专利名称：筛选过氧化物酶体增殖物的dna芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片，更具体而言，涉及一种DNA芯片，其包括一种探针，该探针可与个体服药过氧化物酶体增殖物后表达的基因特异性杂交，并涉及包括DNA芯片的用于筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒，制备该试剂盒地方法，和使用该试剂盒筛选过氧化物酶体增殖物的方法。
现有技术的描述
众所周知，过氧化物酶体增殖物在体内产生过量的自由基以诱发异常的细胞反应和活化促进体内甘油三酯分解的PPARs(过氧化物酶体增殖物激活的受体)。当动物服药过氧化物酶体增殖物，体内产生过量的自由基，因此过氧化物酶体在细胞中异常增殖并除去过量产生的自由基。异常增殖的过氧化物酶体吸收并除去存在于细胞的大多数自由基，而允许少量自由基保留在细胞中。因此，所述剩余的自由基，即使它们是在数量上是小的，能够导致细胞异常的氧化。在这方面，考虑到安全问题，验证一种待给药到动物的化学品是否可以作为过氧化物酶体增殖物是非常重要的。
直到现在，为验证一种待给药到动物体的化学品是否可以作为过氧化物酶体增殖物，筛选具有过氧化物酶体增殖活性的化学品的下列方法已经在本领域中使用，其包含步骤对动物给药化学品；从动物切除肝以获得用于光学显微镜检查的组织样品；和用光学显微镜检查该组织并将其大小与原样样品比较，以验证异常增殖的过氧化物酶体的存在。
然而，常规方法已经显示对于低的过氧化物酶体增殖活性的化学品具有时间消耗长和分辨率低的缺点。也就是说，从化学品服药的动物获得组织样品需要超过一天。此外，对于低过氧化物酶体增殖活性的化学品它不是相关的，产生可能不导致过度的过氧化物酶体增殖的相对小量的自由基，因此增殖的过氧化物酶体的大小与原样相比差别不明显。为了克服所述问题，本领域已经尝试了多种方法，然而还没有得到可以替换的方法。
在这种条件下，开发筛选具有过氧化物酶体增殖活性的化学品有着强烈的理由。
发明概述
本发明人致力于建立筛选具有过氧化物酶体增殖活性的方法，并发现过氧化物酶体增殖物的筛选可以使用包含特异性与个体服药过氧化物酶体增殖物时表达的基因杂交的探针的DNA芯片，和使用包含荧光标记的核苷酸以标记从分离自样品的RNA合成的cDNA的用于筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒。
因此本发明的第一个目的是提供筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片，包含可以特异性与个体服药过氧化物酶体增殖物时表达的基因杂交的探针。
本发明的第二个目的是提供制备该DNA芯片的方法。
本发明的第三个目的是提供筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒，其包含DNA芯片。
本发明的第四个目的是提供使用筛选试剂盒筛选过氧化物酶体增殖物的方法。
发明详述
本发明筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片包括由121bp到587bp核苷酸组成的探针，该探针特异性结合到被过氧化物酶体增殖物诱导表达的基因；由寡聚(dT)15，(CH2)6-和胺基以相继次序组成的接头，寡聚(dT)15的3′末端可以结合到探针的5′末端；和表面包被与接头的胺基通过Schiff碱作用连接的醛基的固体基材。在本发明优选的实施方案中，探针，不限于此，选自以下SEQ ID Nos1到12的ESTs。
AA8189105′-ACAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAACACTTTTATTTTCCACAAGGAAGAGCAATAGGAAAAGTCAAATCATTTCCCACATGGTTTTCTTAAAACAGAGCCTACAAGGACATATTCAGCACCAAATAAAAGATTACAACAGCCATAGAATATAATCTATAAAGCAAACATTTAATATTGCACTTTGTTTCGCAAACATTTTGGATTTTACTTTTCCTAAATGAAAAATTAGGAATTCAAGATAGCTTGAATACTAGAGCGCAACTGTGACCCTCAGATGTTATGTCAGGAATTGACCAATATTTAGAATAGTGTAATGCCTCAAAAGAGTAAAGAAATACTTAATGGGAAAAATAAAACTTTACTTCACCAACTCTTAAAATAATTTTGTCACCAATGCCAATTATCAGAATATTGGTCATTCTTGCTTAATAAAGTATTTTGTAGAACATGGTAGTGAGCGCCCCGAGGCCATGCACACCAACAATTGTTCCCTAGTCAGACATAACACAGAGTCAGGTGTTTTTACACAATCCCTCCCAACAAAAACAAATCCACCAAATGCCCTTTATGCCAAATATCCCATCAGCT-3′(SEQ ID No1)
AI0458275′-TTTATTGTGGGGCCACATGAAAAGGGCTGGGGTAGGGGATGTGGGGCCAGCCCCCGAGGCCTGGGGATGAGGAAAAAGTTAATACACAGTACATATAGAAGGCACAAGTGGGGAATTGGAG-3′(SEQ ID No2)
