抑制细胞生长的组合物和方法

专利名称：：抑制细胞生长的组合物和方法
技术领域：
：本发明涉及生物科学领域，更具体地说涉及癌症研究领域。特别地，本发明涉及包含ZNFN3A1小干扰RNA(smallinterferingRNA)(siRNA)的组合物。
背景技术：
：肝细胞癌(HCC)是五种最常见的癌症之一，是世界上癌症死亡的第四大主因。尽管最新的医学发展已经在诊断疾病方面取得了很大进展，仍有大量患有HCC的病人在晚期才被诊断出来。大多数病人由于严重的肝功能障碍、散布的和/或多发的肿瘤，或高复发率而没有通过外科切除术来治疗。因此开发高效的化学治疗药物和预防策略是紧迫关切的事情。
发明内容本发明基于一项令人惊讶的发现，即针对ZNFN3A1而加以选择的小干扰RNA(siRNA)能有效地抑制各种癌细胞的细胞生长，包括那些参与HCC的癌细胞。本发明提供抑制细胞生长的方法。提供的方法包括那些包括用包含ZNFN3A1小干扰RNA(siRNA)的组合物接触细胞的方法。本发明还提供抑制个体的肿瘤细胞生长的方法。这种方法包括向个体施用包含ZNFN3A1小干扰RNA(siRNA)的组合物。本发明的另一个方面提供在生物样品的细胞中抑制ZNFN3A1基因的表达的方法。可以通过以足够抑制ZNFN3A1基因表达的数量将双链核糖核酸(RNA)分子导入到细胞中来抑制基因的表达。本发明的另一个方面涉及包括核酸序列和载体的产品，和涉及包含它们的组合物，在例如所提供的方法中是有用的。在提供的产品之中包括siRNA分子，当被导入到表达所述基因的细胞中时具有抑制ZNFN3A1基因的表达的性质。在这样的分子之中，包括那些包含有义链和反义链的分子，其中有义链包含相应于ZNFN3A1目标序列的核糖核苷酸序列，其中反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列。所述分子的有义链和反义链相互杂交以形成双链分子。此处使用的术语“有机体”是指任何由至少一个细胞组成的活体。活有机体可以简单到，例如，单个真核细胞，或复杂到如哺乳动物，包括人类。此处使用的术语“生物样品”是指整个有机体或其组织、细胞或组成部分的子集(例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿、阴道液和精液)。“生物样品”进一步指从整个有机体或其细胞、组织或组成部分的子集制备出的组织匀浆、溶胞产物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生物样品”是指一种有机体已经在其中繁殖了的、包含细胞组分例如蛋白质或多核苷酸的培养基，例如营养肉汤或凝胶。本发明以抑制细胞生长的方法为特色。通过用ZNFN3A1小干扰RNA(siRNA)的组合物接触细胞来抑制细胞生长。ZNFN3A1是在肿瘤，例如肝细胞癌或直肠腺癌中过量表达的锌指蛋白。通过本发明可以抑制表达ZNFN3A1的细胞的生长。进一步用转染增强剂接触细胞。可体外、体内或回体(exvivo)提供细胞。个体是哺乳动物，例如，人类、非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。所述细胞是肝细胞或结肠细胞。做为选择，所述细胞是肿瘤细胞(即，癌细胞)例如结直肠癌细胞或肝癌细胞。例如，所述细胞是结直肠腺癌细胞或肝细胞癌细胞。抑制细胞生长意思是与未处理的细胞相比，被处理的细胞以更低的速率增殖、或具有降低了的生活力。通过本领域已知的增殖分析来测量细胞生长。术语“siRNA”是指阻止目标mRNA的翻译的双链RNA分子。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括那些把用于转录RNA的DNA作为模板的技术。siRNA包括有义ZNFN3A1核酸序列、反义ZNFN3A1核酸序列、或两者。构建siRNA，以使单个转录产物兼备来自目标基因的有义序列和互补的反义序列，例如发夹序列。本方法被用于改变细胞中的基因表达，在所述细胞中作为例如细胞的恶性转化的结果，ZNFN3A1的表达是上调的。在目标细胞中所述siRNA与ZNFN3A1转录产物的结合导致细胞ZNFN3A1生产的减少。寡核苷酸的长度至少为10个核苷酸，也可以与自然发生的ZNFN3A1转录产物一样长。优选的，寡核苷酸长度为19-25个核苷酸。最优选的，寡核苷酸长度小于75、50或25个核苷酸。抑制哺乳动物细胞中ZNFN3A1表达的ZNFN3A1siRNA寡核苷酸的实例包括包含目标序列的寡核苷酸，例如，SEQIDNO1的451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、1065-1085和1258-1278位核苷酸。具有在靶细胞中抑制基因表达的能力的双链RNA的设计方法是已知的。(例如参见，美国专利No.6,506,559，将其作为参考完全引用)。例如，设计siRNA的计算机程序可以从Ambion网站(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)获得。计算机程序根据以下方案选择用于siRNA合成的核苷酸序列。siRNA目标位点的选择1.从转录产物的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA二核苷酸序列。记录每个AA的发生和3′相邻的19个核苷酸，以作为潜在的siRNA目标位点。Tuschal等建议不将siRNA设计至5′和3′非翻译区(UTR)和接近起始密码子的区域(75个碱基内)，因为这些可能较富含调节蛋白结合位点。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。2.将所述潜在的目标位点与适当的基因组数据库(人类、小鼠、大鼠等)进行比较，并排除考虑任何与其他编码序列具有显著同源性的目标序列。我们建议利用BLAST，其可以在NCBI服务器上找到www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/3.选择合格的目标序列用于合成。沿着需评估的基因的长度方向选择几个目标序列是一般性的方法。也被包括在本发明中的是包括目标序列的核酸序列的分离的多核苷酸，所述目标序列例如，SEQIDNO1的451-471(SEQIDNO58)、532-552(SEQIDNO60)、623-643(SEQIDNO61)、625-645(SEQIDNO62)、636-656(SEQIDNO63)、726-746(SEQIDNO64)、923-943(SEQIDNO66)、1065-1085(SEQIDNO68)和1258-1278(SEQIDNO69)位核苷酸，或与SEQIDNO1的451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、1065-1085和1258-1278位核苷酸的核酸序列互补的多核苷酸。此处使用的“分离的核酸”是从其原始环境(例如，如果是自然发生的，指自然环境)移出了的、因而从其自然状态中被综合地改变了的核酸。在本发明中，分离的核酸包括DNA、RNA和其衍生物。当所述分离的核酸是RNA或其衍生物时，在核苷酸序列中碱基“t”应当被替换为“u”。此处使用的术语“互补”是指在多核苷酸的核苷酸单位之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语“结合”意思是在两个多肽或化合物、或相关的多肽或化合物，或它们的组合之间物理的或化学的相互作用。在适当的条件下互补的核酸序列杂交形成包含很少或不包含错配的稳定的双链体。此外，本发明的分离的核苷酸的有义链和反义链可以通过杂交形成双链核苷酸或发夹环结构。在一个优选的实施方式中，这种双链体每10个配对中包含不超过1个错配。在特别优选的实施方式中，当所述双链体的链完全互补时，这种双链体不包含错配。所述多核苷酸的长度小于1622个核苷酸。例如，所述多核苷酸长度小于500、200或75个核苷酸。本发明还包括包含此处描述的一个或多个核酸的载体，和包含所述载体的细胞。本发明的分离的核酸对于针对ZNFN3A1的siRNA或编码所述siRNA的DNA是有用的。当所述核酸用于siRNA或其编码DNA时，有义链优选的长于19个核苷酸，更优选的长于21个核苷酸。本发明某种程度上基于这种发现，编码锌指蛋白ZNFN3A1的基因与在非癌性肝组织中相比、在肝细胞癌(HCC)中是过量表达的。ZNFN3A1cDNA长度是1622个核苷酸。1284大小的ORF编码了具有锌指基序的428个氨基酸的蛋白质。ZNFN3A1的核酸和多肽序列在表1和表2中显示。在表1中，5′和3′非翻译区用斜体表示，起始和终止密码子用粗体表示。ZNFN3A1蛋白的亚细胞定位在细胞周期进展期间和根据培养细胞的密度发生变化。当细胞处于中期到晚期S期、或细胞在稀疏条件下培养时，ZNFN3A1蛋白在核中积聚。而当细胞处于细胞周期的其他期、或以密集条件生长时，ZNFN3A1蛋白位于细胞质中以及位于核中。ZNFN3A1在体内与KIAA0054蛋白和RNA聚合酶II形成三元复合物，三元复合物通过直接与5’侧翼区的元件“5’-CCCTCC-3’”结合来活化下游基因包括表皮生长因子受体(EGFR)的转录。在NIH3T3细胞中ZNFN3A1的外源性表达导致细胞生长的增加。与此相反，用反义S-寡核苷酸抑制其表达导致肝癌细胞的生长抑制。抑制细胞生长的方法本发明涉及通过抑制ZNFN3A1表达来抑制细胞生长，即，癌细胞生长。通过特异性靶向ZNFN3A1基因的小干扰RNA(siRNA)来抑制ZNFN3A1表达。ZNFN3A1目标包括，例如SEQIDNO1的451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、1065-1085和1258-1278位核苷酸。在非哺乳动物细胞中，已经显示出双链RNA(dsRNA)能发挥强烈的和特异性的对基因表达的沉默效应(silencingeffect)，这被称为RNA干扰(RNAi)(3)。通过包含RNaseIII基序的酶将dsRNA加工成被称为小干扰RNA(siRNA)的20-23个核苷酸的dsRNA。siRNA利用多组分的核酸酶复合物特异性地靶向互补的mRNA(4，5)。在哺乳动物细胞中，带有19个互补核苷酸和3′末端非互补胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷二聚体的20或21聚体的dsRNA组成的siRNA，已经显示出具有基因特异性敲除效果，而不导致基因表达的全局性变化(6)。此外，包含小核RNA(snRNA)U6或聚合酶IIIH1-RNA启动子的质粒有效地产生这种短RNA，其间征募RNA聚合酶III的III型类别，从而可以组成型地抑制其目标mRNA(7，8)。构建13种不同的表达质粒来表达发夹环化的ZNFN3A1-siRNA(参见实施例2)。测试质粒抑制细胞生长的能力。四种质粒(psiU6BX-ZNFN3A1-4、-8、-12和-13)显著地抑制、五种质粒(psiU6BX-ZNFN3A1-2、-5、-6、-7和-10)中度地抑制内源性ZNFN3A1表达，而其余四种质粒(psiU6BX-ZNFN3A1-1、-3、-9和-11)对表达没有显示出效果、或显示出很小的效果。(附图1)。用psiU6BX-siZNFN3A1-12转染的各种人类肝癌和结直肠癌细胞，与对照质粒相比，显示出降低数量的存活细胞。FACS分析显示它们由于细胞凋亡而死亡。通过用包含ZNFN3A1siRNA的组合物接触细胞来抑制细胞生长。进一步用转染剂接触细胞。适合的转染剂是本领域已知的。抑制细胞生长是指与未暴露于所述组合物的细胞相比，细胞以更低的速率增殖、或具有降低了的生活力。通过本领域已知的方法，例如MTT细胞增殖分析来测量细胞生长。ZNFN3A1siRNA针对单个目标ZNFN3A1基因序列。做为选择，siRNA针对多个目标ZNFN3A1基因序列。例如，组合物包含针对两个、三个、四个或五个或更多个ZNFN3A1目标序列的ZNFN3A1-siRNA。ZNFN3A1目标序列意思指与ZNFN3A1基因的一部分相同的核苷酸序列。目标序列可以包括人类ZNFN3A1基因的5’非翻译(UT)区，开放阅读框(ORF)或3′非翻译区。做为选择，所述siRNA是与ZNFN3A1基因表达的上游或下游调节子互补的核酸序列。上游和下游调节子的实例包括，与ZNFN3A1基因启动子结合的转录因子、与ZNFN3A1多肽相互作用的激酶或磷酸酶、ZNFN3A1启动子或增强子。