、预防或治疗HCV感染的药物的用途。
可使用根据本发明的抗体用于检测倾向于含有HCV的生物样品中的HCV病毒颗粒。可从感染HCV或者处于受HCV感染危险的患者中获得这些样品，特别地包括血液、血浆或血清样品。本领域技术人员公知的用抗体检测病毒的任何方法，如ELISA或EIA，可以以本发明的抗体应用。
可使用根据本发明的抗体用于制备向感染或未感染HCV的患者施用以中和HCV感染的药物。可通过预防HCV接触靶细胞进行HCV感染中和，例如通过使抗体结合包膜分子，如E1或E2，其结合靶细胞膜受体，从而阻止HCV-靶细胞结合。
可向感染HCV的患者施用该抗体以防止HCV病毒颗粒感染细胞，特别是肝细胞，或者促进免疫系统细胞捕获包被所述抗体的HCV。
可特别地在移植手术之前、期间或者之后，向接受移植器官特别是肝脏的患者施用该抗体，以中和可能在移植的器官中含有的HCV病毒颗粒。
本发明也涉及能结合至少一种上述所定义抗体的有包膜的病毒颗粒。
措辞“有包膜的病毒颗粒”特别地代表HCV病毒体，或者HCV病毒体的一部分，其含有包膜，所述包膜包含脂质和/或蛋白，特别是糖蛋白，在小叶中结合(associated in leaflets)。
本发明也涉及结合有包膜病毒颗粒的抗体，所述病毒颗粒能结合至少一种上述所定义抗体。
根据另一个实施方案，本发明涉及来源于人血液、血浆或血清最初样品的HCV病毒颗粒的组合物，其中HCV RNA拷贝的浓度比其来源的人血液、血浆或血清最初样品中的HCV RNA拷贝的浓度高约100到1000倍，特别是高于约107个拷贝/ml。
高浓度的根据本发明的组合物允许用所述的组合物有效免疫动物。
HCV RNA特别是HCV基因组RNA。
可通过RT-PCR，特别是定量RT-PCR测量样品的HCV RNA含量，例如用AmplicorTMHCV MonitorTM，Roche Diagnostics(Young等，1993)。
可选择地，也可使用NASBA(基于核酸序列的扩增)技术(Damen等，1999)测量样品的HCV RNA含量。
可以以所述样品中HCV RNA分子的拷贝数目表示样品的HCV RNA含量，一个拷贝等于一个国际单位(UI)。
样品的HCV RNA含量指示所述样品中所含有的HCV病毒体的量。
含有高于约107个拷贝/ml的HCV RNA的组合物允许用所述组合物有效地免疫动物。
本发明更具体地涉及如上所定义的组合物，其中HCV RNA拷贝的数目是从每毫克蛋白约108到约109UI。
通过本领域技术人员公知的方法评价组合物的蛋白含量，特别是通过Lowry测定(Lowry等，1951)如Biorad蛋白测定(BioradLaboratories)。
这种测量代表组合物的特异活性，其指示组合物的纯度；每毫克蛋白中HCV RNA拷贝数目越高，含有HCV的组合物的纯度就越高。
本发明进一步涉及如上所定义的组合物，其中所述组合物的体积是从约0.1ml到约10ml。
约0.1ml到约10ml的组合物体积相当于含有至少106HCV RNA拷贝的上述所定义的组合物。
这种组合物对于动物的免疫有用。例如，如在实施例中所描述的，对小鼠的有效免疫需要施用含有高于约106HCV RNA拷贝的HCV病毒颗粒组合物。
根据另一个实施方案，本发明涉及分离的实质上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白的HCV有包膜的亚病毒颗粒。
术语“分离的”意思是颗粒已经从其天然环境中提取出来，特别地其已经与其它HCV病毒颗粒或其含有HCV RNA和/或HCV核心蛋白的部分分离。
措辞“实质上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白”意思是含有上述所定义的亚病毒颗粒的溶液含有如用AmplicorTMHCV MonitorTM，Roche Diagnostics(Young等，1993)测量的低于104UI/ml的HCVRNA，以及如用Ortho-Clinical Diagnostics试验(Aoyagi等，1999)测量的低于1pg/ml的核心蛋白。
例如可用由在CNCM保藏的登录号为I-2983的杂交瘤所分泌的抗体，此后称作D32.10，或者由在CNCM保藏的登录号为I-2982的杂交瘤所分泌的抗体，此后称作D4.12.9，通过EIA或ELISA试验评估包膜的存在。
措辞“HCV有包膜的亚病毒颗粒”意思是该颗粒实质上上仅含有HCV病毒体的包膜部分，也就是说脂质和蛋白，特别是糖蛋白，在小叶中结合。迄今分离的HCV病毒颗粒含有HCV RNA和/或HCV核心蛋白。
本发明更具体地涉及如上所定义的分离的HCV有包膜的亚病毒颗粒，其中所述亚病毒颗粒易于结合任何上述所定义的抗体。
可通过本领域技术人员公知的几种方法，例如免疫沉淀、ELISA、EIA或Western印迹，评价上述所定义的亚病毒颗粒与本发明抗体的结合。
根据另一个实施方案，本发明涉及包含纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物，所述纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒含有HCVRNA、HCV核心蛋白以及HCV包膜，并易于结合上述所定义的任何一种抗体。
本发明更特别地涉及包含纯化的天然HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物。
措辞“HCV有包膜的完整病毒颗粒”意思是HCV病毒体含有HCV基因组RNA、HCV核心蛋白以及HCV包膜。在现有技术中一直没有关于含有这三种成分的HCV病毒颗粒的报道。
可通过使用如上所定义的方法评估是否存在HCV RNA、HCV核心蛋白和HCV包膜。
术语“纯化的”意思是上述所定义的HCV有包膜的完整病毒颗粒已经与其它化合物，如HCV有包膜的亚病毒颗粒分离。特别地，例如可通过电子显微镜术评价组合物含有比HCV有包膜的完整病毒颗粒少90％的HCV有包膜的亚病毒颗粒。
可通过本领域技术人员公知的几种方法，例如免疫沉淀、ELISA、EIA或Western印迹评价上述所定义的HCV有包膜的完整病毒颗粒与根据本发明的抗体的结合。
根据另一个实施方案，本发明涉及制备HCV病毒颗粒的组合物的方法，包括下列步骤对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法(clarifiedplasmapheresis)得到的样品进行至少两次超速离心，以获得富集HCV的沉淀；在水溶液中重悬富集HCV的沉淀以获得HCV病毒颗粒的组合物。
可以以例如约190,000g到约220,000g，优选地210,000g的速度，进行超速离心约3小时到约5小时，优选地4小时。
优选的离心条件导致病毒颗粒沉淀，如HCV病毒颗粒，而不沉淀在澄清的血浆中含有的其它化合物。
术语“血浆取出法”意思是将患者的血液进行过滤以获得血浆，而将血液的剩余部分重新注射回患者。
术语“澄清的”意思是将从血浆取出法获得的血浆以低速特别地以3000g离心30分钟。
超速离心前血浆取出法的最初的体积有利地是大约1升。
根据另一个实施方案，本发明涉及HCV病毒颗粒的组合物，如根据上面所提到的制备HCV病毒颗粒的组合物的方法所获得的。
根据另一个实施方案，本发明涉及制备HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物的方法，包括下列步骤-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两次超速离心，以获得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速离心重悬的富集HCV的沉淀，以将重悬的富集HCV的沉淀的组成成份(element)根据它们的密度分成级分(fraction)；-回收实质上不含HCV RNA、实质上不含HCV核心蛋白以及含有能结合以上定义为D32.10或D4.12.9的单克隆抗体的颗粒的级分，以获得HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物。
在蔗糖密度梯度中重悬的富集HCV的沉淀的超速离心可以从约190,000g到约220,000g，优选地210,000g，进行约40小时到约50小时，优选地48小时，蔗糖梯度可有利地是从约10％到约60％w/w、从约20到约50％w/w、从约25％到约45％w/w，或者从约30％到约45％w/w。
检验所获得的所有级分是否存在HCV RNA、HCV核心蛋白和/或能结合D32.10或D4.12.9的颗粒。
当通过AmplicorTMHCV MonitorTM，Roche Diagnostics(Young等，1993)测量的HCV RNA的含量少于约104UI/ml时，称该级分实质上不含有HCV RNA。
当通过Ortho-Clinical Diagnostics试验(Aoyagi等，1999)测量的HCV核心蛋白的含量少于约1pg/ml时，称该级分实质上不含有HCV核心蛋白。
使用的单克隆抗体特别地是由在CNCM保藏的登录号为I-2983的杂交瘤所分泌的单克隆抗体D32.10。
如果颗粒能在以下EIA试验中被检验为阳性，则称该颗粒能够结合上面所提到的单克隆抗体用从10-1到10-4稀释的不同级分包被96孔聚苯乙烯平板(Falcon；Becton Dickinson France S.A，Le Pont de Claix)。在4℃C过夜孵育平板，然后用含有5％(w/v)牛血清蛋白(BSA)的Tris-NaCl(TN)缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5和100mM NaCl)饱和。将在TN/BSA缓冲液和50％正常人血清(NHS)的混合液中以5μg/ml的浓度稀释的mAb D32.10加到每个孔中，并在37℃孵育2小时。用偶联辣根过氧化物酶(HRPO)的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段(1/5,000稀释；Immunotech)以及用邻苯二胺(OPD)和过氧化氢(H2O2)作为底物，检测结合的抗体。用ELISA读板器(MRX，Dynex)在450nm或在490nm测定光密度(OD)。当超过截止值(相当于阴性对照的均值乘以2.1)时，则认为结果是阳性的。
回收的级分特别地具有大约1.13到1.15g/ml的蔗糖密度。
可选择地，首先检验该级分中是否存在能结合D32.10和/或D4.12.9的颗粒，如果实质上不存在这种颗粒，则不进行其它的检验，如果存在这种颗粒，则然后进行HCV RNA检验和/或HCV核心蛋白检验。
根据另一个实施方案，本发明涉及HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物，如根据上述制备HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物的方法所获得的。
根据另一个实施方案，本发明涉及制备纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物的方法，包括下列步骤对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两次超速离心，以获得富集HCV的沉淀；在水溶液中重悬富集HCV的沉淀；在蔗糖密度梯度中超速离心重悬的富集HCV的沉淀，以将重悬的富集HCV的沉淀的组成成份根据它们的密度分成级分；回收含有每毫升从约5.105到约106UI的HCV RNA、每毫升从约50到约100pg的HCV核心蛋白，以及含有能结合以上定义为D32.10或D4.12.9的单克隆抗体的颗粒的级分，以获得纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物。
在蔗糖密度梯度中重悬的富集HCV的沉淀的超速离心可以从约190,000g到约220,000g，优选地210,000g，进行约40小时到约50小时，优选地48小时，蔗糖梯度可有利地是从约10％到约60％w/w、从约20到约50％w/w、从约25％到约45％w/w或者从约30％到约45％w/w。
如上所示测量HCV RNA含量、HCV核心蛋白含量以及颗粒的结合能力。