AI0458145′-CATCTCAGTTCTAAGATAGACCAATGCTCAAAGTTTTATTAATTTTCCTGAAGTGTATCTGGGACGCATGCTCCTCTAAAGAGGAGGCACTTTATTTGTTTACCCCAGAGTCCACTGTTGGCAAACAGATACTTTTTTTTCTGCACCTACCAATTTTAAATGTTCTAAATAAAACAGAAAATGTAGAAATTCTATTAACACAAGTAATGTATAATAGGAGCTAGGATCAGCATTATTATCAGTGAATGTGCTATGAGGTCTGAGGAAGCATTTGATGCCCAGTCCCCT-3′(SEQ ID No3)
AA8194085′-TGCACTATCACTCCCCAACCTACAGCCATCTGATACGCCGTGTACTGTTGCCTAGACTACAGTGAAAGGAAATGGAACTTTGTTACTTGGCTGTAGAGGACCTGATGGAAACCCTCTGTAAATGCTGGTGTTCTGAGAGAGTGCTTGTTCTGTCAAAGACCACAACCCAGAGCATTGCAGCAGTGCTGGGGAGACCAGTGAAGGCACTAGGGTAGAGAGCATTGGCATGGGTCACTGGCCCAGTAGACTTAATTCCCCTCGTGCCG-3′(SEQ ID No4)
AA8194265′-GAGGTGCGAAGGACCACATCTCCAGTCGGAACACGTTCCGTTAGTTAATTAAAAAAAAAAAAAAAGACTTGGGTTTTTGAAAACCCAAACCAGCTTTCTTCAAAGATGTCACCCTCATTTGTACCCCTGGGCTTAGCAGCGTTAAGAGGGCTCTTGGCTCATGGATGTTCCTCTCTGGACTGACTGGTGAGCAGGTCCAGGCAGGGCGGCCTCCGGGCAGGCTCCTCCCTAGCTCCATCCAGCAGCGACGCTCCCAGCAGGCTCCAGATGGCGCTCCTCCCAGAAGGAGTGGCACTGGGGGCAGCAGGTGAACTGAGGATCCTCGCCCCACAGACCGCGGCCGTTTTTTATTACACACAGGTAAAACCACA-3′(SEQ ID No5)
AA9255455′-TGGCCAGGTGGCAAGGTCACCGGTGGCCCGGTCACCGATACAGGTAGTCAGCCTGGATGTTGGCCGCGATCTCGGCCTCCCACTTGTCACCATTGTTGAGTAGCTTCTCCTTGTTGTACAGCAACTCCTCATGCGTCTCGGTGGAGAACTCAAAGTTGGGGCCCTCCACGATAGCGTCAACAGGGCAGGCTTCCTGGCAGAAACCACAGTAGATACACTTGGTCATGTCAATGTCATAGCGTGTAGTCCGGCGGCTGCCATCTGCTCTTGGCTCAGCCTCAATGGTGATGGCCTGTGCAGGACAGATGGCCTCACAGAGCTTGCAGGCGATGCAACGCTCCTCCCCAGACGGGTAGCGGCGCAGTGCATGCTCCCCACGGAAGCGCGGACTCA-3′(SEQ ID No6)
AA8595865′-AGGGTGTGGGGAGAGCTAGGCTCCTGATGTCTCCTCGGCACTGGACTGTGGGCCTGGTCAGTACACACGGGCTTGTAGAGAAAGTCAGTATCTCATTAAAAAAAGAAGCGGCGGCGGCGGCAGCATCCCGGCTGTGCAGACCGCAGCAGTGCATGTGCCTAAGACAGGCCGTACCGTCCTCTGGACCAGCACGCTCTGGACAGCCTGAGCCAGGGCAGGGTGCTGCAAAGAGGGGGCTGGGCAGGCTTAGGAGACCACAGGGAACCATACCTCAATAGGCTTCTGGCCTTGCCCAGGGTCTGGACCAAAGGGACCCCAGGCCCTGCCTCTGGGTGAACCCGTCATACGTCCATAAAGTCATCGTCCTCGTCTGTCTCACTCTCCAATGAGGACTCCTGGCTGGATGTCTCCAGAACCTCCAGGGCTGGCTGGCACAGGCTCTCCTTCCTCACATTGGCGGCA-3′(SEQ ID No7)
AA8754965′-GTGAATCAATAAAACAAAAGCTAAGGACAATGAGCTCAAGTTATCGATTCTTAAGTTTCAAAATAGAACAGTAGGAAAGCTATGAAAGTGGGGGGGTGGACTTTGGGGTGTATGAGCAATAGGAATCTAAAGCATCAAAACACAGGCTAAGAAAGTCTAGGACACAAGGAAGACTCCAGCAGCTCCCTCAGATGTCTAATTCCGGTCATTTACTTTTCACTCTAAAAAGTATCTTAAATTTTTAATATTTATTAGTTTTTTGTTTTTTCAAGACAGGGTCTCACATATAGCTCTGCCTACCCCAGAACTCACAATGAAGTCCAGGCTGACCTTGAACTCACAGAGACCCTCTAGCCTCTGCCTCTGTCGTGCTGGAATTAAAGGCACATGCACCACTATGCCCAGCATAA ATATTTA-3′(SEQ ID No8)