与目标mRNA杂交的ZNFN3A1-siRNA通过与通常是单链的mRNA转录产物联合来降低或抑制由ZNFN3A1基因编码的ZNFN3A1多肽产物的生产，从而干扰蛋白质的翻译，并因此干扰蛋白质的表达。siRNA长度小于500、200、100、50或25个核苷酸。优选的，siRNA长度是19-25个核苷酸。产生ZNFN3A1-siRNA的示范性的核酸序列包括SEQIDNO1的451-471(SEQIDNO58)、532-552(SEQIDNO60)、623-643(SEQIDNO61)、625-645(SEQIDNO62)、636-656(SEQIDNO63)、726-746(SEQIDN064)、923-943(SEQIDNO66)、1065-1085(SEQIDNO68)或1258-1278(SEQIDNO69)位核苷酸作为目标序列。此外，为了增强siRNA的抑制活性，可以向目标序列的反义链的3′端添加核苷酸“u”。添加的“u”的数目至少2个，一般地2到10个，优选的2到5个。添加的“u”在所述siRNA的反义链的3’端形成单链。细胞是表达或过量表达ZNFN3A1的任何细胞。所述细胞是肝细胞或上皮细胞例如结肠细胞。做为选择，所述细胞是肿瘤细胞例如癌、腺癌、胚细胞瘤、白血病、骨髓瘤或肉瘤。所述细胞是肝细胞癌或结直肠腺癌细胞。以能够与mRNA转录产物结合的形式直接将ZNFN3A1-siRNA导入到细胞中。做为选择，编码ZNFN3A1-siRNA的DNA处于载体中。例如，通过将可操作地连接了调控序列的ZNFN3A1目标序列克隆到表达载体中，其中调控序列以允许表达(通过转录DNA分子)两条链的方式位于所述ZNFN3A1序列的侧翼，来生产载体(Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)，ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.)。用第一启动子(例如，克隆DNA的3’的启动子序列)转录与ZNFN3A1mRNA反义的RNA分子，用第二启动子(例如，克隆DNA的5′的启动子序列)转录对于ZNFN3A1mRNA是有义链的RNA分子。有义链和反义链在体内杂交产生siRNA构建物，来使ZNFN3A1基因沉默。做为选择，利用两个构建物来产生siRNA构建物的有义链和反义链。克隆的ZNFN3A1可以编码具有二级结构，例如发夹结构的构建物，其中单个转录产物具有来自目标基因的有义和互补的反义序列。由任意核苷酸序列组成的环形序列可以位于有义序列和反义序列之间，以形成发夹环形结构。因而，本发明还提供具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]是一种核糖核苷酸序列，其相应于选自SEQIDNO1的451-471(SEQIDNO58)、532-552(SEQIDNO60)、623-643(SEQIDNO61)、625-645(SEQIDN062)、636-656(SEQIDNO63)、726-746(SEQIDNO64)、923-943(SEQIDNO66)、1065-1085(SEQIDNO68)或1258-1278(SEQIDNO69)位核苷酸的序列，[B]是由3到23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，和[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。区域[A]与[A’]杂交，然后形成由区域[B]组成的环。环状序列长度优选为3到23个核苷酸。例如，环形序列可以选自下列序列(http//www.ambion.com/techlib/tb/tb506.html)。此外，由23个核苷酸组成的环形序列也提供活性的siRNA(Jacque，J.-M.，Triques，K.，andStevenson，M.(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature418435-438.)。AUGSui，G.，Soohoo，C.，Affar，E.B.，Gay，F.，Shi，Y.，Forrester，W.C.，和Shi，Y.(2002)ADNAvector-basedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmammaliancells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(8)5515-5520.CCC，CCACC或CCACACCPaul，C.P.，Good，P.D.，Winer，I.，和Engelke，D.R.(2002)EffectiveexpressionofsmallinterferingRNAinhumancells.NatureBiotechnology20505-508.UUCGLee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，和Rossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.CTCGAG或AAGCUUEditorsofNatureCellBiology(2003)WhitherRNAi？NatCellBiol.5489-490.UUCAAGAGAYu，J.-Y.，DeRuiter，S.L.，和Turner，D.L.(2002)RNAinterferencebyexpressionofshort-interferingRNAsandhairpinRNAsinmammaliancells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(9)6047-6052.例如，本发明的具有发夹环结构的优选siRNA如下所示。在以下的结构中，环形序列可以选自AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC或UUCAAGAGA。优选的环形序列是UUCAAGAGA(DNA中为“ttcaagaga”)。aaucagagaagcuuuacucau-[B]-augaguaaagcuucucugauu(针对SEQIDNO58的目标序列)aacucguaaugacauuucaac-[B]-guugaaaugucauuacgaguu(针对SEQIDNO60的目标序列)aaaagugaucugcaacucuuu-[B]-aaagaguugcagaucacuuuu(针对SEQIDNO61的目标序列)aagugaucugcaacucuuuca-[B]-ugaaagaguugcagaucacuu(针对SEQIDNO62的目标序列)aacucuuucaccaucuguaau-[B]-auuacagauggugaaagaguu(针对SEQIDNO63的目标序列)aacuguucgauuguguucaau-[B]-auugaacacaaucgaacaguu(针对SEQIDNO64的目标序列)aacuggugaugagcaaguaug-[B]-cauacuugcucaucaccaguu(针对SEQIDNO66的目标序列)aacaucuaccagcugaaggug-[B]-caccuucagcugguagauguu(针对SEQIDNO68的目标序列)aagcaaugaagaaucugagac-[B]-gucucagauucuucauugcuu(针对SEQIDNO69的目标序列)在ZNFN3A1序列侧翼的调控序列是相同的或不同的，从而它们的表达可以被独立地调整、或以时间的或空间的方式调整。通过将ZNFN3A1基因模板克隆到载体中来细胞内地转录siRNA，所述载体包含，例如来自小核RNA(snRNA)U6或人类H1RNA启动子的RNApolIII转录单位。为了将载体导入到细胞中，可以使用转染增强剂。FuGENE(Rochediagnostices)、Lipofectamin2000(Invitrogen)、Oligofectamin(Invitrogen)和Nucleofactor(WakopureChemical)作为转染增强剂是有用的。根据标准方法在体外测试寡核苷酸和与ZNFN3A1mRNA的各个部分互补的寡核苷酸在肿瘤细胞中(例如，利用Alexander和HepG2肝细胞癌(HCC)细胞系，和HCT116和SW948结直肠癌细胞系))降低ZNFN3A1的产生的能力。与在没有候选组合物的情况下培养的细胞相比，在与候选siRNA组合物接触的细胞中ZNFN3A1基因产物的减少通过利用ZNFN3A1特异性抗体或其他检测策略来检测。然后对于在体外的基于细胞的或无细胞的分析中降低ZNFN3A1产生的那些序列检测它们对细胞生长的抑制效果。在大鼠或小鼠体内测试在体外基于细胞的分析中抑制细胞生长的序列，以确定在具有恶性肿瘤的动物中具有降低的ZNFN3A1产生和降低的肿瘤细胞生长。治疗恶性肿瘤的方法通过施用ZNFN3A1-siRNA来治疗具有以过量表达的ZNFN3A1为特征的肿瘤的病人。siRNA治疗被用于抑制病人的ZNFN3A1表达，所述病人患有例如肝细胞癌或直肠癌、或处于发生例如肝细胞癌或结直肠癌的危险之中。这种病人通过特定肿瘤类型的标准方法来鉴定。肝细胞癌可以通过，例如肝肿大、断层分析、超声波或活组织检查来诊断。结直肠癌可通过，例如便血、结肠镜检查、柔性乙状结肠镜检查、CEA分析、双差别钡剂灌肠CT扫描、断层分析或活组织检查来诊断。如果所述治疗引起了临床的益处，例如ZNFN3A1表达的减少、或个体体内的肿瘤在大小、普遍度、或转移可能性方面的降低，则治疗是有效的。当预防性地应用治疗时，“有效的”意思指所述治疗延迟或防止肿瘤形成，或防止或减轻肿瘤的临床症状。通过与任何用于诊断或治疗特定肿瘤类型的已知方法相联系来确定有效性。通过用标准载体和/或基因递送系统向病人施用siRNA来进行siRNA治疗。适合的基因递送系统除其它之外尤其可包括脂质体、受体介导的递送系统、或病毒载体，例如疱疹病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。ZNFN3A1产生的减少导致了ZNFN3A1与KIAA0054蛋白和RNA聚合酶II的复合物形成的减少，或ZNFN3A1蛋白表达的减少。治疗性核酸组合物被配制在药学上可接受的载运体中。治疗组合物也可包括如上所述的基因递送系统。药学上可接受的载运体是适合于向动物施用的生物学上兼容的媒介物，例如生理盐水。化合物的治疗有效量是能产生医学上期望的结果的数量，医学上期望的结果例如在受治疗的动物体内ZNFN3A1基因产物产量的降低、细胞生长例如增殖的降低、或肿瘤生长的降低。可以使用肠胃外施用，例如静脉内、皮下的、肌肉注射，和腹膜内的递送途径来递送ZNFN3A1-siRNA组合物。对于肝肿瘤的治疗，直接输入门静脉是有用的。对每个病人的剂量取决于许多因素，包括病人的身材、体表面积、年龄、需施用的特定核酸、性别、施用的时间和途径、健康状态，和其他同时施用的药物。核酸的静脉内施用的剂量约从106到1022份所述多核苷酸。通过标准方法施用多核苷酸，例如通过注射到组织，例如肌肉或皮肤的组织间隙中，导入到循环中或体腔中，或通过吸入或吹入。将多核苷酸与药学上可接受的液体载运体一同注射或递送给动物，药学上可接受的液体载运体例如，是水或部分是水的液体载运体。将多核苷酸与脂质体(例如，阳离子的或阴离子的脂质体)联合。多核苷酸包括被靶细胞表达所需的遗传信息，例如启动子。如果没有另外定义，此处使用的全部技术和科学术语具有本发明所属
技术领域：
