专利名称：融合蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及异源融合蛋白质，其包含活性治疗肽和具有延长活性治疗肽的体内半寿期作用的免疫球蛋白的恒定重链(Fc)部分。这些异源融合蛋白质可用于治疗人类疾病以及多种其他病症或疾病。
许多活性治疗肽在治疗多种疾病的临床试验中很有前景。然而，使用这些肽的治疗有用性由于许多肽活性差，在体内迅速被清除或者具有非常短的体内半寿期的事实受到局限。已经进行多种方法以在保持生物活性同时延长这些肽的清除半寿期或减少身体中这些肽的清除。一种方法包括融合活性治疗肽与免疫球蛋白的恒定重链(Fc)部分。免疫球蛋白一般在体内具有长的循环半寿期。例如IgG分子在人类中具有长达23天的半寿期。免疫球蛋白的Fc部分部分地与此体内稳定性相关。这些异源融合蛋白质在保持该肽稳定性的同时具有免疫球蛋白的Fc部分提供的稳定性。
虽然此方法对肽治疗法是可行的(见WO 02/46227)，但是会考虑半抗体形成、不需要的效应子功能、糖基化位点和异质性表达。本发明探索通过鉴定和替换在所述分子的Fc部分中多个位置上的氨基酸从而减少半抗体形成和减轻或消除效应子功能来克服这些问题。另外，本发明还提供了鉴定和替换在所述分子的Fc部分中多个位置上的氨基酸从而使得所述分子在表达期间中不具有糖基化位点并具有降低的异质性的方法。此外，希望鉴定和替换在所述分子的Fc部分中多个位置上的氨基酸从而在异源融合蛋白质的反复和长期施用之后不诱导免疫应答。
本发明的化合物包括含有与免疫球蛋白的Fc部分融合的活性治疗肽的异源融合蛋白质，其中所述的免疫球蛋白的Fc部分包含SEQ ID NO1Xaa1-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaa80-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa230(SEQ ID NO1)的序列，其中1位的Xaa为Ala或不存在；16位的Xaa为Pro或Glu；17位的Xaa为Phe、Val、或Ala；18位的Xaa为Leu、Glu、或Ala；80位的Xaa为Asn或Ala；以及230位的Xaa为Lys或不存在。
本发明的肽部分和Fc部分直接或由接头融合在一起。接头的实例为具有序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)的富G的肽接头。其他接头的实例包括但不限于Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(1.5L)(SEQ ID NO4)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(2L)(SEQ ID NO6)、Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys(SEQ ID NO7)和Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg(SEQ ID NO8)。
将肽部分的C端和Fc部分的N端融合到一起。备选地，将肽部分的N端部分和Fc部分的C端融合到一起。此外，将肽部分的C端与Fc部分的N端融合并且将另一肽分子的N端与Fc部分的C端融合得到肽-Fc-肽融合蛋白质。
本发明还包括编码本发明异源融合蛋白质的多核苷酸以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明也包括治疗患有人类疾病以及多种其他病症或疾病的患者的方法，其包括施用异源融合蛋白质。
本发明的异源融合蛋白质包含活性治疗肽部分和Fc部分。Fc部分包含人IgG4序列的替换，其与未和Fc序列融合的活性治疗肽相比为异源融合蛋白质提供增加的体内稳定性。
本发明的异源融合蛋白质含有来自人类IgG4，但是与野生型人类序列相比包括一个或多个替换的Fc部分。如此处所使用，免疫球蛋白的Fc部分具有免疫学领域通常赋予该术语的意义。该术语尤其指不含有来自该抗体两个抗原结合区(Fab片段)的抗体片段。Fc部分由通过非共价相互作用和二硫键结合的抗体的两个重链恒定区组成。Fc部分可以包含铰链区，并经CH2和CH3结构域延伸到抗体C末端。Fc部分还可以包含一个或多个糖基化位点。
有五种类型的具有不同效应子功能和药物动力学特性的人类免疫球蛋白。IgG是五种类型中最稳定的，在人体具有约23天的血清半寿期。有四个IgG亚类(G1、G2、G3和G4)，各亚类具有称作效应子功能的不同生物学功能。这些效应子功能通常由与Fc gamma受体(FcγR)的相互作用或通过结合补体1(C1q)亚成分介导，其中所述的补体1亚成分识别并结合免疫球蛋白G或免疫球蛋白M的重链，启动经典补体途径。与FcγR的结合可以导致抗体依赖细胞介导的细胞裂解，而与补体因子的结合可以导致补体介导的细胞裂解。在仅利用Fc部分延长半寿期的能力的异源融合蛋白质的设计中，将效应子功能最小化是重要的。因此，本发明的异源融合蛋白质来自人类IgG4Fc区域，因其与其他IgG亚型相比结合FcγR和补体因子的能力降低。然而，已经表明IgG4耗竭人体中靶细胞[Issacs等人，(1996)Clin.Exp.Immunol.106427-433]。因为本发明的异源融合蛋白质靶定体内多种器官的细胞，在异源融合蛋白质中使用IgG4衍生区域可通过异源蛋白质与靶细胞上的受体相互作用启动针对细胞的免疫反应。因此，作为本发明的异源融合蛋白质一部分的IgG4 Fc区域含有消除效应子功能的替换。本发明的异源融合蛋白质的IgG4 Fc部分可以含有一个或多个下列替换在残基233处以脯氨酸替换谷氨酰胺，在残基234处以丙氨酸或缬氨酸替换苯丙氨酸，以及在残基235处以丙氨酸或谷氨酰胺替换亮氨酸(EU编号方式，Kabat，E.A.等人，(1991)《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第五版，U.S.Dept.of Health and HumanServices，Bethesda，MD，NIH出版91-3242)。这些残基对应于SEQ ID NO1中的第16、17和18位。另外，在对应于SEQ ID NO1第80位的第297个残基(EU编号)以Ala替换Asn而去除IgG4Fc区域中N-连接的糖基化位点是保证消除异源融合蛋白质消除残留效应子活性的另一条路径。
另外，本发明异源融合蛋白质的IgG4Fc部分含有稳定重链二聚体结构和防止半IgG4Fc链形成的替换。本发明的异源融合蛋白质优选以通过二硫键和多种非共价相互作用连接的二聚体存在。野生型IgG4含有在残基224处(EU编号)开始的Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys(SEQ ID NO3)基序。单个活性治疗肽-Fc链中的该基序与另一条活性治疗肽-Fc链中的对应基序形成二硫键。然而，该基序中丝氨酸的存在引起单链异源融合蛋白质的形成。本发明包含异源融合蛋白质，其中IgG4序列经过进一步修饰，从而以脯氨酸替换第228位(EU编号)的丝氨酸(SEQ ID NO1中的第11个氨基酸残基)。