AI0293855′-CACTTACTAAACTAACATTATATGTTTTACAATTTTGAACAACTTTACAAGTTACTGTTATTTTCAATTCTGAGTAGAAAGGTAAACTCCAAGCAAGACAAAGCCAATAGAGGCTTAAGTTCATCACCAACAAGTTTCAACAATTTACCCCAAATTTACTGTTAAACAGTACCTGGTTGAAGACACAAGCTGCGCCTTAAATAAGCTGGAGCGACTCTGGGATGTTATGAACTTAACCTTGAAAGGAAGAAGGTATAGGAACTTCTATTTGGTTTGGATTGTAAGAACAGACAAATTACTTACAGAAACTGAATTACTTCAATACACATGTGAAGAC-3′(SEQ IDNo9)
AI0307485′-TATAGTAAATACGTGTGTTTTCCAGGATGCCACAGAATTTCATTGGAAAACAATGAAACTAGATTAACCTGAGACCCCCCCCTTCCCCTTAGAAAATAAGGACTATAGGATTAGACCACAAGCAGACTAGTAAAGGGGATGGGGTTGTGGTACACCTGATTTTAGCCAGACTTTCCCAAGCTAAATCCAGATAAAACTGCTTCTGTATTAGTAAGTTGGGTGAGTGTGTAAAATCTATCATTCAAAAAGT-3′(SEQ IDNo10)
AA8193995′-AGAGCATAGATGTGGCAGGGTCTCAGTCCCTGCACAGAAATGAGAGATGAACAAAAACGAGACACTTCCACCTGGCCAGAGTCTGGGAGGGCAGGGAGGAACACAGACCTGGACATTCGTAAGAAAAATAAAACCTAAATCAAACATTCAATCTTGTACCCAATAAAGGTTTGAACAGGGAACTCAGTCACCACCAGTTCCCACCCTCCCCTGCCAGCACTGAAGAAAAACAAAAGTTCAACACACACTAAGGGCTTAGGAGGAAGGGGCATTCTCCTGCCTTCCCCCAACCCCCAAGAATGGGCTGGGGAAAAAACGGCTATATTTCCCCACCCCTTACAGTGTCAACCCTACACGAGTTCTGAATGTGATCCGTAAGAATCAGCAGCTCAA-3′(SEQ ID No11)
AA9251285′-TGTGTTCTTAGAAAGCAAACTTAATGGCTTTCAAACCAAATCCTTAGAGCCAGTACATCAAAGGCATTGCGGTCCACGTATGCAAGGGTGTGCATGTAGAGGCCAGAGGGCAACTTTAGGAGTCAGTATTCTCCTTCCACCCTCGGCTCCAGAGTCGAATTCAGGCCTCATGAGCAACAAGCATGTTCACCTCTTGGGCCATTCACCAGTCCCAGGATCAAGACTTCTTTGATGCTTCTATTTCTTCCCACAATGCAGCTTCAATTTTTGAAGTGTCATATTCTCTCATCATATCAAACTCAAGCCATGGCTTGCTCCACTTCTGGGCTTCTTTCATTTGCTCTTCAGTTAAAGCAAGATCAAATCTGATCCCTTTAATGTTGAAGTTCGGACGTT-3′(SEQ ID No12)
制备筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片的方法包括如下步骤合成由121bp到587bp核苷酸组成的探针，该探针特异性结合到被过氧化物酶体增殖物诱导表达的基因；合成由寡聚(dT)15，(CH2)6-和胺基以相继次序组成的接头；将合成的探针的5’末端结合到合成的接头的寡聚(dT)15的3’末端；将结合到探针的接头与表面通过Schiff碱作用涂布有醛基的固体基材连接；和还原未反应的醛基。本发明优选的实施方案中，玻璃，但不限于此，被用作固体基材，而醛的还原，不限于此，通过还原剂例如NaBH4进行。
另一方面，本发明筛选氧化物酶体增殖物的试剂盒可以通过使用筛选过氧化物酶体增殖物的所述DNA芯片而制备即筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒，包括用于筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片和用于标记从样品中分离的RNA合成的cDNA的荧光标记的脱氧核苷酸。在本发明优选的实施方案中，荧光标记的脱氧核苷酸是得克萨斯红dATP，花青3dCTP，花青5dGTP或荧光素-12dUTP，但不限于此。