所使用的单克隆抗体特别地是由在CNCM保藏的登录号为1-2983的杂交瘤所分泌的单克隆抗体D32.10。
通过这种方法获得的组合物特别地含有纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒并且特别地实质上缺乏HCV有包膜的亚病毒颗粒。特别地，例如其可通过电子显微镜术评价组合物含有比HCV有包膜的完整病毒颗粒少90％的HCV有包膜的亚病毒颗粒。
所回收的级分特别地具有大约1.17到1.21g/ml的蔗糖密度，更特别地具有大约1.17到1.20g/ml、大约1.19到1.21g/ml、大约1.17到1.19g/ml或者大约1.19到1.20g/ml的蔗糖密度。
可选择地，首先检验级分中是否存在HCV RNA，如果存在高于105拷贝/ml的HCV RNA，则然后进行HCV核心蛋白的检验，如果存在高于50pg/ml的核心蛋白，则然后检验是否存在能结合D32.10和/或结合D4.12.9的颗粒；如果存在少于105拷贝/ml的HCV RNA，则不进行其它检验。
根据另一个实施方案，本发明涉及纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物，如根据上述相应的方法所获得的。
本发明也涉及制备由在CNCM保藏的登录号为1-2983的杂交瘤所分泌的单克隆抗体的方法，包括下列步骤-用本发明的HCV病毒颗粒的组合物，或者如根据本发明所制备的组合物免疫动物，特别是哺乳动物，并回收所产生的抗体；-在所产生的抗体中，根据它们结合在上面所提到的HCV病毒颗粒的组合物中含有的HCV病毒颗粒的能力选择单克隆抗体。
可如下获得HCV病毒颗粒的组合物-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两次超速离心，以获得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀以获得HCV病毒颗粒的组合物。
可用如上述所定义的间接EIA检验对所产生的抗体进行选择，用本发明的HCV病毒颗粒的组合物包被平板。
根据另一个实施方案，本发明涉及制备由在CNCM保藏的登录号为I-2982的杂交瘤所分泌的单克隆抗体的方法，包括下列步骤-用本发明的纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物，或者如根据本发明制备的组合物免疫动物，特别是哺乳动物，以及回收所产生的抗体；-在所产生的抗体中，根据它们结合在上面所提到的纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物中含有的纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的能力，选择单克隆抗体。
可如下获得纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两次超速离心，以获得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速离心重悬的富集HCV的沉淀，以将重悬的富集HCV的沉淀的组成成份根据它们的密度分成级分；-回收含有每毫升从约5.105到约106UI的HCV RNA、每毫升从约50到约100pg的HCV核心蛋白，以及含有能结合以上定义为D32.10或D4.12.9的单克隆抗体的颗粒的级分，以获得纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物。
可如上所述进行选择步骤。
根据另一个实施方案，本发明涉及制备针对HCV特别是HCV有包膜的亚病毒颗粒的单克隆抗体的方法，包括下列步骤-用本发明的HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物，或者根据本发明所制备的组合物免疫动物，特别是哺乳动物，并回收所产生的抗体；-在所产生的抗体中，根据它们结合在上面所提到的HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物中含有的HCV有包膜的亚病毒颗粒的能力选择单克隆抗体。
可如下获得HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物
-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两次超速离心，以获得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速离心重悬的富集HCV的沉淀，以将重悬的富集HCV的沉淀的组成成份根据它们的密度分成级分；-回收实质上不含HCV RNA、实质上不含HCV核心蛋白，以及含有能结合以上定义为D32.10或D4.12.9的单克隆抗体的颗粒的级分，以获得HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物。
可如上所述进行选择步骤。
本发明更特别地涉及针对本发明的HCV有包膜的亚病毒颗粒的抗体。
本发明也涉及包含至少一种针对HCV有包膜的亚病毒颗粒的抗体作为活性物质以及药学上可接受载体的药物组合物。
根据另一个实施方案，本发明涉及药物组合物，其包含作为活性物质的如上所定义的HCV有包膜的亚病毒颗粒，或者包含如上所定义的HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物，以及药学上可接受的载体。
可向药物组合物中添加另外的佐剂，例如在Remington′sPharmaceutical Sciences第16版/Mack Publishing Co.中所定义，佐剂可以是例如不完全弗氏佐剂、铝盐或氢氧化铝。
例如可以以包含从1mg到1g的HCV有包膜的亚病毒颗粒的单剂量施用组合物。
根据另一个实施方案，本发明涉及如上所定义的HCV有包膜的亚病毒颗粒的用途，或者包含如上所定义的HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物的用途，用于诱导抗所述HCV有包膜的亚病毒颗粒或抗如上所定义的HCV有包膜的完整病毒颗粒的免疫反应。
措辞“诱导免疫反应”意思是可激活分泌抗HCV病毒颗粒的抗体的B细胞或者可激活破坏感染HCV的细胞的T细胞。
根据另一个实施方案，本发明涉及如上所定义的HCV有包膜的亚病毒颗粒的用途，或者包含上述所定义的HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物的用途，用于制备诊断、预防或治疗HCV感染的药物。
可使用HCV有包膜的亚病毒颗粒，根据本领域技术人员公知的方法，在免疫测定如EIA、ELISA中，评估是否存在针对HCV的抗体。
可使用HCV有包膜的亚病毒颗粒用于制备抗丙型肝炎的疫苗，特别是治疗性疫苗。
措辞“治疗性疫苗”意思是该疫苗能改善感染HCV患者的情况，例如通过诱导产生抗HCV的抗体。
附图的简要说明

图1A、图1B、图1C、图1D和图1E图1A、1B、1C、1D和1E表示抗体沉淀的35S标记细胞的溶胞产物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。泳道1、2、3、4、5、6和7分别对应于抗体C9.19.16、C2.22.1、D32.10、D3.20.12、C7.24.19、C7.14.41和C1.9.3。MW对应于分子量标准参照物。在凝胶的右边给出与分子量标准参照物对应的条带的大小。如果可能，在凝胶的左边将条带鉴定为E1、E2或Agg(对于聚集的)。
图1A表示抗体沉淀的35S标记的对照细胞的溶胞产物的SDS-PAGE，在还原条件下。
图1B表示抗体沉淀的35S标记的表达HCV E1蛋白的细胞的溶胞产物的SDS-PAGE，在还原条件下。
图1C表示抗体沉淀的35S标记的表达HCV E2蛋白的细胞的溶胞产物的SDS-PAGE，在还原条件下。
图1D表示抗体沉淀的35S标记的表达HCV E1E2蛋白的细胞的溶胞产物的SDS-PAGE，在还原条件下。
图1E表示抗体沉淀的35S标记的表达HCV E1E2蛋白的细胞的溶胞产物的SDS-PAGE，在非还原条件下。
图2图2表示HCV病毒颗粒的Western印迹，使用D32.10单克隆抗体，在非还原和还原条件下。从左到右，M代表分子量标准参照物，在非还原条件下，在凝胶的左边指示其条带的大小(以kDa表示)，泳道1代表使用D32.10单克隆抗体在非还原条件下HCV病毒颗粒的Western印迹，第二个泳道M代表在还原条件下的分子量标准参照物，泳道2代表使用D32.10单克隆抗体在还原条件下2,5μg HCV病毒颗粒的Western印迹，泳道3代表使用D32.10单克隆抗体在还原条件下5μg HCV病毒颗粒的Western印迹。在凝胶的右边，指示泳道3的几个条带的大小(以kDa表示)，一些对应于HCV蛋白E2(60和68)或者对应于HCV蛋白E1(34和31)。
图3A和图3B图3A和图3B表示经受糖苷酶A(图3A)和内切糖苷酶H(图3B)去糖基化的HCV病毒颗粒的Western印迹。
在图3A中，泳道M代表分子量标准参照物，在凝胶的左边指示其条带中3个的大小(以kDa表示)；泳道1、2、3和4分别代表糖苷酶浓度为20、10、5和0mU/ml。在凝胶的右边，指示HCV蛋白E2和E1的位置，以及蛋白E1的主要去糖基化形式(E1*)的位置和对应于E1或E2的去糖基化形式的几个条带的大小(以kDa表示)，以及E2的主要去糖基化形式(41*)。
在图3B中，泳道M代表分子量标准参照物，在凝胶的左边指示其条带中4个的大小(以kDa表示)；泳道1和2分别代表无内切糖苷酶H进行的对照去糖基化实验和存在内切糖苷酶H时进行的去糖基化实验。在凝胶的右边代表对应于E2和E1的完全糖基化形式以及对应于E2(50、48、46和42kDa)和E1(28和24kDA)的去糖基化形式的主要条带。通过星号标记E2(50*)和E1(28*)的占优势的去糖基化形式。
图4图4表示通过对HCV病毒颗粒制剂的蔗糖密度梯度离心所得到级分的表征。已经测量了3个参数，HCV RNA含量、HCV核心蛋白含量以及对D32.10单克隆抗体的反应性。水平轴代表接受表征的级分的编号。左边的垂直轴代表HCV RNA浓度(×105UI/ml)和通过间接EIA测量(在450nm的OD)的对D32.10反应性的测量值。右边的垂直轴代表HCV核心蛋白浓度(以pg/ml表示)。与黑点对应的曲线代表级分对D32.10的反应性，与白色三角形对应的曲线代表级分核心蛋白含量，虚线代表级分HCV RNA含量。
图5A、图5B和图5C图5A、图5B和图5C分别代表HCV病毒颗粒制剂、HCV有包膜的完整病毒颗粒制剂以及HCV有包膜的亚病毒颗粒制剂的透射电子显微镜照片。
在图5A中，水平条代表200nm长的刻度。较大的圆形成分代表HCV有包膜的完整病毒颗粒，较小的圆形成分代表HCV有包膜的亚病毒颗粒。
在图5B中，水平条代表50nm长的刻度。圆形成分代表HCV有包膜的完整病毒颗粒。
在图5C中，水平条代表50nm长的刻度。圆形成分代表HCV有包膜的亚病毒颗粒。
图6图6表示使用D4.12.9单克隆抗体的HCV病毒颗粒的Western印迹。泳道M代表分子量标准参照物，在凝胶的左侧和右侧指示其4个条带(75、50、37、25)的大小(以kDa表示)。泳道1和2代表分别用糖苷酶A和用内切糖苷酶H消化HCV病毒颗粒的结果，泳道3和4代表用蛋白酶胰蛋白酶和V8蛋白水解消化HCV病毒颗粒的结果，泳道5代表用NP-40溶解的结果，在泳道6中没有进行先前的处理。在凝胶的右边，指示未消化的E2蛋白的两种主要形式(68和48)(以kDa表示)，在凝胶的左边表示E2的主要去糖基化形式(E2*)。
图7图7表示对HCV病毒颗粒制剂的蔗糖密度梯度离心所获得级分的基于D4.12.9的表征。除了级分对D4.12.9的反应性，还测量了级分核心蛋白含量。水平轴代表接受表征的级分的编号。右边的垂直轴代表通过间接EIA(在450nm的OD)测量的对D4.12.9反应性的测量值。左边的垂直轴代表HCV核心蛋白浓度(以pg/ml表示)。与黑色正方形对应的曲线代表级分对D4.12.9的反应性，与黑色菱形对应的曲线代表级分核心蛋白含量。