在此讨论的异源融合蛋白质的IgG4衍生的Fc部分中可以缺失存在于天然分子中的C末端赖氨酸残基(SEQ ID NO1第230位；将缺失的赖氨酸称为des-K)。某些细胞型(例如NS0细胞)表达的、其中赖氨酸由C末端密码子编码的异源融合蛋白质是异质的，因为一部分分子将赖氨酸作为C末端氨基酸，而一部分缺失赖氨酸。该缺失归因于某些类型的哺乳动物细胞表达过程中蛋白酶的作用。因此，为了避免这种异质性，异源融合表达构建体优选缺乏C末端赖氨酸密码子。
活性治疗肽部分的C末端氨基酸优选通过富含甘氨酸的接头与IgG4Fc类似物部分的N末端融合。可以通过加入小的肽接头防止潜在的不必要的结构域相互作用来优化本发明的异源融合蛋白质的体内功能和稳定性。另外，富含甘氨酸的接头提供了一定的结构柔性，使活性治疗肽部分可以与靶细胞上的活性治疗肽有效地相互作用。然而，这些接头可以显著增加异源融合蛋白质体内免疫原性的危险。因此，优选不多于必要的长度以防止不必要的结构域相互作用和/或优化生物学活性和/或稳定性。优选的富含甘氨酸的接头包括序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)。尽管在本发明的异源融合蛋白质中可以使用该接头的更多拷贝，优选使用该接头的单拷贝以最小化与长期和反复施用有关的免疫原性危险。
活性治疗肽可不局限地为酶、酶抑制剂、抗原、抗体、激素、参与凝固控制的因子、干扰素、细胞因子、生长因子和/或分化因子、参与骨组织发生/再吸收的因子、参与细胞运动或迁移的因子、杀细菌或抗真菌因子、趋化因子、细胞静止因子、血浆或间质粘连分子或细胞外基质，或备选地为与循环和间质隔室病理和例如动脉或静脉血栓形成、癌转移、肿瘤血管发生、炎性休克、自身免疫病、骨和骨关节病理等等相关的分子和/或胞间相互作用的拮抗剂或激动剂。活性治疗肽的实例包括但不限于G-CSF、GM-CSF、嗜酸性粒细胞(EOS)-CSF、巨噬细胞(M)-CSF、多CSF、促红细胞生成素(EPO)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-18、c-kit配体、成纤维细胞生长因子(FGF)21、干细胞因子(SCF)、肥大细胞生长因子、红细胞类增强活性(erythroidpotentiating activity)(EPA)、乳铁蛋白(LF)、H亚基铁蛋白(即酸性异铁蛋白)、前列腺素(PG)E1和E2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、-β(即淋巴毒素)、干扰素(IFN)-α(1b、2a和2b)、-β、-ω和-γ；转化生长因子(TGF)-β、激活蛋白、抑制素、白血病抑制因子、制瘤素M、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1-α(即干细胞抑制剂)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1β、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-2-α(即GRO-β)、GRO-α、MIP-2-β(即GRO-γ)、血小板因子4、巨噬细胞趋化性和活化因子、IP-10、降钙素、生长激素、PTH、TR6、BLyS、BLyS单链抗体、抵抗蛋白、生长激素释放因子、VEGF-2、KGF-2、D-SLAM、KDI、TR2、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、毒蜥外泌肽4和神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)、或者其受体PAC-1、VPAC-1或VPAC-2之一、或者前面提到的肽的任意一种的活性类似物、片段或衍生物。
本文所用的指异源融合蛋白质的名称定义如下L指具有序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO2)的接头。紧接L前面的数字指将活性治疗肽部分和Fc部分分开的接头数。以1.5L表示的接头指序列Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO4)。以2L表示的接头指序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO6)。IgG4指SEQ ID NO1表示的人IgG4Fc序列类似物。异源融合蛋白质IgG4Fc部分的替换显示于圆括号中。野生型氨基酸以常用缩写表示，其后跟随使用EU编号系统的在整个IgG4序列中的位置号，随后为该位置以常用缩写表示的被替换的氨基酸。
尽管可以通过多种不同的方法制备本发明的异源融合蛋白质，但是由于异源融合蛋白质的大小，优选重组方法。对于在此处所公开并要求保护的本发明，下面定义下列常见分子生物学术语及缩写。
此处使用的“碱基对”或“bp”指DNA或RNA。当缩写A、C、G和T出现在DNA分子中时，分别相应于脱氧核糖核苷(脱氧)腺苷、(脱氧)胞苷、(脱氧)鸟苷和胸苷的5′-单磷酸形式。当缩写U、C、G和A出现在RNA分子中时，分别相应于核糖核苷尿嘧啶核苷、胞苷、鸟苷和腺苷的5′-单磷酸形式。在双链DNA中，碱基对可以指A与T或C与G的配对。在DNA/RNA中，异源双链体碱基对可以指A与U或C与G的配对。(见下文“互补”的定义。)DNA的“消化”或“限制”指用限制酶的催化切割DNA，所述限制酶仅作用在DNA中特定序列(“序列特异性核酸内切酶”)。此处使用的多种限制性酶可以通过商业途径获得，并且它们的反应条件、辅因子和其他要求是本领域普通技术人员公知的。特定限制性酶的适宜缓冲液和底物量由制造商说明，或者易于在文献中找到。
“连接”指两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。除非另有提供，可以使用公知缓冲液和条件以DNA连接酶例如T4DNA连接酶完成连接。
“质粒”指染色体外(通常)自我复制的遗传元件。
此处使用的“重组DNA克隆载体”指包含可以或已经加入一个或多个额外DNA片段的DNA分子的任何自主复制的介质，包括但是不限于质粒和噬菌体。
此处使用的“重组DNA表达载体”指整合了控制插入DNA转录的启动子的任何重组DNA克隆载体。
“转录”指将DNA核酸序列中含有的信息转移到互补RNA序列的过程。
“转染”指宿主细胞对表达载体的吸收，无论事实上是否表达任何编码序列。普通技术人员已知大量转染方法，例如磷酸钙共沉淀、脂质体转染和电穿孔。当该载体作用的任何指征出现在宿主细胞内时，一般认为成功转染。
“转化”指将DNA引入生物体，该DNA从而可以作为染色体外元件或通过染色体整合而复制。转化细菌和真核宿主的方法在本领域广为人知，在J.Sambrook等人，《Molecular CloningA Laboratory Manual》(1989)中总结了许多方法，例如核注射、原生质体融合或通过使用氯化钙的钙处理。通常，将DNA引入酵母时，术语转化与术语转染相对使用。