此外，过氧化物酶体增殖物可以使用筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒来筛选。即过氧化物酶体增殖物可以通过验证服药的化学品的过氧化物酶体增殖活性而筛选，采用如下步骤对动物给药过氧化物酶体增殖物候选化学品；从动物分离RNA；从分离的RNA使用试剂盒中荧光标记的脱氧核苷酸合成荧光标记的cDNA；将合成的cDNA用于在试剂盒中筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片，以允许杂交；和洗涤杂交的DNA芯片，并使用扫描器检查DNA芯片中杂交的探针。
根据本发明，诱导体内异常细胞反应的过氧化物酶体增殖物可以通过使用筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒容易地筛选，其使得不同化学品安全测试领域的广泛应用成为可能。
本发明进一步通过以下实施例来阐述，其不应当视为对本发明范围的限制。
实施例1与通过给药过氧化物酶体增殖物而表达的基因特异性杂交的EST(表达序列标签)的选择
如下制备实验组1-3，而无化学品处理的大鼠制备为对照组，从实验组和对照组切除肝脏。
实验组16-周龄大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化体)每天通过腹部注射0.2mg/kg具有过氧化物酶体增殖活性的氯贝特(clofibrate)处理2周；
实验组26-周龄大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化体)每天通过腹部注射0.2mg/kg具有过氧化物酶体增殖活性的吉非诺齐(gemfibrozil)处理2周；和
实验组36-周龄大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化体)每天通过腹部注射0.2mg/kg没有过氧化物酶体增殖活性的苯妥英(phenytoin)处理2周。
从大鼠收集的各肝脏，使用RNA抽提试剂盒(Micro-to-Midi总RNA纯化系统，Life Technologies，Inc.，USA)分离mRNA，并通过反转录试剂盒(Platinum Biochip Reagent Kit，Genocheck，Korea)和花青5dGTP自mRNA合成荧光标记的cDNA。
另一方面，从带有不同ESTs的Clone-LibraryTM(Research Genetics，USA)提取质粒，ESTs通过PCR技术扩增，并点样到玻璃基材上以制备含有EST作为探针的DNA芯片。
从各实验组合成的cDNAs被用于DNA芯片并与DNA芯片的探针杂交12小时。然后，通过扫描器(GenePix Scanner 4000A，Axon Inc.，Union CA)进行DNA芯片的扫描，以测量从DNA芯片的各探针发射的荧光水平。结果使用图像分析系统(GenePix Pro 4.0，Axon instrumentInc.，USA)进行分析以从探针候选物中选择12种ESTs。
选择的ESTs和它们的SEQ ID Nos.以及所述ESTs与各实验组的cDNAs杂交发射的荧光相对强度显示于下面的表1。考虑到相对荧光强度与特异性杂交的水平成比例，相对荧光强度基于参考值1.00而计算，其是在对照组cDNA与DNA芯片杂交时从花青5dGTP发射的荧光水平。
表1可以与通过给药各化学品*而特异性表达的基因杂交的ESTs和从杂交产生的相对荧光强度
*实验1，实验2，实验3分别代表用氯贝特处理的实验组1，用吉非诺齐处理的实验组2和用苯妥英处理的实验组3。
如表1所示，来自实验组1的cDNA和SEQ ID Nos 1到11的ESTs之间的杂交产生相对荧光强度的高值，来自实验组2的cDNA和SEQID Nos 12的ESTs之间的杂交也产生相对荧光强度的高值，但是来自实验组3的cDNA和SEQ ID Nos 1到12的ESTs之间的杂交产生相对荧光强度的低值。
考虑到用于实验组1和2的化学品已知具有过氧化物酶体增殖活性而用于实验组3的化学品没有活性，可以推断具有过氧化物酶体增殖活性的化学品可以使用所述12种ESTs来筛选。
实施例2DNA芯片的制备
作为用于DNA芯片的探针，实施例1选择的12种ESTs分别被化学合成，并制备由寡聚(dT)15，-(CH2)6-和胺基以相继次序组成的每个接头，然后接头的胸腺嘧啶残基被结合到合成的ESTs的5′末端。
然后，结合到接头的探针溶解在浓度50μM的缓冲液(350mM碳酸氢钠，pH9.0)中并通过点阵器(arrayer)(MicroGrid II，BioRobotics，USA
150μm的大小和400μm的间距点样在涂有醛基的载玻片(甲硅烷基化的载玻片，CSS-100，CEL，Houston，TX，USA)表面上，并进行Schiff碱作用。然后，所述载玻片用0.2％(w/v)SDS溶液和蒸馏水顺序洗涤，并浸泡到NaBH4溶液(0.1g NaBH4，30ml PBS，10ml乙醇)中15分钟。然后，还原没有与胺起反应的醛基，用蒸馏水洗涤并干燥以制备DNA芯片。
实施例3使用DNA芯片筛选过氧化物酶体增殖物
检验显示过氧化物酶体增殖活性的化学品是否可以通过使用实施例2制备的DNA芯片而筛选荧光标记的cDNAs以与实施例1类似方式合成，不同之处在于使用如下不同的化学品，并合成各实验组的荧光标记的cDNAs。