图8A、图8B和图8C图8A、图8B和图8C表示3种生物素化肽，分别包含第290-317位氨基酸(图8A)、第417-500位氨基酸(图8B)以及第605-629位氨基酸(图8C)，对健康个体(11份血清，在水平轴上编号为T1到T11)和HCV感染患者(44份血清，在水平轴上编号为A1到A44)的55份血清的免疫反应性。垂直轴代表通过ELISA(在490nm的OD值乘以1000)测定的血清对三种肽的反应性。白色条形代表健康个体的血清的反应性，灰色条形代表感染患者的血清的反应性。水平线代表截止值，在其之上的血清反应被认为是阳性。在图8A中，截止值是0.691，在图8B中是0.572，在图8C中是0.321。
图9A和图9B通过Ortho Clinical Diagnostics的总HCV核心抗原测定对HCV-Fan沉淀和来自上述1型的从30到45％蔗糖梯度的级分中的HCV核心蛋白进行定量(图9A)并通过Western印迹进行分析(图9B)。(图9A)以1∶2稀释检验所有级分。检验1∶25、1∶50和1∶100稀释的HCV-Fan沉淀，发现含有332pg/ml。所有稀释都用TNE缓冲液进行。截止值是1.4pg/ml。(图9B)对HCV-Fan沉淀和来自30-45％蔗糖梯度的第4、8、12和13级分进行SDS-12.5％PAGE。使用抗核心、7G12A8、2G9A7和19D9D6单克隆抗体的混合物(每种5μg/ml)检测HCV核心蛋白。使用Amersham的ECL Plus系统使印迹显影。左边的数字指示以千道尔顿(kDa)表示的标准参照物(M)的分子量，右边指示HCV核心蛋白。
图10通过定量RT-PCR Amplicor HCV Monitor test version 2.0(Roche Diagnostics)在所有来自最初10到60％蔗糖梯度的级分中分析HCV RNA。根据生产商的使用说明进行检验。通过使用QS国际单位(IU)计算每个PCR的结果，其对每批都是特异的，并且以IU HCVRNA/ml表示。
图11A和图11B通过电子显微镜术(EM)对血清来源的HCV有包膜的颗粒进行分析。通过使用MAb D32.10(5μg)(a、b、c和d组)或不相关的Mab(e组)对HCV-Fan沉淀(2μg)进行免疫沉淀，通过超速离心沉淀后的免疫复合物吸附到格栅上并用1％乙酸双氧铀(pH 4.5)染色。使用JEOL 100CX电子显微镜观察该制剂。(图11A)颗粒直径(用nm表示)有些变化，对156个病毒颗粒(VPs)绘制直方图。颗粒大小分布显示在35nm处集中的峰。(图11B)电子显微镜照片。a、b、c和e组中的条带指示50nm。
图12A和图12B用D32.10免疫沉淀、在格栅上吸附以及染色后，通过电子显微镜术分析来自蔗糖梯度峰1(图12A)和2(图12B)的HCV-Fan颗粒。(图12A)对41个病毒颗粒绘制直方图。在峰1中占主要的种类(85.4％)是直径约20nm的球形颗粒，所谓的《小颗粒》。(图12B)对89个病毒颗粒绘制直方图。峰2中最普遍的形式(77.5％)平均直径约41nm。峰2似乎在大小上有点更不均匀，并且主要由直径35和50nm的颗粒组成，所谓的《大颗粒》。条形指示50nm。
图13有包膜的HCV颗粒的间接免疫金标记。将用D32-10-免疫复合物(HCV沉淀，20μg；MAb D32.10，5μg)包被的显微镜格栅与作为二抗的1∶50稀释的偶联山羊抗小鼠IgG的胶体金颗粒(10nm)孵育。根据IgG的空间位阻(在EM中约15nm)，仅有少数金颗粒可鉴定抗体结合。在病毒颗粒外没有观察到金颗粒。在所有图形中的条形都指示20nm。
图14A、图14B、图14C和图14D图14A和14B表示来自基因型1b的分离物HCV-L的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10％到60％)中等密度离心的结果。
图14A表示离心后所获得级分(水平轴)的密度(左侧的垂直轴，g/ml)和E1E2-D 32.10反应性(右侧的垂直轴，A490nm)。
图14B表示第6、8、10、12和14级分的Western印迹，使用抗E1E2 MAb D32.10。左侧的数字指示以千道尔顿(kDa)表示的标准参照物(M)的分子量，右侧指示HCV E1和E2蛋白。
图14C和14D表示来自基因型1a/2a的分离物HCV-Fan的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10％到60％)中等密度离心的结果。图14C表示离心后所获得级分(水平轴)的密度(左侧的垂直轴，g/ml)和E1E2-D 32.10反应(右侧垂直轴，A490nm)。
图14D表示第6、8、10、12和14级分的Western印迹，使用抗E1E2 MAb D32.10。
对于EIA，将每个级分稀释1/10000(图4A和4C)，对于Western印迹每个泳道使用5μl所选级分(图4B和4D)。通过折光测定法测定级分的密度并以g/ml表示。在490nm测定吸光度(A)。当超过截止值(对应于阴性对照(至少3个值)的均值乘以2.1)时，则认为EIA的结果是阳性的。使用Amersham的ECL Plus系统显示印迹。
图15A、图15B和图15CHCV-Fan沉淀在1型30到45％蔗糖梯度(2ml 30％、3ml 35％、3ml 40％、2ml 45％)中的等密度离心(图15A)。将来自蔗糖梯度(30-45％)峰1(级分8)和2(级分12和13)的颗粒个别单独地进行第二次平衡离心(分别是图15B和15C)。将峰1在2型30到45％蔗糖梯度(3ml 30％、3ml 35％、2ml 40％、2ml 45％)中进行离心(图15B)。将峰2在3型30到45％蔗糖梯度(2ml 30％、2ml 35％、3ml40％、3ml 45％)中进行离心(图15C)。通过折光测定法测定级分的密度，以g/ml表示。如前面所述通过间接EIA分析E1E2-D32.10反应性。
实施例1获得针对天然HCV病毒包膜的单克隆抗体HCV病毒颗粒制备为了获得良好供应的病毒材料，通过血浆取出法进行HCV病毒颗粒的纯化。所选择的患者在由于丙型病毒性肝硬化而进行部分肝移植后，发展成慢性活动性丙型肝炎，12个月后与高丙球蛋白血症相关的多发性骨髓瘤是血浆置换的原因。患者表现出血清转氨酶(ALT/AST)水平异常升高，并且抗HCV抗体阳性。患者对所有HBV和HIV标记均阴性。最初材料的HCV RNA含量是6×105拷贝/ml(AmplicorTMHCVMonitorTM，Roche Diagnostics，Meylan，France)，基因型是1b(INNO-LIPA试验，Innogenetics，Gent，Belgium)。
使用澄清的血浆取出法通过在4℃，210,000g连续两次超速离心4小时制备富集HCV的沉淀。在1ml Tris-NaCl-EDTA(TNE)缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.5，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)(240倍浓度)中重悬最终的沉淀，并贮藏在-80℃。这种材料的HCV RNA含量是3×107拷贝/ml(Monitor，Roche)，蛋白浓度是5mg/ml(即，每毫克蛋白约107个HCV RNA拷贝)。
杂交瘤制备为了产生单克隆抗体(mAb)，用处于完全弗氏佐剂中的100μg(106个HCV RNA拷贝)HCV-沉淀的材料接种BALB/c小鼠，1周后用处于不完全弗氏佐剂中的100μg病毒接种。三只经免疫的小鼠产生较高的抗HCV的血清抗体效价，通过间接酶免疫测定(EIA)检测。三周后，用50μg处于磷酸缓冲盐水(PBS)中的病毒对小鼠进行强化。5天后重复注射，3天后取出脾，通过Buttin等(1978)所描述的操作与X63骨髓瘤细胞融合。使用免疫原作为固相(5μg/ml)以及偶联过氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段(Amersham，France)作为显示二抗(Petit等，1987)，通过间接EIA筛选杂交瘤培养物上清液中是否存在HCV特异性抗体。稀释液含有50％正常人血清(NHS)以消除针对可能与HCV病毒颗粒相关的NHS蛋白的非特异性反应性。然后通过限制性稀释再克隆对HCV产生最强信号(P/N＞10)的杂交体并且进一步测定它们的特异性。选出7个克隆(C9.19.16、C2.22.1、D32.10、D3.20.12、C7.24.19、C7.14.41和Cl.9.3)，将4个克隆(D32.10、C2.22.1、C9.19.16和D3.20.12)通过注射到降植烷致敏的BALB/c小鼠中以产生腹水而进行增殖，然后通过用50％饱和的(NH4)2SO4沉淀，随后在琼脂糖凝胶-蛋白G(Pharmacia，France)中通过亲和层析进行纯化。以本领域技术人员公知的方法通过ELISA测定同种型。所分析的7个克隆产生IgGl同种型抗体。
单克隆抗体表征使用间接EIA评价上面所提到的单克隆抗体与病毒颗粒的相互作用。用从10-1到10-6稀释(对应于100μg/ml到1ng/ml)的HCV制剂(每毫升1mg蛋白)包被96孔聚苯乙烯板(Falcon；BectonDickinson France S.A，Le Pont de Claix)。平板在4℃过夜孵育，然后用含有5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的Tris-NaCl(TN)缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5和100mM NaCl)饱和。将在TN/BSA缓冲液和50％正常人血清(NHS)的混合物中以5μg/ml浓度稀释的mAbD32.10添加到每个孔中，并且在37℃孵育2小时。用偶联辣根过氧化物酶(HRPO)的抗小鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段(1/5,000稀释；Immunotech)以及用邻苯二胺(OPD)和过氧化氢(H2O2)作为底物，检测结合的抗体。用ELISA读板器(MRX，Dynex)在450nm测定光密度(OD)。当超过截止值(对应于阴性对照的均值乘以2.1)时，则认为结果是阳性的。所获得的7种抗体的确识别病毒颗粒。
为了建立mAb的天然多肽特异性，使用免疫原作为抗原探针进行免疫印迹(Petit等，1987)。在还原条件下(2％SDS+5％2-ME)，在12.5％凝胶上进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。蛋白转移到PVDF膜上后，对在50％NHS中稀释的mAb(2到5μg/ml)作为一抗进行检验，通过与作为二抗的偶联过氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab′)2片段(1/10,000稀释，IMMUNOTECH)孵育，检测结合的IgG。通过Amersham的增强化学发光(ECL+)系统显现条带。
除了D32.10外，所有被检验的mAb在还原条件下与HCV多肽呈阴性反应。值得注意的是除了C1.9.3和C7.24.19在EIA中与人IgG微弱地反应(大约是阴性值的5倍)外，所选的mAb既不与人血清白蛋白也不与免疫球蛋白(Ig)的γ或μ链反应。