此处使用的“翻译”指使用信使RNA(mRNA)的遗传信息指定并指导多肽链合成的过程。
“载体”指用于基因操作中细胞转染和/或转化的核酸化合物，其携带对应于适当蛋白质分子的多核苷酸序列，其当与适当的控制序列组合时把特定性质赋予将被转染和/或转化的宿主细胞。质粒、病毒和噬菌体是适宜的载体。使用限制性酶和连接酶切割和连接不同来源的DNA分子构建人工载体。此处使用的术语“载体”包括重组DNA克隆载体和重组DNA表达载体。
此处使用的“互补”或“互补性”指双链核酸中通过氢键结合的碱基对(嘌呤和嘧啶)。下列碱基对是互补的鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。
“引物”指起酶或合成延伸的启动底物功能的核酸片段。
“启动子”指指导DNA转录为RNA的DNA序列。
“探针”指与另一种核酸化合物杂交的核酸化合物或其片段。
“前导序列”指可以经酶或化学去除产生所需目的多肽的氨基酸序列。
“分泌信号肽”指通常出现在较大多肽N末端区域的氨基酸序列，其功能是启动所述多肽与细胞膜隔室例如内质网的结合以及该多肽通过质膜分泌。
可以从多种来源获得野生型人类IgG4蛋白质。例如，可以从以可检测水平表达目的mRNA的细胞制备cDNA文库以获得这些蛋白质。使用特定目的蛋白质的公开的DNA或蛋白质序列设计的探针可以对文库进行筛选。例如，在Adams等人，(1980)Biochemistry 192711-2719；Goughet等人，(1980)Biochemistry 192702-2710；Dolby等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 776027-6031；Rice等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA797862-7862；Falkner等人，(1982)Nature 298286-288；以及Morrison等人，(1984)Ann.Rev.Immunol.2239-256中描述了免疫球蛋白轻或重链恒定区。
可以使用标准程序以所选探针筛选cDNA或基因组文库，例如在Sambrook等人，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY(1989)中所述。分离编码免疫球蛋白蛋白质的基因的备选方法是使用PCR方法[Sambrook等人，如上；Dieffenbach等人，《PCR PrimerA Laboratory Manual》，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY(1995)]。可以基于已发表的序列设计PCR引物。
从特定文库克隆的全长野生型序列一般可用作产生本发明IgG4Fc类似物片段的模板，其中所述的IgG4Fc类似物片段保持对作为异源融合蛋白质一部分的活性治疗肽更长血浆半寿期的能力。可用引物使用PCR技术产生IgG4Fc类似物片段，其中所述的引物设计用来和与所述片段的所希望的末端对应的序列杂交。也可设计PCR引物产生限制性酶切位点以便于克隆到表达载体中。
可通过多种不同方法产生编码本发明活性治疗肽的DNA，所述方法包括如前面所述的克隆方法以及化学合成DNA。如果编码肽的长度短，那么化学合成是吸引人的。公知并公开了活性治疗肽的氨基酸序列[Lopez，等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 805485-5489；Bell，等人(1983)Nature，302716-718；Heinrich，G.，等人(1984)Endocrinol，1152176-2181；Ghiglione，M.，等人(1984)Diabetologia 27599-600]。
然后可通过将编码活性治疗肽的DNA与编码本文所述IgG Fc蛋白质的DNA连接在框内构建编码异源融合蛋白质的基因。可在连接前或在编码完整异源融合蛋白质的背景中突变编码活性治疗蛋白质和IgG4Fc片段的DNA。本领域熟知多种诱变技术。编码活性治疗蛋白质的基因和编码IgG4Fc类似物蛋白质的基因也可由编码富含甘氨酸接头肽的DNA连接在框内。编码本发明的异源融合蛋白质之一
Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P，F234A，L235A，des K)的DNA序列的实例在SEQ ID NO5中提供CACGGCGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGAGGAGCAGGCCGCCAAGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGCGGCGGTGGTGGTGGCTCCGGAGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGCTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT(SEQ ID NO5)以此处所述用于异源融合蛋白质产生的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞，并在经改良适于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所希望的序列的基因的常规营养培养基中培养。技术人员不用过多实验方法即可以选择例如培养基、温度、pH等培养条件。一般而言，可以在《Mammalian CellBiotechnologyA Practical Approach》，M.Butler编(IRL Press，1991)和如上之Sambrook等人著作中找到将细胞培养生产力最大化的原理、方法和实践技术。普通技术人员已知转染方法，例如CaPO4和电穿孔。在美国专利号4,399,216中描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面。通常根据van Solingen等人，J Bact.130(2)946-7(1977)和Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(8)3829-33(1979)的方法进行酵母转化。然而，也可以使用将DNA引入细胞的其他方法，例如核微注射、电穿孔、细菌与完整细胞的原生质体融合、或聚阳离子，例如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)或polyomithine。关于转化哺乳动物细胞的多种技术，见Keown等人，Methods in Enzymology 185527-37(1990)和Mansour等人，Nature 336(6197)348-52(1988)。
克隆或表达此处载体中核酸(例如DNA)的合适的宿主细胞包括酵母或高等真核细胞。