实验组46-周龄大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化体)每天用0.05mg/kg具有过氧化物酶体增殖活性的1-甲基-4-哌啶基-双(p-氯苯氧基)乙酸酯通过腹部注射处理2周；
实验组56-周龄大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化体)每天用0.05mg/kg Wy-14，643(一种具有过氧化物酶体增殖活性的致癌剂)通过腹部注射处理2周；
实验组66-周龄大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化体)每天用0.05mg/kg二-(2-乙基己基)苯二甲酸酯(一种具有过氧化物酶体增殖活性的内分泌扰乱剂)通过腹部注射处理2周；和，
实验组76-周龄大鼠(Sprague-Dawley VAF+白化体)每天用0.05mg/kg 2-羟基-3-丙基-4-[(6-四唑-5-基)己氧基]-苯乙酮(一种显示过氧化物酶体增殖活性的肝脏脂肪酸氧化抑制剂)通过腹部注射处理2周。
荧光标记的cDNAs被用于实施例2制备的DNA芯片，并杂交12小时。然后，扫描DNA芯片并分别测量发射自每一个实验组的荧光强度(参见，表2)。
表2DNA芯片与通过各化学品特异性表达的基因杂交的相对荧光强度结果
*实验4，实验5，实验6和实验7分别代表用1-甲基-4-哌啶基-双(p-氯苯氧基)处理的实验组4，用Wy-14，643处理的实验组5，用二-(2-乙基己基)苯二甲酸酯处理的实验组6和用2-羟基-3-丙基-4-[(6-四唑-5-基)己氧基]处理的实验组7。
如表2所示，来自实验组4到7的cDNA显示与DNA芯片中的各ESTs比较高的杂交程度，表明该结果与实施例1的实验组1和2的结果相同。
因此，很清楚表明具有过氧化物酶体增殖活性的化学品可以通过使用本发明的DNA芯片以迅速和准确的方式筛选。
如上述清晰的图解和说明，本发明提供DNA芯片，其包括一种探针，该探针可与个体服药过氧化物酶体增殖物时表达的基因特异性杂交，并涉及包括DNA芯片的筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒，制备该试剂盒的方法，和使用该试剂盒筛选过氧化物酶体增殖物的方法。根据本发明，过氧化物酶体增殖物诱导体内异常细胞反应可以通过使用筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒容易地筛选，这使得在各种化学品的安全试验方面广泛的应用变成可能。
虽然本发明已经公开用于作例证目的的优选的实施例，本领域技术人员将认识到多种修饰，添加和取代是可能的，而不偏离权利要求书中公开的本发明的范围和精神。
序列表
<110>株式会社 格诺切克(GENOCHECK CO.，LTD.)等
<120>筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片
(DNA CHIP FOR SCREENING OF PEROXISOME PROLIFERATOR)
<130>SCT054826-47
<160>12
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>587
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>1
acaaaaaaaa gaaaaaaaaa aaacactttt attttccaca aggaagagca ataggaaaag 60
tcaaatcatt tcccacatgg ttttcttaaa acagagccta caaggacata ttcagcacca 120
aataaaagat tacaacagcc atagaatata atctataaag caaacattta atattgcact 180
ttgtttcgca aacattttgg attttacttt tcctaaatga aaaattagga attcaagata 240
gcttgaatac tagagcgcaa ctgtgaccct cagatgttat gtcaggaatt gaccaatatt 300
tagaatagtg taatgcctca aaagagtaaa gaaatactta atgggaaaaa taaaacttta 360
cttcaccaac tcttaaaata attttgtcac caatgccaat tatcagaata ttggtcattc 420
ttgcttaata aagtattttg tagaacatgg tagtgagcgc cccgaggcca tgcacaccaa 480
caattgttcc ctagtcagac ataacacaga gtcaggtgtt tttacacaat ccctcccaac 540
aaaaacaaat ccaccaaatg ccctttatgc caaatatccc atcagct 587
<210>2
<211>121
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>2
tttattgtgg ggccacatga aaagggctgg ggtaggggat gtggggccag cccccgaggc 60