还通过免疫沉淀检查7种抗体的多肽特异性。根据以前所描述的方法(Dubuisson等，1996)用35S-Translabel(ICN)代谢性标记由表达HCV蛋白(E1、E2或E1E2)的痘苗病毒重组体感染的HepG2细胞。用在10mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，和2mM EDTA中的0.5％NP-40溶解细胞。沉淀用Laemmli样品缓冲液处理并在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE进行分析(图1)。所检验的单克隆抗体不显示针对细胞成分的非特异性反应性，除了C9.19.16(＞200kDa)、D3.20.12(在70、50和46kDa的3个强条带)以及更微弱地，C2.22.1(70、50、46kDa)和D32.10(多个非常弱的条带)(图1A，对照载体)。当两个HCV糖蛋白分别表达时，所有抗体都特异性免疫沉淀E1(图1B)和E2(图1C)，以及当这些蛋白共表达时沉淀E1E2异二聚体(图1D)，。有趣地是，在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE后的模式不同(图1D、1E)。所有抗体都识别二硫键连接的E1E2聚集体，其在非还原条件下在凝胶的上部检测到(图1E)。发现一种mAb，D32.10，主要与聚集体反应并且也与E1E2非共价连接的成熟复合体反应(图1E，非还原条件)。通过Western印迹分析，所有mAb都不识别在异种系统中表达的变性的重组E1或E2蛋白，提示它们识别HCV病毒颗粒上的构象表位。归纳起来，这些结果表明这些mAb特异性识别在天然血清来源的HCV病毒颗粒表面表达的二硫键连接的E1E2复合体。这非常有可能是由于它们与E1和E2蛋白之间共享的构象表位反应。选择与在其共价或非共价形式下的E1E2复合体相互作用的单克隆抗体D32.10用于进一步研究。
单克隆抗体D32.10抗原作图为了检验D32.10的HCV型特异性，根据已经描述的方法，用从10-1到10-6稀释(对应于100μg/ml到1ng/ml)的4种不同HCV制剂(每毫升1毫克蛋白)进行间接EIA。除了免疫原HCV制剂外，使用从同一患者中获得的制剂，以及从患有慢性丙型肝炎的2名不同患者中获得的两种其它制剂，其中一名患者已经发现在血清中携带不同的基因型，即HCV1a和HCV2a。发现D32.10能识别所有四种HCV制剂，因此表明其能识别不限于免疫原1b基因型的抗原决定簇。
为了评价D32.10的天然多肽特异性，进行Western印迹分析。使用未处理的富集HCV的沉淀作为抗原探针，以不同浓度，从0.1到1mg/ml。将抗原在还原或非还原条件下(2％SDS±5％2-巯基乙醇(2-ME))在12.5％凝胶上进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。蛋白转移到PVDF膜上后，使用在50％NHS中稀释的mAb D32.10(2到5μg/ml)作为一抗进行免疫印迹。然后通过与作为二抗的偶联过氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab′)2片段(1/10,000稀释；DAKO)孵育，检测结合的小鼠IgG。通过Amersham的增强化学发光(ECL+)系统显示蛋白条带。根据以前Sato等(1993)所描述的方法对循环的HCV病毒体进行糖苷酶消化。用在100mM柠檬酸/磷酸缓冲液(pH6.0)中的5、10或20mU/ml的糖苷酶A(肽-N-糖苷酶A或PNGase A；ROCHE)在37℃对富集HCV的沉淀(HCV-L，4μg)处理18小时。也通过在37℃在含有内切糖苷酶H(Roche的endo H，5mU/μl)、20mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1％Triton X100的50mM醋酸钠缓冲液(pH5.5)中过夜孵育，对纯化的HCV病毒颗粒进行去糖基化。除了省略酶外，使用与PGNase A消化或endo H消化相同的条件进行对照消化。然后用含有还原剂的电泳样品缓冲液处理样品并通过SDS-PAGE进行分析。
在图2中显示Western印迹实验的结果。当在还原条件下(2％SDS/5％2-ME)分析相同样品的两个浓度(2.5和5μg，分别是泳道2和3)时，mAb D32.10识别68kDa的主要条带和31kDa的另一条带，分别对应于E2和E1。然而，在非还原条件下，mAb 32.10识别在凝胶的上部回收的二硫键连接的复合体(＞200kDa)。这些高分子量条带(图2，泳道1)非常有可能对应于异二聚的E1E2复合体。
已经显示天冬酰胺连接的复合体类型糖链存在于HCV天然病毒体的表面(Sato等，1993)，因此检查用不同浓度(20、10和5mU/ml)的糖苷酶(PNGase A)处理HCV制剂后D32.10mAb识别HCV特异性蛋白的能力。如在图3A(分别是泳道1、2和3)中所示，D32.10与E1的去糖基化形式，特别是25kDa反应，其在最高酶浓度累积。去糖基化后可通过D32.10清楚地检测到E1相关产物，而处理后不能清楚地鉴定E2相关产物。内切糖苷酶H(endo H)消化允许研究在天然HCV病毒颗粒上表达的E1E2复合体对endo H切割的敏感性。如在图3B中所示，对于E2(从68到42kDa)和E1(从34到24kDa)蛋白都观察到分子量迁移，提示E1和E2在血清来源的天然HCV病毒颗粒上具有复杂的糖基化，这可以解释部分endo H抗性，如endo H抗性复合聚糖和敏感形式的混合物。
D32.10表位作图a.肽文库的筛选为了进一步表征mAb D32.10识别的表位，使用该抗体筛选十二肽噬菌体展示文库Ph.D.-12TM噬菌体展示肽文库试剂盒购自New England BioLabsInc.。这是一种与M13噬菌体的小外壳蛋白(pIII)融合的组合肽12聚体。在pIII的N末端表达所展示的肽12聚体。该文库由约1.9×109个电穿孔的序列构成，扩增一次在10μl所提供的噬菌体中产生约20个拷贝的每个序列。根据生产商的使用说明，并作一些改动，进行3次生物淘选(biopanning)。简而言之，将10μg生物素化的mAbD32.10偶联到用40μg链霉抗生物素包被的35mm聚苯乙烯Petri平皿(Falcon)上。将平皿在4℃过夜孵育并用含有0.5％吐温-20的50mM Tris，150mM NaCl，pH7.5(TBS)(TBS-T)冲洗6次。在第一轮选择中，允许来自最初文库的4×1010个噬菌体与平皿结合的IgG在摇动的条件下在4℃反应4小时。通过用TBS-T重复冲洗除去未结合的噬菌体。然后用400μl洗脱缓冲液(0.1N HCl，用甘氨酸将pH调整到2.2，1mg/ml BSA)从平皿洗脱结合的噬菌体。用75μl 1MTris-HCl pH9.1中和后，然后根据使用手册中的建议，通过感染20ml1∶100稀释的大肠杆菌(E.coli)ER2537(recA+菌株细胞)的过夜培养物，扩增洗脱的噬菌体。将培养物在37℃剧烈振荡培养4.5小时。获得上清液，并根据以前所描述的方法(Scott等，1990)用聚乙二醇(PEG)沉淀。在第二轮和第三轮选择中，在添加到用10μg链霉抗生物素包被的35nm聚苯乙烯Petri平皿前，将来自前一轮的20％扩增噬菌体分别与终浓度为10和1nM的生物素化mAb D32.10在4℃预先孵育过夜。接下来的操作与第一轮相同。然后克隆并扩增来自第三次生物淘选洗脱液的噬菌体，用于DNA测序和免疫分析。
对于DNA测序，根据Sambrook等(1982)所描述的方法从纯化的噬菌体制备单链DNA。根据修改的Sanger(Sanger等，1977)法，使用BigDyeTM终止子循环测序Ready反应试剂盒(Perkin-Elmer)，用Applied biosystems DNA测序仪(377A型)测定基因III插入片段的核苷酸序列。用对应于pIII基因序列的引物5′HO-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-OH 3′(SEQ ID NO4)进行循环测序。从核苷酸序列推定插入片段的氨基酸序列。
对于上清液噬菌体的ELISA，用100μl溶于0.1M NaHCO3缓冲液(pH8.6)，终浓度为100μg/ml的mAb D32.10或不相关的mAb包被成排ELISA平板孔。将平板在4℃过夜孵育，然后用含有5mg/ml BSA的0.1M NaHCO3缓冲液(pH8.6)封闭。在4℃孵育2小时后，用含有0.5％吐温的TBS冲洗平板6次。向微量滴定平板的每个孔中添加每种噬菌体克隆的4倍系列稀释液，终体积为100μl TBS-T，以每排第一个孔1012个病毒体开始，以第12个孔2×105个病毒体结束。将平板在室温下振荡孵育2小时，然后如上用TBS-T洗6次。在使用1∶5,000稀释的偶联辣根过氧化物酶的抗M13 mAb(Pharmacia)的夹心试验中，检测结合的噬菌体。使用含有OPD和H2O2的商业化颜色试剂盒(bioMerieux)使平板显色。孵育10分钟后，用ELISA读板器在492nm读取平板。对于每个噬菌体克隆稀释液，结果以用所检验的抗HCV mAb获得的值和用无关mAb获得的值之间的差异表示。然后通过检验一式三份免疫反应克隆的最佳稀释液证实结果。
对于测序分析，通过使用Mac Vector，Ver.4.5软件(Kodak)将肽的氨基酸序列与HCV E1和E2蛋白序列比较。基本上，用LFASTA程序检测最高相似性的区域，其试验性地搜索最佳的局部同一性(Pearson和Lipman，1988)。
三轮选择后，在指示特异性结合噬菌体的扩增的洗脱液中发现4％的噬菌体输入。因此，随机分离88个克隆，对它们的DNA进行测序并且推定插入片段的氨基酸序列。获得了48个不同序列，在几个实例中发现了其中的一些序列。然而，当在ELISA试验中检验它们与D32.10的免疫反应性时，其中没有一个给出阳性信号，表明结合亲和力太低以至于无法检测到。将48个克隆序列与HCV E1和E2的序列进行比较。分别有5个和3个序列显示与位于292-305区和347-356区的E1残基相似(在表1中以粗体指示相似)，而分别有7个、4个和2个序列与E2位于481-501、610-631和685-698区的残基共有一些相似性(在表2中以粗体指示相似)。
表1
表2
b.肽合成为了评价在E1和E2序列上这些不同定位的意义，复制E1的291-315和347-356区以及E2的473-498、607-627和686-697区，作为偏移一位的重叠的合成十五肽，并检验它们与D32.10的免疫反应性。
在硝酸纤维素膜上使用9-芴基甲氧羰基氨基酸化学(Frank，1988)同时合成不同的肽序列。
产生适于免疫学检测的纳摩尔量的每种肽。根据以前所描述的方法(Jolivet-Reynaud，1998)通过间接比色免疫测定分析抗体对膜结合肽的反应性。对应于具有抗体反应性的肽的点产生阳性蓝色信号。通过显示观察估计点的强度并且用从0到5等级的相对强度表示。
用与292-305 E1区对应的肽获得强阳性信号，而347-356 E1区没有被D32.10识别。分别与E2区482-499和612-626对应的肽也与D32.10发生免疫反应，用E2区686-697没有检测到信号。在ELISA中E1的292-306区以及E2的480-494和608-622区作为十五肽与D32.10相互作用。
通过使用重叠的十五肽，HCV E1蛋白的297RHWTTQGCNC306(SEQ ID NO1)区以及HCV E2蛋白的613yRLWHYPCT621(SEQ ID NO3)和480PDQRPYCWHYPPKPC494(SEQ ID NO2)两个区都与D32.10反应。在E2中所鉴定的这两个区含有由Yagnik等(2000)提出的在E1E2的异二聚体化中涉及的相同基序WHYP。区分这些区域很困难，但是作为两个非重叠区479GPDQRPYC486(SEQ ID NO26)和487WHYPPKPC449(SEQ ID NO27)分别结合D32.10，这提示D32.10特异性识别每种八肽，因此识别整个序列(480-494)。
实施例2血清来源HCV病毒颗粒的表征和纯化为了分离不同的HCV群，将最终的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10到60％，w/w)中进行等密度离心(在4℃，210,000g离心48小时)。收集级分(0.6ml)，通过折光测定法测定每种级分的密度。通过定量RT-PCR(Amplicor Monitor，Roche)分析HCV-RNA含量，用Ortho-Clinical Diagnostics试验测定HCV核心蛋白含量并通过间接EIA测定HCV病毒颗粒对mAb D32.10的抗原反应性。
除了用从10-1到10-4稀释的不同级分包被孔，如上所述进行间接EIA。