的一个普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与在此描述的那些方法和材料相类似或等效的材料和方法可被用于实践或检验本发明，仍然在以下描述适合的方法和材料。在此提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过将它们完全引用而加入。如果发生冲突，以当前的说明书、包括当前的定义为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。图1是显示在COS7细胞中ZNFN3A1siRNA对外源性ZNFN3A1表达的影响的免疫印迹照片。图2是显示在肝癌和结肠癌细胞系中ZNFN3A1蛋白的表达的免疫印迹照片。图3是显示在用psiU6BX-ZNFN3A1-1、-4、-12或psiU6BX-模拟品质粒转染的SNU475细胞中，ZNFN3A1-siRNA对内源性ZNFN3A1表达的影响的免疫印迹照片。图4A-B是显示在SNU475细胞中ZNFN3A1-siRNA对细胞生长的影响的直方图。在转染6天(板块A)和9天(板块B)后用MTT分析来测量被转染的细胞的生活力。图5是显示在各种的人类肝癌和结肠癌细胞中ZNFN3A1-siRNA的生长抑制性影响的直方图。在转染9到12天后用MTT分析来测量被转染的细胞的生活力。图6是显示在用FACS分析检测的SNU475细胞中响应于ZNFN3A1-siRNA的细胞死亡的说明图。实施发明的最佳方式在以下实施例中将进一步描述本发明，实施例不作为对在权利要求中描述的发明范围的限制。一般方法细胞系和组织样本人类肝癌细胞系Alexander和HepG2、人类结肠癌系HCT116和SW948、和猴成纤维细胞系COS7从美国典型培养物保藏所(ATCC)获得。人类肝癌细胞系Huh7从日本研究生物资源保藏所(JCRB)获得。人类肝癌细胞系SNU398、SNU423、SNU449和SNU475从韩国细胞系库获得。所有这些细胞都是公众可获得的。所有细胞系在适当的培养基中单层生长对于Alexander、Huh7、HepG2和COS7是Dulbecco的修改的Eagle培养基；对于HCT116是McCoy的5A；对于SW948是Leibovitz的L-15；对于SNU398、SNU423、SNU449和SNU475是RPMI1640培养基，补充有10％胎儿牛血清和1％抗生素/抗真菌剂溶液(Sigma)。所有细胞都被维持在37℃、有5％CO2(Alexander、Huh7、HepG2、SNU398、SNU423、SNU449、SNU475、HCT116和COS7)或无CO2(SW948)的潮湿空气中。克隆ZNFN3A1通过PCR利用KOD-plus(TOYOBO)进行ZNFN3A1克隆。对于E.Coli表达，ZNFN3A1的编码区被克隆到pET21a的EcoRI-KpnI位点中。对于哺乳动物细胞表达，ZNFN3A1的编码区被克隆到pcDNA3.1(+)和(-)(Invitrogen)的EcoRI-KpnI位点、pFLAG的EcoRI-KpnI位点、和pEGFP(Clontech)的EcoRI-KpnI位点中。KIAA0054的编码区被克隆到pCMV-HA(Clontech)的EcoRI-XhoI位点中。ZNFN3A1多克隆抗体生产产生兔抗ZNFN3A1多克隆抗体。ZNFN3A1的全部编码序列通过PCR反应利用睾丸cDNA作为模板来扩增，并克隆到pET21a(Novagen)中。将克隆的载体转染到BL21-CodonPlus感受态细胞(Stratagene)中。通过1.0mMIPTG在30℃诱导重组ZNFN3A1蛋白6小时。利用ProBondTM树脂(invitrogen)纯化His-ZNFN3A1融合蛋白。用纯化的His-ZNFN3A1对兔进行十次免疫。用这个多克隆的抗体进行的免疫印迹显示了单一50kD的FLAG-标记的ZNFN3A1条带，其与利用抗FLAG单克隆抗体(Sigma)检测的ZNFN3A1是相同的模式(数据未显示)。RNA制备和RT-PCR用Trizol试剂(Lifetechnologies)根据厂家的方案提取总RNA。利用多聚dT12-18引物(AmershamBiosciences)用SuperscriptII逆转录酶(LifeTechnologies)将总RNA的十微克等分试样逆转录为单链cDNA。稀释每个单链cDNA用于随后的PCR扩增。在GeneAmpPCR系统9700(Perkin-Elmer)中，在20μl体积PCR缓冲液(TAKARA)中进行标准的RT-PCR，94℃变性4分钟，随后是94℃30秒、56℃30秒、72℃30秒进行20次(对于GAPDH)或30次(对于ZNFN3A1)循环以进行扩增。引物序列如下，对于GAPDH正向5’-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3’(SEQIDNO29)和反向；5’-GGTCCACCACTGACACGTTG-3’(SEQIDNO30)，对于ZNFN3A1正向；5’-TTCCCGATATCAACATCTACCAG-3’(SEQIDNo31)和反向；5’-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT-3’SEQIDNo32)。psiU6BX6质粒的构建将编码siRNA的DNA片段插入到以下质粒序列(SEQIDNO33)中用(-)表示的485-490位核苷酸缺口中。GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGGCTTGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGAGCCCGCGTCTGAACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGcGCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC------TTTTTACATCAGGTTGTTTTTCTGTTTGGTTTTTTTTTTACACCACGTTTATACGCCGGTGCACGGTTTACCACTGAAAACACCTTTCATCTACAGGTGATATCTTTTAACACAAATAAAATGTAGTAGTCCTAGGAGACGGAATAGAAGGAGGTGGGGCCTAAAGCCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGcATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGcGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGcCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGcTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC已报告snRNAU6基因通过RNA聚合酶III转录，产生在3’端具有尿嘧啶核苷的短的转录产物。通过PCR利用一组引物扩增包含启动子区的snRNAU6基因的基因组片段，5’-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’(SEQIDNo34)，和5’-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3’(SEQIDNo35)和人类胎盘DNA作为模板。利用TA克隆试剂盒根据供应商的方案(Invitrogen)纯化产物，并克隆到pCR质粒载体中。纯化包含snRNAU6基因的BamHI、XhoI片段，克隆到DNA3.1(+)质粒的核苷酸1257到56片段，其是通过PCR利用一组引物5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQIDNo36)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQIDNo37)扩增的。连接的DNA被用作PCR的模板，PCR的引物是5’-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3’(SEQIDNo38)和5’-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQIDNo39)。用HindIII消化产物，消化后的产物随后自我连接产生psiU6BX载体质粒。作为对照，将5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO40)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO41)的双链寡核苷酸克隆到psiU6BX载体的BbsI位点来制备psiU6BX-EGFP。免疫印迹先前已经从用重组His-标记的ZNFN3A1蛋白免疫的兔子的血清中纯化了针对ZNFN3A1的多克隆抗体。用10％SDS-PAGE分离蛋白，用抗-ZNFN3A1抗体进行免疫印迹。HRP结合的山羊抗兔IgG(SantaCruzBiotechology，SantaCruz，CA)充当ECL检测系统(AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)的第二抗体。用抗ZNFN3A1抗体的免疫印迹显示了单个50kD的FLAG-标记的ZNFN3A1条带，其与用抗-FLAG抗体检测的ZNFN3A1是相同的模式。3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)分析用psiU6BX-siZNFN3A1或对照质粒转染细胞，并维持在添加了最佳浓度的遗传霉素(geneticin)的培养基中。转染后六到十二天，用包含500μg/ml的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)(Sigma)的新鲜培养基替换培养基，将平板在37℃下孵化四小时。随后，通过添加1ml0.01NHCl/10％SDS溶解细胞，用ELISA平板读数器在570nm的测试波长(参考，630nm)测量胞溶产物的吸光率。通过与对照细胞的吸光率对比表示细胞的生活力。流式细胞计数在细胞周期进展中ZNFN3A1的影响通过流式细胞计数来测定。以1×105细胞/100mm平皿的密度将细胞铺板。以给定的时间过程将细胞胰蛋白酶化，收集在PBS中，在70％冰冷乙醇中固定。在RNase处理之后，在PBS中用碘化丙锭(50μg/ml)着色。在BectonDickinsonFACScan上进行流式细胞计数，通过CellQuest和ModFit软件(VeritySoftwareHouse)进行分析。从至少20,000个未门化的(ungated)细胞中确定处于细胞周期的G0/G1、S和G2/M期细胞核的百分率，以及任何亚G1群体的百分率。为了检查细胞周期中ZNFN3A1-siRNA的作用，通过胰蛋白酶化作用在转染之后5天收集用psiU6BX-ZNFN3A1或对照质粒转染的1×105个SNU475细胞。在70％的冷乙醇中固定之后，在PBS中用RNase和碘化丙锭(50μg/ml)处理细胞，通过FACScan(BectonDickinson，SanJose，CA)分析。利用ModFit软件(VeritySoftwareHouse)从至少20,000个未门化细胞中确定处于细胞周期的G0/G1、S和G2/M期的细胞的百分率，以及任何亚G1群体的百分率。表达ZNFN3A1siRNA的质粒的生产和表征用一组引物，5′-GGGGTACCAGGATGGAGCCGCTGAAGGTGG-3’(SEQIDNo42)和5’-GGGAATTCTTAGGATGCTCTGATGTTGGCGTCG-3’(SEQIDNo43)扩增ZNFN3A1的完整编码序列，并克隆到pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen)的适当克隆位点中(pcDNA-ZNFN3A1)。通过将双链寡核苷酸克隆到psiU6BX载体中制备表达ZNFN3A1-siRNA的质粒。利用可以获得自Ambion网站(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)的设计siRNA的计算机程序来设计siRNA的核苷酸序列。简要地，利用以下方案选择用于siRNA合成的核苷酸序列siRNA目标位点的选择1.从ZNFN3A1转录产物的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA二核苷酸序列。记录每个AA的发生和3’相邻的19个核苷酸，以作为潜在的siRNA目标位点。Tuschal等建议不针对5’和3’非翻译区(UTR)和接近起始密码子的区域(75碱基之内)设计siRNA，因为这些可能较富含调节蛋白结合位点。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。2.将所述潜在的目标位点与适当的基因组数据库(人类、小鼠、大鼠等)进行比较，以排除与其他编码序列具有显著同源性的目标序列。3.选择合格的目标序列用于合成。