ctggggatga ggaaaaagtt aatacacagt acatatagaa ggcacaagtg gggaattgga120
g121
<210>3
<211>288
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>3
catctcagtt ctaagataga ccaatgctca aagttttatt aattttcctg aagtgtatct 60
gggacgcatg ctcctctaaa gaggaggcac tttatttgtt taccccagag tccactgttg120
gcaaacagat actttttttt ctgcacctac caattttaaa tgttctaaat aaaacagaaa180
atgtagaaat tctattaaca caagtaatgt ataataggag ctaggatcag cattattatc240
agtgaatgtg ctatgaggtc tgaggaagca tttgatgccc agtcccct 288
<210>4
<211>266
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>4
tgcactatca ctccccaacc tacagccatc tgatacgccg tgtactgttg cctagactac 60
agtgaaagga aatggaactt tgttacttgg ctgtagagga cctgatggaa accctctgta120
aatgctggtg ttctgagaga gtgcttgttc tgtcaaagac cacaacccag agcattgcag180
cagtgctggg gagaccagtg aaggcactag ggtagagagc attggcatgg gtcactggcc240
cagtagactt aattcccctc gtgccg 266
<210>5
<211>371
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>5
gaggtgcgaa ggaccacatc tccagtcgga acacgttccg ttagttaatt aaaaaaaaaa 60
aaaaagactt gggtttttga aaacccaaac cagctttctt caaagatgtc accctcattt120
gtacccctgg gcttagcagc gttaagaggg ctcttggctc atggatgttc ctctctggac180
tgactggtga gcaggtccag gcagggcggc ctccgggcag gctcctccct agctccatcc240
agcagcgacg ctcccagcag gctccagatg gcgctcctcc cagaaggagt ggcactgggg300
gcagcaggtg aactgaggat cctcgcccca cagaccgcgg ccgtttttta ttacacacag360
gtaaaaccac a 371
<210>6
<211>393
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>6
tggccaggtg gcaaggtcac cggtggcccg gtcaccgata caggtagtca gcctggatgt 60
tggccgcgat ctcggcctcc cacttgtcac cattgttgag tagcttctcc ttgttgtaca 120
gcaactcctc atgcgtctcg gtggagaact caaagttggg gccctccacg atagcgtcaa 180
cagggcaggc ttcctggcag aaaccacagt agatacactt ggtcatgtca atgtcatagc 240
gtgtagtccg gcggctgcca tctgctcttg gctcagcctc aatggtgatg gcctgtgcag 300
gacagatggc ctcacagagc ttgcaggcga tgcaacgctc ctccccagac gggtagcggc 360
gcagtgcatg ctccccacgg aagcgcggac tca 393
<210>7
<211>462
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>7
agggtgtggg gagagctagg ctcctgatgt ctcctcggca ctggactgtg ggcctggtca 60
gtacacacgg gcttgtagag aaagtcagta tctcattaaa aaaagaagcg gcggcggcgg 120
cagcatcccg gctgtgcaga ccgcagcagt gcatgtgcct aagacaggcc gtaccgtcct 180
ctggaccagc acgctctgga cagcctgagc cagggcaggg tgctgcaaag agggggctgg 240