鉴定了三个不同群(图4)。一个群(级分3到5)在1.06-1.08g/ml的蔗糖密度形成条带，并且通过用D32.10的间接EIA所获得的阴性结果证实实质上缺乏病毒包膜，但是含有HCV RNA(约2.105UI/ml)和HCV核心蛋白(从约2到4pg/ml)。这些似乎是无包膜的病毒颗粒。另一个群(图中级分8到10)在1.14-1.15g/ml的蔗糖密度形成条带，并且实质上缺乏HCV RNA(低于约104到105UI/ml)和HCV核心蛋白(约1pg/ml)，但是含有高水平的对D32.10反应的颗粒(从约1到3.8OD450nm单位)。这些HCV亚病毒颗粒似乎仅含有HCV病毒包膜。第三群(级分11到14)在1.20-1.21g/ml的蔗糖密度形成条带，含有具有高水平HCV RNA(高于约5.105到106UI/ml)和HCV核心蛋白(从约2.5到8pg/ml)以及对D32.10反应(从约0.5到1.5OD450nm单位)的颗粒。因此，这群实质上仅含有纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒。
通过D32.10免疫沉淀在富集HCV的沉淀(图5A)，以及在第二群(图5C)和第三群(图5B)中含有的病毒颗粒，并通过电子显微镜观察。通过这种方法已经分析了几种HCV病毒颗粒制剂。HCV有包膜的亚病毒颗粒表现为平均直径约30nm(33.08nm)的球形颗粒(图5C)，而HCV有包膜的完整病毒颗粒同样表现为球形，但是平均直径约50nm(48.72nm)(图5B)。
实施例2bis血清来源的HCV病毒颗粒的表征和纯化本发明人对感染患者血浆中存在的HCV病毒群还进行了另一项分析。
血清来源的HCV颗粒的纯化使用实施例1中所获得的富集HCV的沉淀(HCV-L)用于物理化学、免疫学和形态学研究，以及来自另一个患者的血浆取出法的沉淀(HCV-Fan，基因型1a/2a)，其显示出患有慢性丙型肝炎(CH-C)，具有与严重的皮肤脉管炎相关的II型冷球蛋白血症，需要定期血浆置换。如同对于HCV-L患者，后面的HCV-Fan患者显示血清转氨酶(ALT/AST)水平异常升高，抗HCV抗体阳性，对所有HBV和HIV标记阴性。
由此表征了7种制剂。它们在定量Amplicor HCV RNA Monitor试验(Roche)中对于从106UI/ml到2-3×107UI/ml的HCV RNA(HCV-Fan，HCV-L)阳性，对应于2.5×106拷贝/ml到5-7.5×107拷贝/ml。
为了分离不同HCV群，将最终的富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10到60％或者30到45％，w/w)中进行等密度离心(在4℃，200,000g离心48小时)。收集级分(0.6ml)，通过折光测定法测定每种级分的密度。通过定量RT-PCR(Amplicor Monitor，Roche)监测HCV-RNA含量。如上所述，在固相上每种级分以不同稀释度(1/10到1/10000)包被后，使用MAb D32.10通过间接EIA检测HCV包膜(env)反应性。通过使用定量Ortho试验和利用抗核心单克隆抗体混合物(7G12A8、2G9A7和19D9D6)的western印迹，测定HCV核心抗原(Jolivet-Reynaud等，1998；Menez等，2003)。
简要地说，通过使用OrthoRtrak-CTM试验(Ortho-ClinicalDiagnostics，Inc)测量在富集HCV的沉淀和在从蔗糖梯度中收集的每种级分中的总HCV核心抗原。OrthoRtrak-CTM试验是一种定量免疫捕获试验，使用对HCV核心抗原的不同区域具有特异性的几种单克隆抗体。该方法使用预处理步骤以使得样品制剂游离、免疫复合，以及使病毒体相关抗原可以测定(Aoyagi等，1999)。通过由RocheMolecular System(Meylan，France)开发的定量RT-PCR，AmplicorTMHCV MonitorTM，评价HCV RNA。扩增步骤涉及单管、单酶(rTth DNA聚合酶)、单引物对组合的反转录和DNA聚合作用(Colucci和Gutekunst，1997)。通过比色微孔平板试验进行检测。PCR样品遗留污染的控制包括AmpEraseTM，其已被掺入到试验中用以灭活污染的扩增的DNA(Longo等，1990)。
首先将富集HCV的沉淀在蔗糖密度梯度(10％到60％)中进行等密度离心。通过上述间接EIA方法(图14A和14C)和使用抗E1E2 MAbD32.10(其特异性先前已在实施例1中详细定义)的western印迹(图14B和14D)调查是否存在显示E1E2-D32.10反应性的有包膜的病毒颗粒。如在图14A和14C中所示，在EIA(级分稀释1/10000)中E1E2-D32.10反应性从级分9(密度为1.12g/ml)到级分16(密度为1.23g/ml)回收，峰在1.12和1.17g/ml之间，“肩”从1.18到1.23g/ml。在对应低密度复合物(1.006到1.10g/ml)的级分中没有检测到或者检测到非常低的D32.10反应性(级分稀释1/10)。用基因型1b的分离物HCV-L(图14A)和用基因型1a/2a的分离物HCV-Fan(图14C)获得类似结果。将分离物HCV-L的一些级分(6、8、10、12、14)(图14B)和分离物HCV-Fan的所有级分(4到18)进行SDS-PAGE并用MAb D32.10进行western印迹。从级分8(密度#1.10g/ml)到梯度的底部清楚地显现E1E2-D32.10反应性。值得注意的是，在与1.17到1.20g/ml的密度对应的级分11、12和13中观察到最强的E1E2反应性(图14D)。在这些级分中可检测到更高分子量(HMW)条带，可能对应于在这种密度下形成条带的病毒颗粒表面上存在的E1和E2包膜糖蛋白的寡聚形式。在级分9(密度为1.13g/ml)中观察到针对E2和E1两者的另一强反应性，对应于EIA中的峰(图14C)。所有血清来源的HCV制剂在蔗糖密度梯度(10到60％)中给出相同的E1E2-D32.10反应性平衡条带分布图。
为了进一步表征有包膜的HCV群，将HCV-Fan沉淀在1型30到45％的蔗糖梯度(2ml 30％、3ml 35％、3ml 40％、2ml 45％)中进行等密度离心。在这些实验条件下，如在图15A中所示，可清楚地见到两个E1E2-D32.10反应性峰。间接EIA显示第一个窄峰(峰1)在约1.15g/ml密度处，第二个宽大峰(峰2)在约1.18g/ml到1.22g/ml密度处。将来自蔗糖梯度(30-45％)峰1(级分8)和2(级分12和13)的颗粒单独地进行第二次平衡离心。峰1在2型30到45％蔗糖梯度(3ml 30％、3ml 35％、2ml 40％、2ml 45％)中离心(图15B)。仅有一个窄的E1E2抗原峰(峰1)迁移到1.13到1.14g/ml的密度(约32％蔗糖，级分5和6)。峰2在3型30到45％蔗糖梯度(2ml30％、2ml 35％、3ml 40％、3ml 45％)中离心(图15C)。主峰(峰2)沉降更快，在约1.18g/ml密度处(对应于40％蔗糖)显示最大E 1E 2抗原性。后面的E1E2抗原峰(峰2)显示不对称，向较低密度移动，并且与在1.14g/ml蔗糖密度形成条带的E1E2群(峰1)轻微重叠，提示比前者E1E2抗原峰(峰1)更大的异质性(图15B、15C)。
为了阐明在两群E1E2包被病毒颗粒(峰1和峰2)之间浮力密度的差异，通过Ortho HCV核心试验(图9A)和通过Western印迹(图15B)检验上述1型30到45％蔗糖梯度级分的HCV核心抗原。
简要而言，使用HCV样品作为抗原探针(1-5g/ml)，通过免疫印迹测定多肽特异性。在还原条件下(2％SDS+5％2-ME)在12.5％凝胶上进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。蛋白转移到PVDF膜上后，使用在50％NHS中稀释的抗E1E2 MAbD32.10(2到5g/ml)或抗-核心MAb 7G12A8、2G9A7和19D9D6(各5μg/ml)作为一抗，然后通过与作为二抗的偶联HRPO的抗小鼠免疫球蛋白的(Fab′)2片段(1/10,000稀释；购自Immunotech)孵育，检测结合的IgG。印迹用Amersham的增强化学发光(ECL Plus)系统显色。
两种实验方法均显示在大约1.17到1.19g/ml密度(40％蔗糖)的第二E1E2抗原峰(峰2)中回收最大HCV核心抗原反应性。通过在Western印迹(图9B)的分析，在最初的材料(HCV-Fan沉淀)和级分8到13中鉴定了25kDa的HCV核心蛋白。也检测到在50、75和150kDa的条带，其可能对应于HCV核心基因编码产物的寡聚体。通过定量RT-PCR Monitor试验(Roche)，在来自最初10到60％蔗糖梯度的所有级分中分析HCV RNA(图10)。在1.055到1.075g/ml的密度以及在1.16到1.21g/ml的密度出现两个病毒RNA峰。后面峰的总效价是106IU/ml，对应于第二E1E2抗原峰(峰2)。相比之下，级分9(密度为1.13g/ml)，其对应于峰1，含有最低效价的HCV RNA。因此，峰2(大约1.17到1.20g/ml)含有E1E2复合体、HCV核心蛋白、高效价HCV RNA并且可能代表完整病毒体。峰1(1.13到1.15g/ml)主要含有E1E2复合体，并且可能代表亚病毒颗粒(SVP)。低密度复合物(1.006到1.10g/ml)仅含有核心和HCV RNA，对应于裸核壳。
因此，使用本发明的D32.10单克隆抗体，已经分析了在慢性丙型肝炎患者的血清中发现的最普遍类型的有包膜的病毒颗粒。通过浓缩的病毒材料在蔗糖梯度中的沉降，通过免疫测定和免疫印迹分析蛋白组成(核心和包膜蛋白)，结合通过定量RT-PCR监测HCV RNA，分别鉴定了在1.13-1.15g/ml和1.17-1.21g/ml两种不同密度沉降的两群E1E2包被的颗粒。第一群对应于含有E1和E2包膜蛋白，但是缺乏核壳的亚病毒颗粒(SVP)。第二群可能对应于HCV病毒体，因为这些颗粒含有E1和E2包膜蛋白、核心蛋白和高效价的HCV RNA。
血清来源HCV颗粒的形态学表征根据下列方法进行E1E2(D32.10)-特异性单克隆抗体的免疫沉淀后HCV-Fan沉淀的电子显微镜术(免疫电子显微镜术或IEM)。
简要而言，将血清来源的HCV制剂(2、20或200μg)或来自梯度的级分(0.1ml)与0.1ml MAb D32.10(5μg)或同一同种型(IgG1)的无关单克隆抗体(F35.25，HBV抗-preSl)(Petit等，1989)混合。在37℃孵育1小时，然后在4℃孵育16小时。接着将混合物在10mlTNE缓冲液中稀释并在48,000g离心1小时。将沉淀在0.1ml TNE缓冲液中重悬。将D32.10-免疫沉淀的HCV颗粒吸附5分钟到glow-discharged Formvar/碳包被的cupron格栅上并用1％乙酸双氧铀(pH4.5)染色4分钟。然后使用JEOL 100CX电子显微镜(Imagingfacility，Laennec Faculty，Lyon，France)观察该制剂。对于间接免疫金标记，用作为二抗的山羊抗小鼠I gG胶体金颗粒的1∶50稀释液(直径10nm；BioCell Research Laboratories)孵育格栅。
对照实验显示制剂的大小不均匀随着抗原抗体比而变化(结果没有显示)。为了保持形态完整，HCV颗粒的分离过程仅涉及沉淀和蔗糖梯度离心。在这种实验条件下，如在图11A中所示，获得相对较好限定的颗粒大小分布图。不对称的峰集中在约35nm。这种大小(30到40nm)的颗粒占大多数(56％)。基本上绝大多数颗粒(80％)直径大于30nm，平均值为38.28nm(156个颗粒中的125个)，其中的20％在40到50nm之间(均值＝43.61nm)，4％在50和60nm之间(均值＝55.69nm)。所有颗粒中仅20％直径小于30nm(均值＝26.35nm)。电子显微镜照片(图11B)显示HCV颗粒以相对规则的光滑表面为特征。图11Ba和b组，例示了HCV有包膜的颗粒的大小不均匀性。图11Bc组显示直径50nm的颗粒，d组显示那些颗粒直径35nm。在35nm的颗粒表面上出现相当同质的更高密度(图11B，d组)，而在50nm直径的颗粒中央可清楚地观察到更低密度的更亮区(图11B，c组)。当使用无关的第一单克隆抗体时，通过IEM没有观察到颗粒(图11B，e组)。对蔗糖梯度峰1和2的颗粒进行免疫沉淀、染色以及通过IEM进行分析(图12A-12B)。如在图12A中所示，峰1中的绝大多数(85.4％)是直径约20nm的球形颗粒(41个颗粒中有35个，平均值＝20.6nm)。仅14.6％的颗粒直径大于30nm，可能对应于与峰2的重叠。峰2似乎比峰1材料大小更不均匀(图12B)。然而，在这群中最普遍的形式(77.5％)的平均直径约41nm(89个颗粒中有69个，均值＝41.15nm)，其可能对应于整个HCV病毒体的直径。在这种制剂中可见到一些较小的30nm直径的颗粒(13.5％)，可能由于与峰1的重叠所致。异质的主要的较快沉降峰(峰2)主要由35和50nm直径的大颗粒组成，而同质的次要的较慢沉降峰(峰1)主要由大约20nm直径的小颗粒组成。总的说来，形态学研究表明两种大小类别的E1E2包被的HCV颗粒共同存在于感染患者的血清中。通过间接免疫金标记(图13)，所有球形有包膜的颗粒，先前通过IEM鉴定，都特异性固定10nm金标记的二抗。