真核微生物例如丝状真菌或酵母是异源融合蛋白质载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)[Beach和Nurse，Nature 290140-3(1981)；1995年5月2日公布的EP 139,383]；Muyveromyces宿主[美国专利号4,943,529；Fleer等人，Bio/Technology9(10)968-75(1991)]例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C、CBS683、CBS4574)[de Louvencourt等人，J.Bacteriol.154(2)737-42(1983)]；脆壁克鲁维酵母(K.fiagilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K wickeramii)(ATCC24,178)、K waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36.906)[Van den Berg等人，Bio/Technology 8(2)135-9(1990)]；K.thermotoierans和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；yarrowia(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)[Sreekrishna等人，J.Basic Microbiol.28(4)265-78(1988)]；假丝酵母属(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)[Case等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 76(10)5259-63(1979)]；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如许旺酵母(Schwanniomyces occidentulis)(EP394,538，1990年10月31日发表)；以及丝状真菌例如脉孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium(WO 91/00357，1991年1月10日发表)以及曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)[Balance等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.112(1)284-9(1983)]；Tilburn等人，Gene 26(2-3)205-21(1983)；Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(5)1470-4(1984)]和黑曲菌(A.niger)[Kelly和Hynes，EMBO J.4(2)475-9(1985)]。甲基营养酵母选自汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。可以在C.Antony，《The Biochemistry of Methylotrophs》，269(1982)中找到这类酵母示范性的特定种的名单。
表达本发明异源融合蛋白质的合适的宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞，例如果蝇S2和灰赤夜蛾(Spodoptera)Sp、灰赤夜蛾high5及植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括NSO骨髓瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP2和COS细胞。更特定的实例包括以SV40转化的猴肾脏CVI系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系[293或在悬浮培养中生长的亚克隆293细胞，Graham等人，J.GenVirol.，36(1)59-74(1977)]；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR[CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77(7)4216-20(1980)]；小鼠支持细胞[TM4，Mather，Biol.Reprod.23(1)243-52(1980)]；人类肺细胞(W138.ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2、HB 8065)；以及小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)。产生本发明异源融合蛋白质的优选细胞系是可从欧洲动物细胞保藏中心(European Collection of Cell Cultures)获得的NS0骨髓瘤细胞系(ECACC，目录号#85110503)，其在Galfre，G.和Milstein，C.描述((1981)Methods in Enzymology 73(13)3-46；及《Preparation ofMonoclonal AntibodiesStrategies and Procedures》，Academic Press，N.Y.，N.Y.)中描述。
可以直接或作为具有信号序列或其他附加序列蛋白质重组产生本发明的异源融合蛋白质，所述其他附加序列在成熟异源融合蛋白质N末端产生特异剪切位点。一般，信号序列可以是载体组分，或可以是插入到载体中的编码异源融合蛋白质的DNA的一部分。对于酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母和克鲁维氏酵母cc-因子前导序列，后者在美国专利号5,010,182中有描述)、或酸性磷酸酶前导序列、白假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列(EP 362,179)或WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列可以用于指导蛋白质的分泌，例如相同或相关物种分泌多肽的信号序列和病毒分泌性前导序列。
表达和克隆载体都含有使载体能够在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。表达和克隆载体一般将含有选择基因，也称为选择标记。典型的选择基因编码(a)赋予抗生素或其他毒素(例如新霉素、氨甲蝶呤或四环素)抗性、(b)弥补自养缺陷、或(c)补充不能从复杂培养基获得的关键营养物(例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因)的蛋白质。