沿所述基因的长度方向选择几个目标序列用于评估。用作ZNFN3A1siRNA的寡核苷酸如下所示。通过将以下双链寡核苷酸克隆到psiU6载体的BbsI位点来制备psiU6BX-ZNFN3A11-13(siRNA1-13)。对于每个寡核苷酸序列，列出了相应于SEQIDNO1的ZNFN3A1核酸序列的相应核苷酸位置。每个寡核苷酸是目标序列ZNFN3A1的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列的组合。发夹环结构的核苷酸序列和siRNA1到13的目标序列分别在SEQIDNO44到SEQIDNO56，和SEQIDNO57到SEQIDNO69中显示(从每个发夹环结构序列中删除了核酸内切酶识别位点)。psiU6BX-ZNFN3A1-1/siRNA1(SEQIDNo1的核苷酸数目426-446)5’-CACCAAACTTATGGATGGAGCACCTTTCAAGAGAAGGTGCTCCATCCATAAGTTT-3’(SEQIDNO3)和5’-AAAAAAACTTATGGATGGAGCACCTTCTCTTGAAAGGTGCTCCATCCATAAGTTT-3’(SEQIDNO4)psiU6BX-ZNFN3A1-2/siRNA2(SEQIDNo1的核苷酸数目451-471)5’-CACCAATCAGAGAAGCTTTACTCATTTCAAGAGAATGAGTAAAGCTTCTCTGATT-3’(SEQIDNO5)和5’-AAAAAATCAGAGAAGCTTTACTCATTCTCTTGAAATGAGTAAAGCTTCTCTGATT-3’(SEQIDNO6)psiU6BX-ZNFN3A1-3/siRNA3(SEQIDNo1的核苷酸数目495-515)siRNA2；5’-CACCAACAAACTGACTGAAGATAAGTTCAAGAGACTTATCTTCAGTCAGTTTGTT-3’(SEQIDNO7)和5’-AAAAAACAAACTGACTGAAGATAAGTCTCTTGAACTTATCTTCAGTCAGTTTGTT-3’(SEQIDNO8)psiU6BX-ZNFN3A1-4/siRNA4(SEQIDNo1的核苷酸数目532-552)5’-CACCAACTCGTAATGACATTTCAACTTCAAGAGAGTTGAAATGTCATTACGAGTT-3’(SEQIDNO9)和5’-AAAAAACTCGTAATGACATTTCAACTCTCTTGAAGTTGAAATGTCATTACGAGTT-3’(SEQIDNO10)psiU6BX-ZNFN3A1-5/siRNA5(SEQIDNo1的核苷酸数目623-643)5’-CACCAAAAGTGATCTGCAACTCTTTTTCAAGAGAAAAGAGTTGCAGATCACTTTT-3’(SEQIDNO11)和5’-AAAAAAAAGTGATCTGCAACTCTTTTCTCTTGAAAAAGAGTTGCAGATCACTTTT-3’(SEQIDNO12)psiU6BX-ZNFN3A1-6/siRNA6(SEQIDNo1的核苷酸数目625-645)5’-CACCAAGTGATCTGCAACTCTTTCATTCAAGAGATGAAAGAGTTGCAGATCACTT-3’(SEQIDNO13)和5’-AAAAAAGTGATCTGCAACTCTTTCATCTCTTGAATGAAAGAGTTGCAGATCACTT-3’(SEQIDNO14)psiU6BX-ZNFN3A1-7/siRNA7(SEQIDNo1的核苷酸数目636-656)5’-CACCAACTCTTTCACCATCTGTAATTTCAAGAGAATTACAGATGGTGAAAGAGTT-3’(SEQIDNO15)和5’-AAAAAACTCTTTCACCATCTGTAATTCTCTTGAAATTACAGATGGTGAAAGAGTT-3’(SEQIDNO16)psiU6BX-ZNFN3A1-8/siRNA8(SEQIDNo1的核苷酸数目726-746)5’-CACCAACTGTTCGATTGTGTTCAATTTCAAGAGAATTGAACACAATCGAACAGTT-3’(SEQIDNO17)和5’-AAAAAACTGTTCGATTGTGTTCAATTCTCTTGAAATTGAACACAATCGAACAGTT-3’(SEQIDNO18)psiU6BX-ZNFN3A1-9/siRNA9(SEQIDNo1的核苷酸数目906-926)5’-CACCAAGGATGCTGATATGCTAACTTTCAAGAGAAGTTAGCATATCAGCATCCTT-3’(SEQIDNO19)和5’-AAAAAAGGATGCTGATATGCTAACTTCTCTTGAAAGTTAGCAIATCAGCATCCTT-3’(SEQIDNO20)psiU6BX-ZNFN3A1-10/siRNA10(SEQIDNo1的核苷酸数目923-943)5’-CACCAACTGGTGATGAGCAAGTATGTTCAAGAGACATACTTGCTCATCACCAGTT-3’(SEQIDNO21)和5’-AAAAAACTGGTGATGAGCAAGTATGTCTCTTGAACATACTTGCTCATCACCAGTT-3’(SEQIDNO22)psiU6BX-ZNFN3A1-11/siRNA11(SEQIDNo1的核苷酸数目937-957)5’-CACCAAGTATGGAAGGAAGTTCAAGTTCAAGAGACTTGAACTTCCTTCCATACTT-3’(SEQIDNO23)和5’-AAAAAAGTATGGAAGGAAGTTCAAGTCTCTTGAACTTGAACTTCCTTCCATACTT-3’(SEQIDNO24)psiU6BX-ZNFN3A1-12/siRNA12(SEQIDNo1的核苷酸数目1065-1085)5’-CACCAACATCTACCAGCTGAAGGTGTTCAAGAGACACCTTCAGCTGGTAGATGTT-3’(SEQIDNO25)和5’-AAAAAACATCTACCAGCTGAAGGTGTCTCTTGAACACCTTCAGCTGGTAGATGTT-3’(SEQIDNO26)psiU6BX-ZNFN3A1-13/siRNA13(SEQIDNo1的核苷酸数目1258-1278)5’-CACCAAGCAATGAAGAATCTGAGACTTCAAGAGAGTCTCAGATTCTTCATTGCTT-3’(SEQIDNO27)和5’-AAAAAAGCAATGAAGAATCTGAGACTCTCTTGAAGTCTCAGATTCTTCATTGCTT-3’(SEQIDNO28)根据供应商的建议(Roche)利用FuGENE6试剂将pcDNA-ZNFN3A1与psiU6BX-siZNFN3A1或psiU6BX-模拟品质粒共转染入COS7细胞。将质粒单独地转染入表达丰富数量的内源性ZNFN3A1的SNU479细胞。转染2天后溶解细胞的全提取物，用于免疫印迹分析。在表达ZNFN3A1siRNA的13种不同表达质粒之中，当与pcDNA-ZNFN3A1一同被转染入COS7细胞中时，通过western免疫分析，psiU6BX-ZNFN3A1-8、-12和-13最显著地降低外源性ZNFN3A1的表达。在其它质粒之中，psiU6BX-ZNFN3A1-4显示了显著的降低，psiU6BX-ZNFN3A1-2、-5、-6、-7和-10发挥了中度抑制作用，而psiU6BX-ZNFN3A1-1、-3、-9和-11对表达没有影响或影响很小(图1)。为了进一步检查ZNFN3A1siRNA的RNAi活性，我们将psiU6BX-ZNFN3A1-1、-4、-12或psiU6BX-模拟品转染入表达丰富数量的ZNFN3A1的SNU475细胞(图2)。利用被转染细胞的提取物进行的Western印迹分析表明，与用psiU6BX-模拟品转染的细胞相比，利用psiU6BX-ZNFN3A1-12有显著的内源性ZNFN3A1的降低，利用psiU6BX-ZNFN3A1-4有中度的抑制作用。另一方面，用psiU6BX-ZNFN3A1-1转染没有影响ZNFN3A1的表达(图3)。ZNFN3A1siRNA对肝癌和结直肠癌细胞的生长抑制为了测试抑制ZNFN3A1是否导致对肝癌细胞的生长抑制，用表现出对表达的最佳敲除效果的载体psiU6BX-ZNFN3A1-12、表现出温和的沉默效果的psiU6BX-ZNFN3A1-4、不表现出沉默效果的psiU6BX-ZNFN3A1-1、或psiU6BX-模拟品转染SNU475细胞。在转染的第6天和第9天MTT分析都显示，与用psiU6BX-模拟品转染的细胞相比，psiU6BX-ZNFN3A1-12具有最高的生长抑制效果，psiU6BX-ZNFN3A1-1不改变存活细胞的数目。质粒的生长抑制效果与它们的基因沉默活性相关。为了进一步表明ZNFN3A1-siRNA，psiU6BX-ZNFN3A1-12的生长抑制效果，psiU6BX-EGFP作为对照，通过将以下双链寡核苷酸5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNo40)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNo41)克隆到psiU6BX载体的BbsI位点中来制备psiU6BX-EGFP。或将psiU6BX-模拟品转染到各种肝癌细胞系包括SNU398、SNU423、SNU449、Huh7、Alexander、和HepG2，以及两个结肠癌细胞系SW948和HCT116中。与psiU6BX-EGFP或PsiU6BX-模拟品的转染相比，psiU6BX-ZNFN3A1-12的转染显著地降低了存活细胞的数目(图5)。此外，FACS分析表明psiU6BX-ZNFN3A1-12的转染增加了亚G1期的细胞的数目(图6)。这些结果表明ZNFN3A1有助于很广范围内人类癌细胞的异常细胞生长和/或生存。工业实用性本发明已经显示了特异性靶向ZNFN3A1基因的小干扰RNA(siRNA)抑制细胞生长。因而，这一新的siRNA是开发抗癌药物的有用靶点。例如，可能发现阻断ZNFN3A1的表达或阻止其活性的药剂作为抗癌药剂的治疗性用途，特别是用于治疗肝癌或结肠癌，例如HCC或结直肠腺癌的抗癌药剂。已经参考本发明的特定实施方式详细地描述了本发明，对于本领域技术人员显而易见的是可以在此进行各种变化和修改而不背离本发明的精神和范围。参考文献(1)AkriviadisEA，LlovetJM，EfremidisSC，ShouvalD，CaneloR，RingeB，MeyersWC.Hepatocellularcarcinoma.BrJSurg.1998Oct；85(10)1319-31.(2)OkabeH，SatohS，KatoT，KitaharaO，YanagawaR，YamaokaY，TsunodaT，FurukawaY，NakamuraY.Genome-wideanalysisofgeneexpressioninhumanhepatocellularcarcinomasusingcDNAmicroarrayidentificationofgenesinvolvedinviralcarcinogenesisandtumorprogression.CancerRes.2001Marl；61(5)2129-37.(3)SharpPA.RNAianddouble-strandRNA.GenesDev.1999Jan15；13(2)139-41..(4)HammondSM，BernsteinE，BeachD，HannonGJ.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells.Nature.2000Mar16；404(6775)293-6.(5)HannonGJ.RNAinterference.Nature.2002Jul11；418(6894)244-51.(6)ElbashirSM，HarborthJ，LendeckelW，YalcinA，WeberK，TuschlT.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature.2001May24；411(6836)494-8.