因此，通过用MAb D32.10的免疫-电子显微镜术，测定总的有包膜的群(富集HCV的沉淀)以及每种E1E2群各自的相对较好限定的颗粒大小分布。有包膜的HCV颗粒大小上不均匀，但是可容易地鉴定两个不同大小类别的颗粒。多数种类由直径从35nm到50nm变化的大颗粒构成，可能视包膜的晶格结构而定，对应于完整的含有衣壳的有包膜颗粒。另一种更同质的种类由直径约20nm的小颗粒构成，对应于无衣壳的SVP。进一步鉴定结合MAb D32.10的所有这些颗粒并使用用抗小鼠IgG-金颗粒的间接标记，通过电子显微镜术观察。
除了感染性的病毒体外还形成非感染性SVP是黄病毒感染的共同特征(Russel等，1980)。已提出这些代表无衣壳的空病毒包膜(Mason等，1991)。其也发生在感染乙型肝炎病毒(HBV)的细胞中，以及通过单独表达包膜蛋白生产分泌的SVP(Laub等，1983)。这些颗粒小于病毒体。这证明这些蛋白在存在或缺乏核心时内在地能够自我形成特异性微粒结构。这些颗粒装配并经历与整个病毒体相同的成熟过程，包括糖基化和碳水化合物加工。用这种重组包膜SVP的免疫显示它们在动物模型中(Konishi等，1992；Heinz等，1995)和在人中(Leroux-Roels等，1994)是极好的保护性免疫原。
完整病毒体和SVP与MAb D32.10的反应性显示，E1(297-306)-E2(480-494)(613-621)构象表位以基本上相同的方式呈现在HCV病毒体和SVP的表面上。然而，在通过基因重组获得并在异种系统棒状病毒/昆虫细胞(Baumert等，1999)或反转录病毒/293T细胞(Bartosch等，2003)中生产的颗粒上缺乏在血清来源的病毒体和SVP上检测到的这种表位，提示这种复合位点缺乏和/或存在于这些重组HCV颗粒表面上分开的难接近的区域上。前者HCV样颗粒(HCV-LP)保留在ER中，后者HCV假颗粒(HCVpp)中仅有一小部分到达细胞表面。值得注意的是MAb D32.10既不与HSA也不与免疫球蛋白的γ或μ链反应。其能够特异性免疫沉淀E1、E2以及E1E2异二聚体，当这两种蛋白分别或者一起由痘苗病毒重组体在HepG2细胞中表达时。其因此主要与二硫键连接的聚集体反应，与E1E2非共价连接的成熟复合物的反应更微弱。然而，通过印迹分析，其不识别在这种异种系统中所表达的变性的重组E1或E2蛋白。这有利于在血清来源的病毒表面上E1、E2和E1E2的排列，其不同于在重组HCV颗粒中发现的排列。天然结构依赖于装配条件。如果在异种系统中缺乏调控独特结构形成的条件，那么当两者都分离自感染患者的血清时，与SVP和病毒体表面的相似形成对照，VLP和HCVpp中二聚体的排列不相似。在重组亚病毒颗粒(RSP)和病毒体中，黄病毒包括蜱传脑炎病毒(TBEV)的包膜蛋白(E)包装的一个特别值得注意的特征是，它们以头到尾的取向平躺在病毒表面上(Ferlengi等，2001)。结构域III上的侧表面，其具有Ig样折叠并参与受体结合，容易接近，而融合肽是一种内环(Rey等，1995)。因此，黄病毒通过受体介导的胞吞作用和在内体中低pH诱导的融合进入细胞(Rice，1996)。据信正在装配的颗粒通过经由ER或早期分泌途径的中间区室的膜出芽而获得其包膜。颗粒然后通过高尔基体外侧网络(TGN)被运输到质膜，成熟并因此获得复合糖。所有这些步骤对于病毒装配都是关键的，并且在复制循环的许多阶段中都起着决定性的作用。
出乎意料地，所有HCV颗粒似乎都显示相似的生物物理属性，无论它们来源为何。在昆虫细胞中装配的、来自HCV-J株cDNA或来自感染性克隆H77c的HCV-LP的蔗糖梯度沉降模式在蔗糖平衡梯度中是1.14到1.20g/ml(Wellnitz等，2002)。大多数颗粒的直径是40到60nm。然而，在HCV-LP外表面的E1和E2胞外域上存在的所有表位(Wellnitz等，2002)与MAb D32.10的E1和E2特异性不同。因此，即使颗粒在蔗糖中以同一密度沉降，它们也具有不同的免疫反应性，其可能与不适当的转运和/或折叠有关，并且在细胞结合和感染性方面将明显地导致不同的功能特性。
与血清有包膜的HCV颗粒相反，从感染HCV个体的血浆中分离的HCV核心颗粒似乎与在昆虫细胞中所生产的核壳样颗粒相似。HCV核壳在CsCl梯度中1.32到1.34g/ml的密度形成条带，并且在大小上非常不均匀，直径从38到62nm(Maillard等，2001)。所有这些颗粒都与抗核心MAb反应，但是不与通过用重组蛋白免疫所产生的抗E1和抗E2 MAb反应(Deleersnyder等，1997；Dubuisson等，1994)。
因此，不同类型的HCV相关颗粒(HCV-LP、血清HCV核壳、血清HCV病毒体)在大小和/或密度上具有一些相似之处，但是显示不同抗原特性(E1E2复合体、有包膜的病毒体或无包膜核壳的不适当的或适当的折叠)。因此，总之这证明具有好的免疫学工具对于分析HCV颗粒的真实抗原性质很重要，同样地对于鉴定天然HCV病毒体也很重要。
根据这些数据和其它人的那些数据(Andre等，2002；Maillard等，2001)，能获得更多关于在慢性丙型肝炎患者血清中循环的不同形式HCV相关颗粒的完整谱知识。蔗糖梯度中的低密度级分(1.06g/ml)含有衣壳样结构，与脂蛋白结合形成脂-病毒-颗粒(LVP)，以及视个别变异而定与HCV RNA和免疫球蛋白结合(Andre等，2002)。LVP表现为直径大于100nm的大颗粒，通过LDL受体结合肝细胞系(Andre等，2002)。从去污剂处理的血清中分离的无包膜的HCV核壳在CsCl中的浮力密度是1.32到1.34g/ml，大小上不均匀(Maillard等，2001)，最近表明其显示FγR样活性(Maillard等，2004)，这可解释含有HCV RNA的颗粒与“非免疫”抗体结合作为在蔗糖梯度中高密度(1.28到1.35g/ml)的HCV核心-IgG复合物。中间密度的级分，在1.13到1.21g/ml之间，这里鉴定为E1E2包被的HCV颗粒。假定的整个HCV病毒体(由核壳、脂膜以及两个E1和E2包膜糖蛋白构成)的平均密度(1.18到1.20g/ml)，与黄病毒的平均密度相似(Bradley等，1991)。从MAb D32.10的精细特异性推出的侧面包膜蛋白相互作用的假设也与来自TBEV的重组SVP和整个病毒颗粒的包膜的组织相似(Schalich等，1996)。最后，在感染HCV患者血清中存在仅含有E1E2包膜蛋白，显示不同沉降性质(1.13到1.15g/ml)以及不同颗粒大小(≈20nm)，但是与整个病毒颗粒具有相似抗原特征的SVP，这支持HCV和黄病毒之间的一些相似性。
总之，通过使用新的MAb D32.10，第一次鉴定了(i)HCV完整病毒体，含有HCV RNA和核心抗原，在其表面上表达E1E2包膜复合物，作为“大颗粒”，直径35-50nm并在1.17-1.21g/ml形成条带；(ii)包膜SVP的HCV群，作为“小颗粒”，缺乏衣壳和HCV RNA，直径20-30nm并在1.13-1.15g/ml形成条带。
这种有包膜的颗粒可能因此代表研究HCV包膜糖蛋白结构-功能关系的相关模型，并且是接种方法的极好候选物。另外，在不同组患者中以及在HCV相关疾病的不同阶段进一步追踪循环HCV颗粒的谱将会是有趣的。
实施例3获得针对纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的单克隆抗体将在蔗糖密度梯度中进行等密度离心、含有纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的上面所提到的富集HCV沉淀的级分，用于制备单克隆抗体。将这种级分用于免疫小鼠并根据上述说明分离杂交瘤。由此获得一种单克隆抗体，(D4.12.9)，其显示出特异性识别天然HCV E2蛋白，在Western印迹实验中(图6)，和天然HCV病毒颗粒，如在实施例2中证实的(图7)。事实上，图7显示D4.12.9以与D32.10相似的方式识别HCV有包膜的亚病毒颗粒(级分8到11)和HCV有包膜的完整病毒颗粒(级分11到14)。
实施例4来自感染患者的抗HCV抗体的表位表征通过使用包括它们本身的肽，评价E1和E2衍生的与D32.10反应的肽序列(实施例1)对感染HCV患者的血清的免疫反应性。
生产E1(第290-317位氨基酸)和E2(第471-500位和第605-629位氨基酸)序列作为生物素化的合成肽，通过ELISA用11份健康个体的血清和44份感染HCV患者的血清(编为A1到A44)进行检验。
用100μl溶于0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)，浓度为10μg/ml的链霉抗生物素在4℃过夜包被微量滴定平板孔，并用含有10％山羊血清的PBS在37℃封闭1小时。然后在加入100μl生物素化肽溶液(在PBS中10μg/ml)在37℃孵育2小时前，用含有0.05％吐温-20的PBS洗涤平板三次。用PBS-吐温新冲洗后，加入100μl在含有10％山羊血清的PBS-吐温中1∶50稀释的检验血清，并且在37℃孵育2小时。再次用PBS-吐温冲洗平板。然后加入在PBS-吐温-山羊血清中1∶5000稀释的二抗-偶联过氧化物酶的山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories)。平板在37℃孵育1小时，然后用PBS-吐温再冲洗一次。使用含有邻苯二胺和过氧化氢的Biomerieux颜色试剂盒使平板显色。孵育10分钟后，用ELISA读板器在492nm读取平板。报告值是一式三份的平均OD。
计算每种肽的截止识别(用HCV阴性血清获得的均值+3倍标准偏差)。其允许证明44份HCV阳性血清中有6份产生抗E1(第290-317位氨基酸)(图8A)、44份中有6份产生抗E2(第471-500位氨基酸)(图8B)以及44份中有16份产生抗E2(第605-629位氨基酸)(图8C)的阳性反应。血清A7、A14、A21、A33、A39和A40与这三种肽产生阳性信号，而E2(605-629)也被10份更多血清识别。
在感染HCV患者血清中存在能与由D32.10mAb识别的E1和E2的三个区域同时反应的特异性抗体，强烈支持它们在循环的有包膜的HCV病毒颗粒表面的毗邻以及它们在小鼠和在人中的免疫原性。
参考文献Andre，P.，F.Komurian-Pradel，S.Deforges，M.Perret，J.L.Berland，M.Sodoyer，S.Pol，C.Brechot，G.Paranhos-Baccala，和V.Lotteau.2002.Characterizationof low-and very-low-density hepatitis C virus RNA-containing particles.JVirus 766919-28Aoyagi K，Ohue C，Iida K，Kimura T，Tanaka E，Kiyosawa K，Yagi S.J.Clin.Microbiol.(1999)371802-1808Bartenschlager R，Lohman V.J Gen.Virol.(2000)811631-1648Bartosch，B.，J.Dubuisson，和F.L.Cosset.2003.Infectious hepatitis C viruspseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.JExp Med 197633-42.