哺乳动物细胞合适的选择标记的实例是能够鉴定有能力吸收异源融合蛋白质编码核酸的细胞的那些选择标记，例如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR时，恰当的宿主细胞是如描述[Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77(7)4216-20(1980)]所描述的制备并增殖的DHFR活性缺陷的CHO细胞系。在酵母中使用的合适的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trpl基因[Stinchcomb等人，Nature 282(5734)39-43(1979)；Kingsman等人，Gene 7(2)141-52(1979)；Tschumper等人，Gene 10(2)157-66(1980)]。Trpl基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株例如ATCC No.44076或PEPC1提供选择标记[Jones，Genetics 8523-33(1977)]。
表达和克隆载体通常含有与异源融合蛋白质编码核酸序列有效连接以指导mRNA合成的启动子。由多种可能的宿主细胞识别的启动子广为人知。与酵母宿主使用的合适的启动子序列实例包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等人，J.Biol.Chem.255(24)12073-80(1980)]或其他糖酵解酶[Hess等人，J.Adv.Enzyme Reg.7149(1968)；Holland，Biochemistry17(23)4900-7(1978)]，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、已糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。其他酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮素代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区，所述启动子是可诱导的启动子，具有由生长条件控制转录的额外的优点。在EP 73,657中进一步描述了用于酵母表达的合适的载体和启动子。例如，通过启动子可以控制异源融合蛋白质编码mRNA从哺乳动物宿主细胞中载体的转录，所述启动子可以来自病毒基因组，例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿病毒40(SV 40)；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，以及热休克启动子，条件是这些启动子与宿主细胞系统相容。
可以通过向载体中插入增强子序列增加高等真核细胞对编码异源融合蛋白质的多核苷酸的转录。增强子是作用于启动子以增加其转录的DNA顺式作用元件，通常约10至300bp。已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、a-酮蛋白(ketoprotein)和胰岛素)的增强子序列。然而，人们一般将使用真核细胞病毒启动子。实例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子、以及腺病毒增强子。可以将增强子在异源融合蛋白质编码序列的5′或3′位剪接在载体中，但是优选位于启动子5′位。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或其他多细胞生物的有核细胞)的表达载体也将含有转录终止和稳定mRNA所必需的序列。通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5′以及偶然从3′非翻译区获得这些序列。这些区域含有转录为编码异源融合蛋白质的mRNA中非翻译部分中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。
可以从培养基或宿主细胞裂解物中回收多种形式的异源融合蛋白质。如果是膜结合的，可以使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或酶切割将其从膜上释放。可以通过多种物理或化学方法(例如循环冻融、超声处理、机械破碎或细胞裂解试剂)来破碎异源融合蛋白质表达中使用的细胞。
一旦在合适的宿主细胞中表达本发明的异源融合蛋白质，就可以分离并纯化类似物。下列步骤是适宜的纯化步骤的代表羧甲基纤维素分级分离；凝胶过滤例如Sephadex G-75；阴离子交换树脂例如DEAE或Mono-Q；阳离子交换例如CM或Mono-S；金属鳌合柱以结合多肽的表位标签形式；反相HPLC；层析聚焦；硅胶；乙醇沉淀；以及硫酸铵沉淀。
可以使用多种蛋白质纯化方法，这类方法为本领域所公知并在例如Deutscher，Methods in Enzymology 18283-9(1990)和《Scopes，ProteinPurificationPrinciples and Practice》，Springer-Verlag，NY(1982)中得到描述。所选的纯化步骤取决于使用的生产方法以及产生的特定异源融合蛋白质的性质。例如，使用蛋白质A或蛋白质G亲合基质可以有效纯化包含Fc片段的异源融合蛋白质。可以使用低或高pH缓冲液从亲合基质洗脱异源融合蛋白质。温和的洗脱条件将有助于防止异源融合蛋白质的不可逆变性。
可以用一种或多种赋形剂配制本发明的异源融合蛋白质。本发明的异源融合蛋白质可以与可药用的缓冲液、经调节提供可接受的稳定性的pH、以及可施用(例如胃肠外施用)的pH组合。任选地，可以添加一种或多种可药用的抗微生物剂。间甲酚和苯酚是优选的可药用抗微生物剂。可以添加一种或多种可药用盐溶液以调节离子强度或张力。可以添加一种或多种赋形剂以进一步调节制剂的等渗性。甘油是等渗性调节赋形剂的实例。可药用意味着适于施用于人类或其他动物，因此不含有毒性成分或不希望的污染物，并且不干扰其中活性化合物的活性。
可以以溶液制剂或能够用合适的稀释剂重构的冻干粉配制本发明的异源融合蛋白质。冻干剂型是其中异源融合蛋白质稳定的一种剂型，具有或不具有重构产品在预期的使用货架期内保持pH的缓冲能力。包含在此讨论的异源融合蛋白质的溶液在冻干前优选是等渗的，使之重构后能够形成等渗溶液。
本发明的异源融合蛋白质的可药用盐溶液形式在本发明范围内。常用于形成酸加成盐的酸为无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，以及有机酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基-磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。优选的酸加成盐是与无机酸，例如盐酸和氢溴酸形成的盐。
碱加成盐包括从无机碱，例如铵、碱或碱土金属氢氧化物衍生的那些盐、碳酸盐、碳酸氢盐等。在制备本发明的盐溶液中有用的这类碱因此包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。