(7)MiyagishiM，TairaK.U6promoter-drivensiRNAwithfoururidine3′overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatBiotechnol.2002May；20(5)497-500(8)BrummelkampTR，BernardsR，AgamiR.ASystemforStableExpressionofShortInterferingRNAsinMammalianCellsScience.296(5567)550-553，April19，2002.序列表<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPYSCIENCE，INC.JAPANASREPRESENTEDBYTHEPRESIDENTOFTHEUNIVERSITYOFTOKYO)<120>抑制细胞生长的组合物和方法<130>ONC-A0301P<150>US60/450,644<151>2003-02-28<160>69<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1622<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(96)..(1382)<223><400>1gtgcgcgcagggcgcaggcgcgcgggtcccggcagcccgtgagacgcccgctgctggacg60cgggtagccgtctgaggtgccggagctgcgggaggatggagccgctgaaggtg113MetGluProLeuLysVal15gaaaagttcgcaaccgccaacaggggaaacgggctgcgcgccgtgacc161GluLysPheAlaThrAlaAsnArgGlyAsnGlyLeuArgAlaValThr101520ccgctgcgccccggagagctactcttccgctcggatcccttggcgtac209ProLeuArgProGlyGluLeuLeuPheArgSerAspProLeuAlaTyr253035acggtgtgcaaggggagtcgtggcgtcgtctgcgaccgctgccttctc257ThrValCysLysGlySerArgGlyValValCysAspArgCysLeuLeu404550gggaaggaaaagctgatgcgatgctctcagtgccgcgtcgccaaatac305GlyLysGluLysLeuMetArgCysSerGlnCysArgValAlaLysTyr55606570tgtagtgctaagtgtcagaaaaaagcttggccagaccacaagcgggaa353CysSerAlaLysCysGlnLysLysAlaTrpProAspHisLysArgGlu758085tgcaaatgccttaaaagctgcaaacccagatatcctccagactccgtt401CysLysCysLeuLysSerCysLysProArgTyrProProAspSerVal9095100cgacttcttggcagagttgtcttcaaacttatggatggagcaccttca449ArgLeuLeuGlyArgValValPheLysLeuMetAspGlyAlaProSer105110115gaatcagagaagctttactcattttatgatctggagtcaaatattaac497GluSerGluLysLeuTyrSerPheTyrAspLeuGluSerAsnIleAsn120125130aaactgactgaagataagaaagagggcctcaggcaactcgtaatgaca545LysLeuThrGluAspLysLysGluGlyLeuArgGlnLeuValMetThr135140145150tttcaacatttcatgagagaagaaatacaggatgcctctcagctgcca593PheGlnHisPheMetArgGluGluIleGlnAspAlaSerGlnLeuPro155160165cctgcctttgacctttttgaagcctttgcaaaagtgatctgcaactct641ProAlaPheAspLeuPheGluAlaPheAlaLysValIleCysAsnSer170175180ttcaccatctgtaatgcggagatgcaggaagttggtgttggcctatat689PheThrIleCysAsnAlaGluMetGlnGluValGlyValGlyLeuTyr185190195cccagtatctctttgctcaatcacagctgtgaccccaactgttcgatt737ProSerIleSerLeuLeuAsnHisSerCysAspProAsnCysSerIle200205210gtgttcaatgggccccacctcttactgcgagcagtccgagacatcgag785ValPheAsnGlyProHisLeuLeuLeuArgAlaValArgAspIleGlu215220225230gtgggagaggagctcaccatctgctacctggatatgctgatgaccagt833ValGlyGluGluLeuThrIleCysTyrLeuAspMetLeuMetThrSer235240245gaggagcgccggaagcagctgagggaccagtactgctttgaatgtgac881GluGluArgArgLysGlnLeuArgAspGlnTyrCysPheGluCysAsp250255260tgtttccgttgccaaacccaggacaaggatgctgatatgctaactggt929CysPheArgCysGlnThrGlnAspLysAspAlaAspMetLeuThrGly265270275gatgagcaagtatggaaggaagttcaagaatccctgaaaaaaattgaa977AspGluGlnValTrpLysGluValGlnGluSerLeuLysLysIleGlu280285290gaactgaaggcacactggaagtgggagcaggttctggccatgtgccag1025GluLeuLysAlaHisTrpLysTrpGluGlnValLeuAlaMetCysGln295300305310gcgatcataagcagcaattctgaacggcttcccgatatcaacatctac1073AlaIleIleSerSerAsnSerGluArgLeuProAspIleAsnIleTyr315320325cagctgaaggtgctcgactgcgccatggatgcctgcatcaacctcggc1121GlnLeuLysValLeuAspCysAlaMetAspAlaCysIleAsnLeuGly330335340ctgttggaggaagccttgttctatggtactcggaccatggagccatac1169LeuLeuGluGluAlaLeuPheTyrGlyThrArgThrMetGluProTyr345350355aggatttttttcccaggaagccatcccgtcagaggggttcaagtgatg1217ArgIlePhePheProGlySerHisProValArgGlyValGlnValMet360365370aaagttggcaaactgcagctacatcaaggcatgtttccccaagcaatg1265LysValGlyLysLeuGlnLeuHisGlnGlyMetPheProGlnAlaMet375380385390aagaatctgagactggcttttgatattatgagagtgacacatggcaga1313LysAsnLeuArgLeuAlaPheAspIleMetArgValThrHisGlyArg395400405gaacacagcctgattgaagatttgattctacttttagaagaatgcgac1361GluHisSerLeuIleGluAspLeuIleLeuLeuLeuGluGluCysAsp410415420gccaacatcagagcatcctaagggaacgcagtcagagggaaatacggcgtg1412AlaAsnIleArgAlaSer425tgtctttgttgaatgccttattgaggtcacacactctatgctttgttagctgtgtgaacc1472tctcttattggaaattctgttccgtgtttgtgtaggtaaataaaggcagacatggtttgc1532aaaccacaagaatcattagttgtagagaagcacgattataataaattcaaaacatttggt1592tgaggatgccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1622<210>2<211>428<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>2MetGluProLeuLysValGluLysPheAlaThrAlaAsnArgGlyAsn151015GlyLeuArgAlaValThrProLeuArgProGlyGluLeuLeuPheArg202530SerAspProLeuAlaTyrThrValCysLysGlySerArgGlyValVal354045CysAspArgCysLeuLeuGlyLysGluLysLeuMetArgCysSerGln505560CysArgValAlaLysTyrCysSerAlaLysCysGlnLysLysAlaTrp65707580ProAspHisLysArgGluCysLysCysLeuLysSerCysLysProArg859095TyrProProAspSerValArgLeuLeuGlyArgValValPheLysLeu100105110MetAspGlyAlaProSerGluSerGluLysLeuTyrSerPheTyrAsp115120125LeuGluSerAsnIleAsnLysLeuThrGluAspLysLysGluGlyLeu130135140ArgGlnLeuValMetThrPheGlnHisPheMetArgGluGluIleGln145150155160AspAlaSerGlnLeuProProAlaPheAspLeuPheGluAlaPheAla165170175LysValIleCysAsnSerPheThrIleCysAsnAlaGluMetGlnGlu180185190ValGlyValGlyLeuTyrProSerIleSerLeuLeuAsnHisSerCys195200205AspProAsnCysSerIleValPheAsnGlyProHisLeuLeuLeuArg210215220AlaValArgAspIleGluValGlyGluGluLeuThrIleCysTyrLeu225230235240AspMetLeuMetThrSerGluGluArgArgLysGlnLeuArgAspGln245250255TyrCysPheGluCysAspCysPheArgCysGlnThrGlnAspLysAsp260265270AlaAspMetLeuThrGlyAspGluGlnValTrpLysGluValGlnGlu275280285SerLeuLysLysIleGluGluLeuLysAlaHisTrpLysTrpGluGln290295300ValLeuAlaMetCysGlnAlaIleIleSerSerAsnSerGluArgLeu305310315320ProAspIleAsnIleTyrGlnLeuLysValLeuAspCysAlaMetAsp325330335AlaCysIleAsnLeuGlyLeuLeuGluGluAlaLeuPheTyrGlyThr340345350ArgThrMetGluProTyrArgIlePhePheProGlySerHisProVal355360365ArgGlyValGlnValMetLysValGlyLysLeuGlnLeuHisGlnGly370375380MetPheProGlnAlaMetLysAsnLeuArgLeuAlaPheAspIleMet385390395400ArgValThrHisGlyArgGluHisSerLeuIleGluAspLeuIleLeu405410415LeuLeuGluGluCysAspAlaAsnIleArgAlaSer420425<210>3<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>3caccaaacttatggatggagcacctttcaagagaaggtgctccatccataagttt55<210>4<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>4aaaaaaacttatggatggagcaccttctcttgaaaggtgctccatccataagttt55<210>5<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>5caccaatcagagaagctttactcatttcaagagaatgagtaaagcttctctgatt55<210>6<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>6aaaaaatcagagaagctttactcattctcttgaaatgagtaaagcttctctgatt55<210>7<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>7caccaacaaactgactgaagataagttcaagagacttatcttcagtcagtttgtt55<210>8<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>8aaaaaacaaactgactgaagataagtctcttgaacttatcttcagtcagtttgtt55<210>9<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>9caccaactcgtaatgacatttcaacttcaagagagttgaaatgtcattacgagtt55<210>10<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>10aaaaaactcgtaatgacatttcaactctcttgaagttgaaatgtcattacgagtt55<210>11<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>11caccaaaagtgatctgcaactctttttcaagagaaaagagttgcagatcactttt55<210>12<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>12aaaaaaaagtgatctgcaactcttttctcttgaaaaagagttgcagatcactttt55<210>13<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>13caccaagtgatctgcaactctttcattcaagagatgaaagagttgcagatcactt55<210>14<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>14aaaaaagtgatctgcaactctttcatctcttgaatgaaagagttgcagatcactt55<210>15<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>15caccaactctttcaccatctgtaatttcaagagaattacagatggtgaaagagtt55<210>16<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>16aaaaaactctttcaccatctgtaattctcttgaaattacagatggtgaaagagtt55<210>17<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>17caccaactgttcgattgtgttcaatttcaagagaattgaacacaatcgaacagtt55<210>18<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>18aaaaaactgttcgattgtgttcaattctcttgaaattgaacacaatcgaacagtt55<210>19<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>19caccaaggatgctgatatgctaactttcaagagaagttagcatatcagcatcctt55<210>20<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>20aaaaaaggatgctgatatgctaacttctcttgaaagttagcatatcagcatcctt55<210>21<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>21caccaactggtgatgagcaagtatgttcaagagacatacttgctcatcaccagtt55<210>22<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>22aaaaaactggtgatgagcaagtatgtctcttgaacatacttgctcatcaccagtt55<210>23<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>23caccaagtatggaaggaagttcaagttcaagagacttgaacttccttccatactt55<210>24<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>24aaaaaagtatggaaggaagttcaagtctcttgaacttgaacttccttccatactt55<210>25<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>25caccaacatctaccagctgaaggtgttcaagagacaccttcagctggtagatgtt55<210>26<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>26aaaaaacatctaccagctgaaggtgtctcttgaacaccttcagctggtagatgtt55<210>27<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>27caccaagcaatgaagaatctgagacttcaagagagtctcagattcttcattgctt55<210>28<211>55<212>DNA<213>人工的<220><223>SiRNA的人工合成的寡核苷酸序列<400>28aaaaaagcaatgaagaatctgagactctcttgaagtctcagattcttcattgctt55<210>29<211>22<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>29acaacagcctcaagatcatcag22<210>30<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>30ggtccaccactgacacgttg20<210>31<211>23<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>31ttcccgatatcaacatctaccag23<210>32<211>23<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>32agtgtgtgacctcaataaggcat23<210>33<211>4869<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的质粒序列<220><221>misc_feature<222>(485)..(490)<223>″n″表示GAP.<400>33gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctggat60ccactagtaacggccgccagtgtgctggaattcggcttggggatcagcgtttgagtaaga120gcccgcgtctgaaccctccgcgccgccccggccccagtggaaagacgcgcaggcaaaacg180caccacgtgacggagcgtgaccgcgcgccgagcgcgcgccaaggtcgggcaggaagaggg240cctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataat300tagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagta360ataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgct420taccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaa480caccnnnnnntttttacatcaggttgtttttctgtttggttttttttttacaccacgttt540atacgccggtgcacggtttaccactgaaaacacctttcatctacaggtgatatcttttaa600cacaaataaaatgtagtagtcctaggagacggaatagaaggaggtggggcctaaagccga660attctgcagatatccatcacactggcggccgctcgagtgaggcggaaagaaccagctggg720gctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtgg780ttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttct840tcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctcc900ctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtg960atggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagt1020ccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgg1080tctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagc1140tgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtgg1200aaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagc1260aaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatct1320caattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcc1380cagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccga1440ggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagg1500cttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacagg1560atgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttg1620ggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgc1680cgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg1740tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgt1800tccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattggg1860cgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccat1920catggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgacca1980ccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatca2040ggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaa2100ggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaa2160tatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggc2220ggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcga2280atgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgc2340cttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgac2400caagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaagg2460ttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctc2520atgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataa2580agcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggt2640ttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagc2700ttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattcca2760cacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaa2820ctcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccag2880ctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttcc2940gcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagct3000cactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatg3060tgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttc3120cataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcga3180aacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctct3240cctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtg3300gcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaag3360ctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactat3420cgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaac3480aggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaac3540tacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttc3600ggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggttttttt3660gtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttt3720tctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaga3780ttatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatc3840taaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacct3900atctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagata3960actacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagaccca4020cgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcaga4080agtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctaga4140gtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtg4200gtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcga4260gttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgtt4320gtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattct4380cttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtca4440ttctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataat4500accgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcga4560aaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcaccc4620aactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaagg4680caaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttc4740ctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatattt4800gaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgcca4860cctgacgtc4869<210>34<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>34ggggatcagcgtttgagtaa20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>35taggccccacctccttctat20<210>36<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>36tgcggatccagagcagattgtactgagagt30<210>37<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>37ctctatctcgagtgaggcggaaagaacca29<210>38<211>40<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>38tttaagcttgaagactatttttacatcaggttgtttttct40<210>39<211>37<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>39tttaagcttgaagacacggtgtttcgtcctttccaca37<210>40<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的双链寡核苷酸序列<400>40caccgaagcagcacgacttcttcttcaagagagaagaagtcgtgctgcttc51<210>41<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的双链寡核苷酸序列<400>41aaaagaagcagcacgacttcttctctcttgaagaagaagtcgtgctgcttc51<210>42<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>42ggggtaccaggatggagccgctgaaggtgg30<210>43<211>33<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>43gggaattcttaggatgctctgatgttggcgtcg33<210>44<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>44aaacttatggatggagcacctttcaagagaaggtgctccatccataagttt51<210>45<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>45aatcagagaagctttactcatttcaagagaatgagtaaagcttctctgatt51<210>46<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>46aacaaactgactgaagataagttcaagagacttatcttcagtcagtttgtt51<210>47<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>47aactcgtaatgacatttcaacttcaagagagttgaaatgtcattacgagtt51<210>48<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>48aaaagtgatctgcaactctttttcaagagaaaagagttgcagatcactttt51<210>49<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>49aagtgatctgcaactctttcattcaagagatgaaagagttgcagatcactt51<210>50<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>50aactctttcaccatctgtaatttcaagagaattacagatggtgaaagagtt51<210>51<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>51aactgttcgattgtgttcaatttcaagagaattgaacacaatcgaacagtt51<210>52<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>52aaggatgctgatatgctaactttcaagagaagttagcatatcagcatcctt51<210>53<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>53aactggtgatgagcaagtatgttcaagagacatacttgctcatcaccagtt51<210>54<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>54aagtatggaaggaagttcaagttcaagagacttgaacttccttccatactt51<210>55<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>55aacatctaccagctgaaggtgttcaagagacaccttcagctggtagatgtt51<210>56<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的发夹siRNA序列<400>56aagcaatgaagaatctgagacttcaagagagtctcagattcttcattgctt51<210>57<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>57aaacttatggatggagcacct21<210>58<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>58aatcagagaagctttactcat21<210>59<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>59aacaaactgactgaagataag21<210>60<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>60aactcgtaatgacatttcaac21<210>61<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>61aaaagtgatctgcaactcttt21<210>62<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>62aagtgatctgcaactctttca21<210>63<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>63aactctttcaccatctgtaat21<210>64<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>64aactgttcgattgtgttcaat21<210>65<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>65aaggatgctgatatgctaact21<210>66<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>66aactggtgatgagcaagtatg21<210>67<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>67aagtatggaaggaagttcaag21<210>68<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>68aacatctaccagctgaaggtg21<210>69<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成的靶序列<400>69aagcaatgaagaatctgagac2权利要求1.抑制个体肿瘤细胞生长的方法，包括向所述个体施用包含ZNFN3A1小干扰RNA(siRNA)的组合物。2.权利要求1所述的方法，其中所述siRNA包含有义ZNFN3A1核酸和反义ZNFN3A1核酸。3.权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤细胞是结直肠癌细胞或肝癌细胞。4.权利要求3所述的方法，其中所述结直肠癌细胞是腺癌细胞。5.权利要求3所述的方法，其中所述肝癌细胞是肝细胞癌细胞。6.权利要求2所述的方法，所述siRNA是特异于ZNFN3A1靶点的，所述ZNFN3A1靶点选自SEQIDNO1的核苷酸451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、1065-1085或1258-1278。7.权利要求6所述的方法，所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是相应于选自SEQIDNO1的核苷酸451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、1065-1085或1258-1278的序列的核糖核苷酸序列，[B]是由3到23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，和[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。8.权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含转染增强剂。9.一种分离的多核苷酸，包含有义链核酸和反义链核酸的组合，其中分别地，所述有义链核酸包含选自SEQIDNO1的核苷酸451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、1065-1085或1258-1278的核苷酸序列，所述反义链核酸由其互补序列组成。10.权利要求9所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸和反义链核酸在同一条链上。11.权利要求9所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸由短于约100个核苷酸的核苷酸序列组成。12.权利要求11所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸短于约75个核苷酸。13.权利要求12所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸短于约50个核苷酸。14.权利要求13所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸短于约25个核苷酸。15.权利要求14所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸长度在约19到约25个核苷酸之间。16.包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含有义链核酸和反义链核酸的组合，其中分别地，所述有义链核酸包含选自SEQIDNO1的核苷酸451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、1065-1085或1258一1278的核苷酸序列，所述反义链核酸由其互补序列组成。17.权利要求16所述的载体，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是选自SEQIDNO1的核苷酸451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、1065-1085或1258-1278的核苷酸序列，[B]是由3到23个核苷酸组成的核苷酸序列，和[A’]是由[A]的互补序列组成的核苷酸序列。18.包含至少一个siRNA的组合物，所述siRNA包含有义链核酸和反义链核酸的组合，其中分别地，所述有义链核酸包含相应于选自SEQIDNO1的核苷酸451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、1065-1085或1258-1278的序列的核糖核苷酸序列，所述反义链序列由其互补序列组成。19.包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含相应于ZNFN3A1目标序列的核糖核苷酸序列，和其中反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成所述双链分子，和其中当被导入到表达ZNFN3A1基因的细胞中时，所述双链分子抑制所述基因的表达。20.权利要求19所述的双链分子，其中所述ZNFN3A1目标序列包含来自SEQIDNO1的至少约10个连续的核苷酸。21.权利要求20所述的双链分子，其中所述ZNFN3A1目标序列包含来自SEQIDNO1的约19个到约25个连续的核苷酸。22.权利要求21所述的双链分子，其中所述ZNFN3A1目标序列选自SEQIDNO1的核苷酸451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、1065-1085或1258-1278。23.权利要求19所述的双链分子，其中单个核糖核苷酸转录产物包含所述有义链和所述反义链，所述双链分子进一步包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。24.权利要求19所述的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约100个核苷酸的寡核苷酸。25.权利要求24所述的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约75个核苷酸的寡核苷酸。26.权利要求25所述的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约50个核苷酸的寡核苷酸。27.权利要求26所述的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约25个核苷酸的寡核苷酸。28.权利要求27所述的双链多核苷酸，其中所述双链分子是长度在约19个和约25个核苷酸之间的寡核苷酸。29.编码权利要求19所述的双链分子的载体。30.权利要求29所述的载体，其中所述载体编码具有二级结构的转录产物，其中所述转录产物包含有义链和反义链。31.权利要求30所述的载体，其中所述转录产物进一步包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。32.在生物样品的细胞中抑制ZNFN3A1基因的表达的方法，所述方法包括将核糖核酸(RNA)以足够抑制ZNFN3A1基因的表达的数量导入到细胞中，其中所述RNA是包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含相应于ZNFN3A1目标序列的核糖核苷酸序列，和其中所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义和所述反义核糖核苷酸链相互杂交形成所述双链分子，和其中当被导入到表达ZNFN3A1基因的细胞中时，所述双链分子抑制所述基因的表达。全文摘要本发明记载了一种通过用ZNFN3AlsiRNA的组合物接触细胞来抑制癌细胞的生长的方法。本发明还包含治疗癌症的方法。本发明还记载了产品，包含核酸序列和载体，以及包含它们的组合物，其在本发明提供的方法中是有用的。本发明还提供一种抑制肿瘤细胞的方法，所述肿瘤细胞例如肝癌或结肠癌细胞，特别是HCC或结直肠腺癌细胞。文档编号C12N15/12GK1780912SQ200480011109公开日2006年5月31日申请日期2004年2月27日优先权日2003年2月28日发明者中村佑辅,古川洋一申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司,国立大学法人东京大学