Baumert，T.F.，J.Vergalla，J.Satoi，M.Thomson，M.Leclzmann，D.Herion，H.B.Greenberg，S.Ito，和T.J.Liang.1999.Hepatitis C virus-like particlessynthesized in insect cells as a potential vaccine candidate.Gastroenterology1171397-407.
Bradley，D.，K.McCaustland，K.Krawczynski，J.Spelbring，C.Humphrey，和E.H.Cook.1991.Hepatitis C virusbuoyant density of the factor VIII-derivedisolate in sucrose.J Med Virol 34206-8.
Buttin B，Leguern C，Phalente L，Lin ECC，Medrano L，Cazenave PA.Curr.Top.Microbiol.Immun.(1978)8127-36Choo QL，Kuo G，Weiner AJ，Overby LR，Bradley DW，Houghton M.Science(1989)244359-362Choo QL，Richman KH，Han JH，Berger K，Lee C，Dong C，Gallegos C，Coit D，Medina-Selby R，Barr PJ，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)882451-2455Clarke B.J.Gen.Virol.(1997)782397-410Colucci，G.，and K.Gutekunst.1997.Development of a quantitative PCR assayfor monitoring HCV viraemia levels in patients with chronic hepatitis C.J ViralHepat 4 Suppl 175-8.
Damen M，SillekensP，Cuypers HT，Frantzen I，Melsert R.J Virol.Methods(1999)8245-54Deleersnyder V，Pillez A，Wychowsld C，Blight K，Xu J，Hahn YS，Rice CM，Dubuisson J.Journal of Virology(1997)71697-704Dubuisson，J.，H.H.Hsu，R.C.Cheung，H.B.Greenberg，D.G.Russell，和C.M.Rice.1994.Formation and intracellular localization of hepatitis C virusenvelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia and Sindbisviruses.J Virol 686147-60.
Dubuisson J，Rice C.Journal of Virology(1996)70778-786Dubuisson J.Current Topics in Microbiology and Imunology(2000)242135-148Ferlenghi，I.，M.Clarke，T.Ruttan，S.L.Allison，J.Schalich，F.X.Heinz，S.C.Harrison，F.A.Rey，和S.D.Fuller.2001.Molecular organization ofa recombinant subviral particle from tick-borne encephalitis virus.Mol Cell7593-602.
Frank R9 Doring R.Tetrahedron (1988)446031-6040Heinz，F.X.，S.L.Allison，K.Stiasny，J.Schalich，H.Holzmann，C.W.Mandl，和C.Kunz.1995.Recombinant and virion-derived soluble and particulateimmunogens for vaccination against tick-borne encephalitis.Vaccine 131636-42.
Hijikata，M.，Y.K.Shimizu，H.Kato，A.Iwamoto，J.W.Shih，H.J.Alter，R.H.Purcell，and H.Yoshikura.1993.Equilibrium centrifugation studies ofhepatitis C virusevidence for circulating immune complexes.J Virol 671953-8.
Jolivet-Reynaud C，Dalbon P，Viola F，Yvon S，Paranhos-Baccala.G，Piga N，Bridon L，Trabaud MA，Battail N，Sibai G，Jolivet M.J Med Virol(1998)56300-309Kanto，T.，N.Hayashi，T.Takehara，H.Hagiwara，E.Mita，M.Naito，A.Kasahara，H.Fusamoto，和T.Kamada.1995.Density analysis of hepatitis C virus particlepopulation in the circulation of infected hostsimplications for virusneutralization or persistence.J Hepatol 22440-8Kohler G，Milstein C.Nature(1975)256495-497Konishi，E.，S.Pincus，E.Paoletti，R.E.Shope，T.Burrage，和P.W.Mason.1992.Mice immunized with a subviral particle containing the Japaneseencephalitis virus prM/M and E proteins are protected from lethal JEV infection.Virology 188714-20.
Laub，O.，L.B.Rall，M.Truett，Y.Shaul，D.N.Standring，P.Valenzuela，和W.J.Rutter.1983.Synthesis of hepatitis B surface antigen in mammalian cellsexpression of the entire gene and the coding region.J Virol 48271-80.
Leroux-Roels，G.，E.Van Hecke，W.Michielsen，P.Voet，P.Hauser，and J.Petre.1994.Correlation between in vivo humoral and in vitro cellular immuneresponses following immunization with hepatitis B surface antigen(HBsAg)vaccines.Vaccine 12812-8.
Longo，M.C.，M.S.Berninger，和J.L.Hartley.1990.Use of uracil DNAglycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions.Gene 93125-8.
Lowry O，Rosebrough A，Farr A，Randall R.BiBiol.Chem.(1951)193265-275Maillard，P.，K.Krawczynski，J.Nitkiewicz，C.Bronnert，M.Sidofkiewicz，P.Gounon，J.Dubuisson，G.Faure，R.Crainic，和A.Budkowska.2001.
Nonenveloped nucleocapsids of hepatitis C virus in the serum of infectedpatients.J Virol 758240-50.
Maillard，P.，J.P.Lavergne，S.Siberil，G.Faure，F.Roohvand，S.Petres，J.L.Teillaud，和A.Budkowska.2004.Fc{gamma}Receptor-like Activity ofHepatitis C Virus Core Protein.J Biol Chem 2792430-2437.
Mason，P.W.，S.Pincus，M.J.Fournier，T.L.Mason，R.E.Shope，和E.Paoletti.1991.Japanese encephalitis virus-vaccinia recombinants produceparticulate forms of the structural membrane proteins and induce high levelsof protection against lethal JEV infection.Virology 180294-305.
Menez，R.，M.Bossus，B.H.Muller，G.Sibai，P.Dalbon，F.Ducancel，C.Jolivet-Reynaud，和E.A.Stura.2003.Crystal structure of a hydrophobicimmunodominant antigenic site on hepatitis C virus core protein complexed tomonoclonal antibody 19D9D6.J Immunol 1701917-24.
Op De Beeck A，Cocquerel L，Dubuisson J.J.Gen.Virol.(2001)822589-95Pearson WR，和Lipman DJ.Proc Natl Acad Sci USA(1988)852444-2448Petit MA，Capel F，Riottot MM，Dauguet C，Pillot J.J.Gen.Virol.(1987)682759-2767Petit，M.A.，S.Dubanchet，和F.Capel.1989.A monoclonal antibody specificfor the hepatocyte receptor binding site on hepatitis B virus.Mol Immunol 26531-7.
Rey，F.A.，F.X.Heinz，C.Mandl，C.Kunz，和S.C.Harrison.1995.Theenvelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution.Nature 375291-8.
Rice，C.1996.Flaviviridaethe viruses and their replication，p.931-959.In K.D.Fields BN，Howley PM，Chanock RM，Melnick JL，Monath TP，Roizman nB，and Straus SE(编)，Virology.Lippincott-Raven，Philadelphia，PA.Russell，P.，BrandtWE和Dalrymple JM.1980.Chemical and antigenic structureof flaviviruses，p.503-529.In S.RW(编)，The Togaviruses.Biology，Structure，Replication.Academic Press，New York.