本发明的异源融合蛋白质具有生物活性。生物活性指异源融合蛋白质在体内结合和激活受体并引起反应的能力。检测了代表性数量的异源融合蛋白质的体外以及体内活性。实施例1和2提供了基于异源融合蛋白质与人GLP-1受体相互作用并激活GLP-1受体的能力的体外活性陈述。两组实验中都使用了过量表达人GLP-1受体的HEK293细胞。这些细胞中GLP-1受体的激活引起腺苷酸环化酶的活化，其又诱导环AMP应答元件(CRE)驱动的报告基因的表达。实施例1(表1)提供了典型数据，其中报告基因为β-内酰胺酶，实施例2(表2)提供了典型数据，其中报告基因为萤光素酶。实施例3提供了对大鼠施用本发明的异源融合蛋白质之后产生的典型数据。实施例4(表6)提供了对猴子施用本发明的异源融合蛋白质之后产生的典型数据。实施例5(表7)提供了反复皮下注射异源融合蛋白质之后评价可能的抗体形成的典型数据。实施例6(表8)提供了对猴子注射本发明的异源融合蛋白质之后药物动力学研究的典型数据。实施例7(表9)提供了对大鼠注射三种不同剂量之后药物动力学研究的典型数据。实施例8(表10)提供了对小鼠施用本发明的不同异源融合蛋白质之后产生的典型数据。典型数据一起表明异源融合蛋白质能结合并激活其受体，比活性治疗肽表现更为有效，在体内有活性并比活性治疗肽具有更长的半寿期，非免疫原性并且为剂量应答的。
可通过普通医生已知有效的任何途径施用异源融合蛋白质。外周肠胃外为一种这样的方法。在医学文献中肠胃外施用通常理解为通过无菌注射器或一些其他机械装置如输注泵注射剂型到体内。外周肠胃外途径可包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用途径。
本发明的异源融合蛋白质也可以进行经口、直肠、经鼻或下呼吸道途径施用，它们是非肠胃外途径。这些非肠胃外途径中，优选下呼吸道途径和经口途径。
本发明的异源融合蛋白质可以用于治疗多种疾病和病症。
此处描述的异源融合蛋白质的有效量是施用于需要活性治疗肽受体刺激的受试者时引起所希望的治疗和/或预防效果而不导致不可接受的副作用的量。“所希望的治疗性效果”包括下列一项或多项1)疾病或病症相关症状的改善；2)疾病或病症相关症状发作的延迟；3)与没有治疗相比增长的寿命；以及4)与没有治疗相比更好的生活质量。
优选每两周一次或每周一次施用本发明的异源融合蛋白质。取决于所治疗的疾病，可能有必要更频繁地施用该异源融合蛋白质，例如每周两至三次。
现在仅以非限制性实例参考下列实施例对本发明进行描述。
实施例实施例1-体外GLP-1受体激活试验使用CRE-BLAM系统将表达人类GLP-1受体的HEK-293细胞以20,000至40,000细胞/孔/100μl含10％FBS的DMEM培养基接种到多聚-d-赖氨酸包被的96孔黑色透明底板中。接种后一天，弹去(flick off)培养基，添加80μl无血清DMEM培养基。接种后第三天，将含0.5％BSA、含有不同浓度的多种GLP-1-Fc异源融合蛋白质的无血清DMEM培养基20μl加入各孔，以产生剂量反应曲线。通常，使用含有3纳摩尔至30纳摩尔异源GLP-1Fc融合蛋白质的14种稀释液来产生剂量反应曲线，从该曲线可以确定EC50值。以融合蛋白质孵育5小时后，加入20μl β-内酰胺酶底物(CCF2/AM，PanVera LLC)，并持续培养1小时，此时在细胞荧光计上测定荧光。在Zlokarnik等人，(1998)，Science，27884-88中进一步描述了该测定。测试多种GLP-1-Fc融合蛋白质，EC50值在表1中给出。这些值是相对于Val8-GLP-1(7-37)OH的测定值，Val8-GLP-1(7-37)OH作为各实验内部对照。
表1
化合物活性标准差Val8-GLP-1 100％Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P，F234A，L235A)301％99Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4(S228P，F234A，L235A) 314％45Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P，F234A，L235A)468％120Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P，F234A，L235A) 441％35实施例2-体外GLP-1受体激活试验使用CRE-荧光素酶系统将稳定表达人类GLP-1受体的HEK-293细胞以30,000个细胞/孔/80μl低血清DMEM F12培养基接种于96孔板中。接种后一天，将溶于0.5％BSA的待测蛋白质的20μl等分试样与细胞混合并孵育5小时。对于每种待测蛋白质，一般以5×浓度制备含有3pM至3nM的12个稀释物后加入细胞，从而产生剂量反应曲线，从中确定EC50值。孵育后，将100μl荧光素酶直接加入各板，轻轻混合2分钟。将板置入Tri-lux发光计并计算荧光素酶表达引起的光输出。测试多种GLP-1-Fc融合蛋白质，EC50值呈于表2中。这些值是相对于Val8-GLP-1(7-37)OH的测定值，Val8-GLP-1(7-37)OH作为各实验内部对照。由于下面测试的异源融合蛋白质为二聚体，考虑摩尔浓度2倍差异校正所述值。
表2化合物活性标准差Val8-GLP-1100％Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P，F234A，L235A) 535％240Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4(S228P，F234A，L235A) 595％43Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P，F234A，L235A) 1119％128Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P，F234A，L235A)398％62Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P，F234A，L235A)417％40
实施例3 大鼠中静脉内葡萄糖耐量试验在大鼠静脉内葡萄糖耐重测定中评价异源融合蛋白质Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4(S228P、F234A、L235A)。三组中每组包含至少四只大鼠。I组接受载体(表3)，II组接受1.79mg/kg的Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4(S228P、F234A、L235A)作为单次皮下注射(表4)，III组接受0.179mg/kg的Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4(S228P、F234A、L235A)作为单次皮下注射(表5)。在第一天早晨皮下注射大鼠。首次注射二十四小时之后，每克大鼠体重1μL葡萄糖(D50)以快速浓注灌注。在葡萄糖快速浓注灌注后的2、4、6、10、20和30分钟采集血液样品。