gcaggcttag gagaccacag ggaaccatac ctcaataggc ttctggcctt gcccagggtc 300
tggaccaaag ggaccccagg ccctgcctct gggtgaaccc gtcatacgtc cataaagtca 360
tcgtcctcgt ctgtctcact ctccaatgag gactcctggc tggatgtctc cagaacctcc 420
agggctggct ggcacaggct ctccttcctc acattggcgg ca462
<210>8
<211>417
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>8
gtgaatcaat aaaacaaaag ctaaggacaa tgagctcaag ttatcgattc ttaagtttca 60
aaatagaaca gtaggaaagc tatgaaagtg ggggggtgga ctttggggtg tatgagcaat 120
aggaatctaa agcatcaaaa cacaggctaa gaaagtctag gacacaagga agactccagc 180
agctccctca gatgtctaat tccggtcatt tacttttcac tctaaaaagt atcttaaatt 240
tttaatattt attagttttt tgttttttca agacagggtc tcacatatag ctctgcctac 300
cccagaactc acaatgaagt ccaggctgac cttgaactca cagagaccct ctagcctctg 360
cctctgtcgt gctggaatta aaggcacatg caccactatg cccagcataa atattta417
<210>9
<211>337
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>9
cacttactaa actaacatta tatgttttac aattttgaac aactttacaa gttactgtta 60
ttttcaattc tgagtagaaa ggtaaactcc aagcaagaca aagccaatag aggcttaagt 120
tcatcaccaa caagtttcaa caatttaccc caaatttact gttaaacagt acctggttga 180
agacacaagc tgcgccttaa ataagctgga gcgactctgg gatgttatga acttaacctt240
gaaaggaaga aggtatagga acttctattt ggtttggatt gtaagaacag acaaattact300
tacagaaact gaattacttc aatacacatg tgaagac 337
<210>10
<211>250
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>10
tatagtaaat acgtgtgttt tccaggatgc cacagaattt cattggaaaa caatgaaact 60
agattaacct gagacccccc ccttcccctt agaaaataag gactatagga ttagaccaca120
agcagactag taaaggggat ggggttgtgg tacacctgat tttagccaga ctttcccaag180
ctaaatccag ataaaactgc ttctgtatta gtaagttggg tgagtgtgta aaatctatca240
ttcaaaaagt 250
<210>11
<211>393
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>11
agagcataga tgtggcaggg tctcagtccc tgcacagaaa tgagagatga acaaaaacga 60
gacacttcca cctggccaga gtctgggagg gcagggagga acacagacct ggacattcgt120
aagaaaaata aaacctaaat caaacattca atcttgtacc caataaaggt ttgaacaggg180
aactcagtca ccaccagttc ccaccctccc ctgccagcac tgaagaaaaa caaaagttca 240
acacacacta agggcttagg aggaaggggc attctcctgc cttcccccaa cccccaagaa 300
tgggctgggg aaaaaacggc tatatttccc caccccttac agtgtcaacc ctacacgagt 360
tctgaatgtg atccgtaaga atcagcagct caa 393
<210>12
<211>396
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>probe
<400>12