Sambrook J，Fritsch E，Maniatis T.Molecular Cloning.A Laboratory Manual(1982)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NYSanger F，NicklenS，Coulson AR.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1977)745463-5467Sato K，Okamoto H，Aihara S，Hoshi Y，Tanaka T，Mishiro S.Virology(1993)196354-357Schalich，J.，S.L.Allison，K.Stiasny，C.W.Mandl，C.Kunz，和F.X.Heinz.1996.Recombinant subviral particles from tick-borne encephalitis virus arefusogenic and provide a model system for studying flavivirus envelopeglycoprotein functions.J Virol 704549-57Scott JK，Smith GP.Science(1990)249386-390Thomssen，R.，S.Bonk，C.Propfe，K.H.Heermann，H.G.Kochel，和A.Uy.1992.
Association of hepatitis C virus in human sera with beta-lipoprotein.MedMicrobiol Immunol(Berl)181293-300.
Wellnitz，S.，B.Klumpp，H.Barth，S.Ito，E.Depla，J.Dubuisson，H.E.Blum，和T.F.Baumert.2002.Binding of hepatitis C virus-like particles derivedfrom infectious clone H77C to defined human cell lines.J Virol 761181-93.
Yagnik AT，Lahm A，Meola A，Roccasecca R M，Ercole BB，Nicosia A，TramontanoA.Proteins(2000)40355-366Yoshikura，H.，M.Hijikata，N.Nakajima，和Y.K.Shimizu.1996.Replicationof hepatitis C virus.J Viral Hepat 33-10.
Young KK，Resnick RM，Myers TW.J.Clin.Microbiol.(1993)31882-886
序列表<110>INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALEBIOMERIEUX<120>针对丙型肝炎病毒的新抗体、易于被所述抗体识别的颗粒组合物及含有它们的药物组合物<130>WOB 03 AG INS VHC1<160>27<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>1Arg His Trp Thr Thr Gln Gly Cys Asn Cys1 5 10<210>2<211>15<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>2Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys1 5 10 15<210>3<211>9<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>3Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr1 5<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ccctcatagt tagcgtaacg20<210>5<211>20<212>PRT<213>丙型肝炎病毒
<400>5Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Thr Gln Gly1 5 10 15Cys Asn Cys Ser20<210>6<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>6Ser Pro Leu Arg His Tyr Glu Leu Pro Leu Ile Gln1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>7Trp Pro His Asn His Ser Thr His Ser Arg Thr His1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>8Phe Pro Lys Tyr His Pro Arg Phe His Lys His Ala1 5 10<210>9<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>9Ser Gln Arg Ser Arg His Trp His Asp Val Pro Lys1 5 10
<210>10<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>10Thr Ser Gln Pro Arg Trp His Gln Lys Pro Ala Thr1 5 10<210>11<211>21<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>11Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly1 5 10 15Ile Ala Tyr Phe Ser20<210>12<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>12Trp Lys Met Pro Arg Ala Thr Asp Trp Asn Leu Arg1 5 10<210>13<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>13His Trp Gly Asn His Ser Lys Ser His Pro Gln Arg1 5 10<210>14<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽
<400>14Trp His Arg Thr Pro Ser Thr Leu Trp Gly Val Ile1 5 10<210>15<211>21<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>15Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys ProCys Gly Ile1 5 10 15Val Pro Ala Lys Ser20<210>16<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>16Trp His Lys Leu Pro Gly His Pro Arg Thr Val1 5 10<210>17<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>17Thr Phe Ala Trp His Lys Pro Arg Val Asn Leu Gly1 5 10<210>18<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>18His Ser Ser Trp Tyr Ile Gln His Phe Pro Pro Leu1 5 10<210>19
<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>19Phe Pro Ala His Pro Leu Pro Arg Leu Pro Ser Leu1 5 10<210>20<211>22<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>20Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr1 5 10 15Ile Phe Lys Ile Arg Met20<210>21<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>21Trp His Trp Asn Lys Pro Ile Ile Arg Pro Pro Leu Arg1 5 10<210>22<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>22Gln Pro Tyr Lys Leu Gln Ala Ala Ala Thr Leu Tyr1 5 10<210>23<211>14<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>23Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp1 5l0
<210>24<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>24His Leu Tyr His Lys Asn Arg Asn His His Ile Ala Tyr1 5 10<210>25<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体展示肽<400>25Trp Ser Pro Gly Gln Gln Arg Leu His Asn Ser Thr1 5 10<210>26<211>8<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>26Gly Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys1 5<210>27<211>8<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>27Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys1 权利要求
1.能特异性结合天然HCV病毒包膜的构象抗体。
2.根据权利要求1的构象抗体，能够特异性结合天然HCV E2蛋白。
3.根据权利要求1或2的构象抗体，能够中和患者的HCV感染。
4.根据权利要求1到3中任何一项的构象抗体，能够沉淀在其共价或非共价形式下的HCV E1E2复合体。
5.根据权利要求1到4中任何一项的构象抗体，能够特异性结合天然HCV E1蛋白。
6.根据权利要求1到5中任何一项的构象抗体，能够特异性结合天然HCV E1蛋白、结合天然HCV E2蛋白以及能够沉淀在其共价或非共价形式下的HCV E1E2复合体。
7.根据权利要求1到6中任何一项的构象抗体，能够特异性结合由下列序列中的至少一种构成的表位-HCV蛋白E1第297到306位氨基酸(SEQ ID NO1)；-HCV蛋白E2第480到494位氨基酸(SEQ ID NO2)；-HCV蛋白E2第613到621位氨基酸(SEQ ID NO3)。
8.根据权利要求7的构象抗体，能够特异性结合由下列序列中的每一种构成的表位-HCV蛋白E1第297到306位氨基酸(SEQ ID NO1)；-HCV蛋白E2第480到494位氨基酸(SEQ ID NO2)；-HCV蛋白E2第613到621位氨基酸(SEQ ID NO3)。
9.根据权利要求1到8中任何一项的构象抗体，其中所述的抗体是单克隆抗体。
10.根据权利要求1到9中任何一项的单克隆抗体，由2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2983的杂交瘤分泌。
11.根据权利要求1到9中任何一项的单克隆抗体，由2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culture deMicroorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2982的杂交瘤分泌。
12.2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culturede Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2983的杂交瘤。
13.2003年3月19日在CNCM(Collection Nationale de Culturede Microorganismes，Institut Pasteur，Paris，France)保藏的登录号为CNCM I-2982的杂交瘤。
14.药物组合物，包含至少一种权利要求1到11的抗体作为活性物质和药学上可接受的载体。
15.至少一种权利要求1到11的抗体用于制备诊断、预防或治疗HCV感染的药物的用途。
16.能结合至少一种权利要求10或11的抗体的有包膜的病毒颗粒。
17.结合权利要求16的有包膜的病毒颗粒的抗体。
18.源自人血液、血浆或血清最初样品的HCV病毒颗粒的组合物，其中HCV RNA拷贝的浓度比其来源的人血液、血浆或血清最初样品中的HCV RNA拷贝浓度高约100到1000倍，特别是高于约107拷贝/ml。
19.根据权利要求18的组合物，其中HCV RNA拷贝数是从每毫克蛋白约108到约109UI。
20.根据权利要求18或19的组合物，其中所述组合物的体积是从约0.1ml到约10ml。
21.实质上缺乏HCV RNA和缺乏HCV核心蛋白的分离的HCV有包膜的亚病毒颗粒。
22.根据权利要求21的分离的HCV有包膜的亚病毒颗粒，其中所述亚病毒颗粒易于结合权利要求1到11的任何抗体。
23.组合物，其包含纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒，所述纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒含有HCV RNA、HCV核心蛋白和HCV包膜，并且易于结合权利要求1到11的任何抗体。
24.制备HCV病毒颗粒的组合物的方法，包括下列步骤-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两次超速离心，以获得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀以获得HCV病毒颗粒的组合物。
25.HCV病毒颗粒的组合物，如根据权利要求24的方法获得。
26.制备HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物的方法，包括下列步骤-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两次超速离心，以获得富集HCV的沉淀；在水溶液中重悬富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速离心重悬的富集HCV的沉淀以将重悬的富集HCV的沉淀的组成成份根据它们的密度分离成级分；-回收实质上不含HCV RNA、实质上不含HCV核心蛋白以及含有能结合权利要求10或11的单克隆抗体的颗粒的级分，特别是蔗糖密度为大约1.13到1.15g/ml的级分，以获得HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物。
27.HCV有包膜的亚病毒颗粒的组合物，如根据权利要求26的方法获得。
28.制备纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物的方法，包括下列步骤-对从HCV感染患者的澄清的血浆取出法得到的样品进行至少两次超速离心，以获得富集HCV的沉淀；-在水溶液中重悬富集HCV的沉淀；-在蔗糖密度梯度中超速离心重悬的富集HCV的沉淀以将重悬的富集HCV的沉淀的组成成份根据它们的密度分离成级分；-回收含有每毫升从约5.105到约106UI的HCV RNA、每毫升从约50到约100pg的HCV核心蛋白，以及含有能结合权利要求10或11的单克隆抗体的颗粒的级分，特别是蔗糖密度为大约1.17到1.21g/ml的级分，以获得纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物。
29.纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物，如根据权利要求28的方法获得。
30.制备权利要求10的单克隆抗体的方法，包括下列步骤-用根据权利要求18的HCV病毒颗粒的组合物，或者如根据权利要求24制备的组合物免疫动物，特别是哺乳动物，并回收产生的抗体；-在所产生的抗体中，根据它们结合在上面所提到的HCV病毒颗粒的组合物中所包含的HCV病毒颗粒的能力，选择单克隆抗体。
31.制备权利要求11的单克隆抗体的方法，包括下列步骤-用根据权利要求23的纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物，或者如根据权利要求28制备的组合物免疫动物，特别是哺乳动物，并回收产生的抗体；-在所产生的抗体中，根据它们结合在上面所提到的纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的组合物中所包含的纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒的能力，选择单克隆抗体。
32.药物组合物，其包含权利要求21或22的亚病毒颗粒或者权利要求27的组合物作为活性物质，以及药学上可接受的载体。
33.权利要求21或22的HCV有包膜的亚病毒颗粒或者权利要求27的组合物的用途，用于诱导针对所述HCV有包膜的亚病毒颗粒或者针对如在权利要求22中所定义的HCV有包膜的完整病毒颗粒的免疫反应。
34.权利要求21或22的HCV有包膜的亚病毒颗粒或者权利要求27的组合物的用途，用于制备诊断、预防或治疗HCV感染的药物。
全文摘要
本发明涉及针对HCV的新构象抗体以及更特别地涉及单克隆抗体。本发明还涉及易于被所述抗体识别的颗粒的组合物，以及涉及包含它们的药物组合物。本发明还涉及HCV有包膜的亚病毒颗粒或纯化的HCV有包膜的完整病毒颗粒，以及制备它们的方法。
文档编号C12N7/00GK1768078SQ200480008734
公开日2006年5月3日 申请日期2004年3月31日 优先权日2003年4月1日
发明者M-A·珀蒂, C·洛利夫雷-雷诺 申请人:国家健康医学研究所, 拜奥默里克斯股份有限公司