表3
表4
得到的PK参数值的代表总结于表6中。来自RIA的单剂SC PK与446.7ng/mL的平均Cmax及相应17.3小时的Tmax关联。平均清除半寿期约79.3小时(3.3天)。来自ELISA的PK与292.2ng/mL的平均Cmax及相应16.7小时的Tmax关联。评价清除半寿期约51.6小时(2.2天)。
表6
a观察到的最大血浆浓度。
b观察到的最大血浆浓度的时间。
c血浆浓度-时间曲线下测量的0至无穷大的面积。
d清除半寿期。
e总机体清除率关于生物利用率的函数。
f分布体积关于生物利用率的函数。
SD＝标准差。
实施例5 重复皮下注射后抗体潜在形成的评价使用直接ELISA形式对指定猕猴血清样品测试抗Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4(S228P、F234A、L235A)抗体的形成。以0.1μg/mL浓度的Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4(S228P、F234A、L235A)包被微量滴定板。将猴血清样品50、500、1000和5000倍稀释到封闭溶液中，孵育0.05mL样品/孔约一小时。将二级抗体山羊<人Fab′2>-过氧化物酶(与人类75％的交叉反应性)10,000倍稀释于封闭溶液中，以0.05mL/孔加入并孵育约一小时。在450nm-630nm光密度读取使用四甲基联苯胺(TMB)底物的显色。将一式两份读数平均。使用GLP-1抗体作为阳性对照，山羊<兔>(H+L)-过氧化物酶缀合物是用于检测的二级抗体。在给药前、第二次给药24小时后、第一次和第二次皮下给药168小时后收集时点血清样品(Point serum samples)以评价可能的免疫原性。通过与给药前血清样品和阳性对照的比较解释对G8E22-CEX-L-hIgG4的抗体效价的存在。代表性结果呈于表7。
表7
实施例6 禁食状态和分级静脉内葡萄糖注射期间单次皮下注射猕猴后的药物动力学研究1期(研究第一天)施用载体的皮下灌注。灌注载体后立即施用5、10、和25mg/kg/min的分级静脉内葡萄糖(20％右旋糖)灌注。2期(研究第三天)施用GLP-1融合蛋白质(0.1mg/kg)的皮下灌注。3期在GLP-1融合蛋白质灌注后约96小时进行分级静脉内葡萄糖灌注。
在16小时过夜禁食后经过镇静的猴中进行分级静脉内葡萄糖灌注步骤。对于两次静脉内葡萄糖灌注，将每10分钟共20分钟取基线样品以定义基线。在+20分钟以5mg/kg/min的速率启动升高的葡萄糖灌注，随后为10mg/kg/min和25mg/kg/min的灌注。各灌注速率监测20分钟时程。以10分钟间隔采集血液样品以测量葡萄糖、胰岛素和胰高血糖素。在葡萄糖灌注前-20、-10分钟、0分钟以及1和3期葡萄糖灌注后10、20、30、40、50和60分钟收集约1.0mL血液。
数据显示于表8。
表8
以载体和GLP-1融合蛋白质给药的猴子之间胰高血糖素水平无统计学差异。
实施例7 禁食状态和分级静脉内葡萄糖灌注期间三个不同剂量单次皮下注射大鼠后的药物动力学研究将长期置入导管的大鼠分配到载体对照(盐溶液)和三个治疗组之一(GLP-1融合蛋白质；0.0179mg/kg、0.179mg/kg、或1.79mg/kg)。通过皮下注射施用GLP-1融合蛋白质和载体。治疗二十四小时后，使过夜禁食(16h)的大鼠受到分级静脉内葡萄糖灌注测试。分级葡萄糖灌注测试由基线盐溶液灌注射期(20分钟)、随后的分别为5和15mg/kg/min的两个30分钟葡萄糖灌注期组成。在葡萄糖灌注前-20、-10分钟、0分钟(基线)以及10、20、30、40、50和60分钟收集血浆样品。
数据表示于表9中。
表9
*与载体相对P≤0.05实施例8 FGF-21融合蛋白质的药物代谢动力学分析通过静脉内(IV)和皮下(SC)途径以0.4mg/kg的剂量给CD-1小鼠施用FGF-21融合蛋白质。动物在给药后0-336小时之间的多个时间取血。从每一个样品中收集血浆并通过放射免疫测定法分析。使用模型依赖性(IV数据)和非依赖性(SC数据)方法(winNonlin Pro)计算药物动力学参数并在下面表10中报告。通过IV施用，FGF-21-Fc融合蛋白质与天然FGF-21的0.5小时的清除半寿期比较具有大约53.9小时的清除半寿期。通过SC施用，FGF-21-Fc融合蛋白质与天然FGF-21的0.6小时的清除半寿期比较具有大约24小时的清除半寿期。通过两种施用途径FGF-21-Fc融合蛋白质与天然FGF-21比较表现延长的作用时间。
表10
a观测到的最大血浆浓度b观测到最大血浆浓度的时间c从0到无穷大测量的血浆浓度-时间曲线下的面积d以时间为单位的清除半寿期e全身清除率作为生物利用率的函数f生物利用率百分比序列表<110>伊莱利利公司<120>融合蛋白<130>X-16821<150>60/477880<151>2003-06-12<150>60/570908<151>2004-05-13<160>8<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>230<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成构建体<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>1位的Xaa为Ala或不存在<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>16位的Xaa为Pro或Glu<220>
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<221>MISC_FEATURE<222>(230)..(230)<223>230位的Xaa为Lys或不存在<400>1