tgtgttctta gaaagcaaac ttaatggctt tcaaaccaaa tccttagagc cagtacatca 60
aaggcattgc ggtccacgta tgcaagggtg tgcatgtaga ggccagaggg caactttagg120
agtcagtatt ctccttccac cctcggctcc agagtcgaat tcaggcctca tgagcaacaa180
gcatgttcac ctcttgggcc attcaccagt cccaggatca agacttcttt gatgcttcta240
tttcttccca caatgcagct tcaatttttg aagtgtcata ttctctcatc atatcaaact300
caagccatgg cttgctccac ttctgggctt ctttcatttg ctcttcagtt aaagcaagat360
caaatctgat ccctttaatg ttgaagttcg gacgtt 39权利要求
1.筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片，其包括
(i)由121bp到587bp核苷酸组成的探针，其特异性结合到被过氧化物酶体增殖物诱导表达的基因；
(ii)由寡聚(dT)15，-(CH2)6-和胺基以相继次序组成的接头，寡聚(dT)15的3′末端可以结合到探针的5′末端；和
(iii)表面包被有与接头的胺基通过Schiff碱作用连接的醛基的固体基材。
2.权利要求1的筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片，其中探针是选自SEQ ID Nos1到12的一种以上基因。
3.制备用于筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片的方法，其包括如下步骤
(i)合成由121bp到587bp核苷酸组成的探针，该探针特异性结合到被过氧化物酶体增殖物诱导表达的基因；
(ii)合成由寡聚(dT)15，-(CH2)6-和胺基以相继次序组成的接头；
(iii)将合成探针的5’末端结合到合成接头的寡聚(dT)15的3’末端；
(iv)将结合到探针的接头与表面通过Schiff碱反应包被有醛基的固体基材连接；和
(v)还原未反应的醛基。
4.权利要求3的制备用于筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片的方法，其中探针是选自SEQ ID Nos1到12的一种以上基因。
5.筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒，包括权利要求1的DNA芯片和用于标记从样品中分离的RNA合成的cDNA的荧光标记的脱氧核苷酸。
6.权利要求5的筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒，其中荧光标记的脱氧核苷酸是得克萨斯dATP，花青3dCTP，花青5dGTP或荧光素-12dUTP。
7.使用权利要求5的试剂盒筛选过氧化物酶体增殖物的方法，其包括如下步骤
(i)对动物给药过氧化物酶体增殖物候选化学品；
(ii)从动物分离RNA；
(iii)从分离的RNA使用权利要求5的试剂盒中荧光标记的脱氧核苷酸合成荧光标记的cDNA；
(iv)将合成的cDNA用于在试剂盒中筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片，以允许杂交；和
(v)洗涤杂交的DNA芯片，并使用扫描器检查DNA芯片中杂交的探针。
8.权利要求7的使用权利要求5的试剂盒筛选过氧化物酶体增殖物的方法，其中荧光标记的脱氧核苷酸是得克萨斯红dATP，花青3dCTP，花青5dGTP或荧光素-12dUTP。
全文摘要
本发明涉及DNA芯片，其包括一种探针，该探针可与个体服药过氧化物酶体增殖物后表达的基因特异性杂交，并涉及筛选包括DNA芯片的过氧化物酶体增殖物的试剂盒，制备该试剂盒的方法，和使用该试剂盒筛选过氧化物酶体增殖物的方法。本发明筛选过氧化物酶体增殖物的DNA芯片包括由121bp到587bp核苷酸组成的探针，其特异性结合到被过氧化物酶体增殖物诱导表达的基因；由寡聚(dT)15r(CH2) 6－和胺基以相继次序组成的接头，寡聚(dT)15的3′末端可以结合到探针的5′末端；和表面包被与接头的胺基通过Schiff碱作用连接的醛基的固体基材。根据本发明，过氧化物酶体增殖物诱导体内异常细胞反应可以通过使用筛选过氧化物酶体增殖物的试剂盒容易地筛选，这使得在各种化学品的安全试验方面广泛的应用变成可能。
文档编号C12Q1/68GK1798852SQ200480015069
公开日2006年7月5日 申请日期2004年4月13日 优先权日2004年3月31日
发明者黄丞镛, 郑真旭, 吴文珠, 金升俊, 延钟泌, 金俊燮, 金容贤, 李昌弦, 尹贤圭, 廉惠晶, 康景宣, 李荣纯, 朴埈奭, 黄载雄, 金良石, 李婉先, 金起善, 严赞辉, 姜宗秀, 李炅宰, 宋福洙, 金锦珍, 吕灿东 申请人:株式会社格诺切克, 财团法人Seoul大学校产学协力财团, 株式会社艾斯泰克, 株式会社新元科学