Xaa Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp20 25 30Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp35 40 45Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly50 55 60Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa65 70 75 80Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp85 90 95Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro100 105 110Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu115 120 125Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn130 135 140Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile145 150 155 160Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr165 170 175Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg180 185 190Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Ash Val Phe Ser Cys195 200 205Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu210 215 220Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
225 230<210>2<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成构建体<400>4Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly1 5 10 15Ser Gly Gly Gly Gly Ser20<210>5<211>825<212>DNA<213>人<400>5cacggcgagg gcaccttcac ctccgacgtg tcctcctatc tcgaggagca ggccgccaag 60gaattcatcg cctggctggt gaagggcggc ggcggtggtg gtggctccgg aggcggcggc120tctggtggcg gtggcagcgc tgagtccaaa tatggtcccc catgcccacc ctgcccagca180
cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc240atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc300gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg360cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag420gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc480atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg540cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc600ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gaaagcaatg ggcagccgga gaacaactac660aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc720gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct780ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggt825<210>6<211>30<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成构建体<400>8Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg1 5 10
权利要求
1.异源融合蛋白质，其包含与免疫球蛋白的Fc部分融合的活性治疗肽，所述免疫球蛋白的Fc部分包含SEQ ID NO1Xaa1-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaa80-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-S er-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-S er-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa230(SEQ ID NO1)的序列，其中1位的Xaa为Ala或不存在；16位的Xaa为Pro或Glu；17位的Xaa为Phe、Val、或Ala；18位的Xaa为Leu、Glu、或Ala；80位的Xaa为Asn或Ala；以及230位的Xaa为Lys或不存在。
2.权利要求1的异源融合蛋白质，其中活性治疗肽的C端氨基酸与Fc部分的N末端丙氨酸残基通过肽接头融合，其中所述的肽接头包含选自下面的序列a)Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)；b)Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO4)；c)Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO6)；d)Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys(SEQ ID NO7)；和e)Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg(SEQ ID NO8)。
3.多核苷酸，其编码权利要求1或2的异源融合蛋白质。
4.载体，其包含权利要求3的多核苷酸。
5.宿主细胞，其包含权利要求4的载体。
6.宿主细胞，其表达权利要求1或2的异源融合蛋白质。
7.权利要求6的宿主细胞，其中宿主细胞为CHO细胞。
8.权利要求6的宿主细胞，其中宿主细胞为NS0细胞。
9.产生异源融合蛋白质的方法，其包括在异源融合蛋白质以可检测的量表达的条件下转录和翻译权利要求3的多核苷酸的步骤。
10.治疗患者的方法，其包括施用权利要求1或2的异源融合蛋白质的治疗有效量。
11.权利要求10的方法，其中异源融合蛋白质每周施用一次。
12.权利要求1或2的异源融合蛋白质的用途，用作药物。
全文摘要
本发明提供了与特定IgG4－Fc衍生物融合的活性治疗肽。这些融合蛋白质具有增加的半寿期、降低的半抗体形成和降低的效应子活性，而无免疫原性。所述融合蛋白质可用于治疗人类疾病以及多种其他病症或疾病。
文档编号C12N15/62GK1802167SQ200480015957
公开日2006年7月12日 申请日期2004年6月10日 优先权日2003年6月12日
发明者W·格莱斯纳, R·L·小米利肯, Y·甸, S－H·R·奇昂, A·M·维克 申请人:伊莱利利公司