检测蛋白－蛋白相互作用的方法

专利名称：检测蛋白－蛋白相互作用的方法
技术领域：
本发明涉及用于确定目标分子之间相互作用的方法。更具体的，其涉及确定一种被称为检测化合物的特定物质能否调节两种或更多特异的目标蛋白的相互作用，其是通过确定一种在细胞中的报道基因的活性是否受调节或其缺失而导致活化或失活。利用转化的或转染的细胞进行确定，如同转化或转染他们所用的试剂一样其也是本发明的特征之一。
背景技术：
蛋白/蛋白相互作用的研究是很热门的领域，例如通过鉴别用于受体的配体。甚至当给定受体的一种配体或配体是已知的时候，仍有必要研究更有效或更具选择性的配体。GPCRs在这里将作为非穷举的被这样研究的蛋白的例子而进行讨论。
G-蛋白偶联受体，或者下文中的″GPCRs″，是已知的人类细胞表面受体最大的种类。在被GPCRs识别的配体之中有激素，神经递质，多肽，糖蛋白，脂质，核苷酸和离子。他们也作为光线，气味，外激素，和味道的受体。在这些各种各样的角色中，也许不会惊奇它们可以是紧张度研究的主体，以试图在鉴别各种条件下有用的药物。成功率是显著的。事实上，Howard等在Trends Pharmacol.Sci.，22132-140(2001)评价说有超过50％的商品化药物是这样的受体。这里所用的″GPCRs″，指的是任何GPCR受体超家族成员，其特征在于七个跨膜结构域(7TM)的构建子。这些受体的例子包括但不限于，种类A或者″视紫红质样″受体；种类B或者″分泌激素样″受体；种类C或者″代谢型谷氨酸样″受体；卷曲的和平滑的相关受体；粘附受体家族或者EGF-7TM/LNB-7TM受体；脂联素受体以及相关受体；和化学感觉受体包括味觉，嗅觉，鼻骨的和外激素受体。例如，在人类中
GPCR超家族包括但不限于那些由Vassilatis，等，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004903-4908(2003)公开的受体分子；Takeda，等，FEBS Letters，52097-101(2002)；Fredricksson等，Mol.Pharmacol.，631256-1272(2003)；Glusman等，Genome Res.，11685-702(2001)；以及Zozulya等，GenomeBiol.，20018.1-0018.12(2001)，所有这些在此引入作为参考。
GPCRs功能的作用机制已经在某种程度上得以阐明。简言之，当一种GPCR结合一种配体时，构型改变的结果，刺激一种级联反应导致细胞生理学的变化。据认为GPCRs通过调节细胞内，杂三聚体的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，或者″G蛋白″的活性来转换信号。配体和受体复合物刺激鸟嘌呤核苷酸变化并且将G蛋白杂三聚体分离成a和βγ亚基。
GTP结合的a亚基和βγ二聚体都能调节各种细胞的效应蛋白，包括腺苷酰环化酶和磷脂酶C(PLC)。在传统的细胞基础上的GPCRs检测中，受体活性通过测量一种G-蛋白调节效应通路的输出而被监控，例如由腺苷酰环化酶产生的cAMP的积累，或者由PLC活性刺激的细胞内钙的释放。
传统的G-蛋白基础上的信号传导检测受两个主要因素的影响很难向某些目标发展。
第一，不同的GPCRs与不同的G蛋白调控的信号传导通路相偶联，而且G-蛋白基础上的检测取决于认识目标受体的特异性G-蛋白，或要求细胞系统的操纵，以迫使目标受体偶联至特异的效应或通路。第二，所有的细胞表达大量的内源GPCRs，以及其他信号因子。结果，被检测的效应子通路可能是被除目标GPCR之外的其他内部分子所调节，可能导致假的结果。
在拮抗剂结合到GPCR的情况下，GPCR分子C末端丝氨酸和苏氨酸残基被磷酸化。这种磷酸化是由GPCR激酶或者″GRK″家族引起的。拮抗剂复合的C末端磷酸化GPCRs与抑制蛋白家族成员相互作用，其“捕获”受体信号。这种结合抑制受体与G蛋白的偶联，因而将受体定为内在化目标，伴随着降解和/或回收。因此，配体与GPCR的结合可以被说成是″调节″GPCR和抑制蛋白之间的相互作用，因为配体与GPCR的结合导致抑制蛋白与GPCR的结合，从而调节它的活性。至此以后，无论采用“调节″或任何形式，其仅仅指的是本发明的两种蛋白的相互作用在检测化合物存在时与该化合物不存在时这两种蛋白相或作用比较而得出的变化。例如，检测化合物的存在可能加强或提高两种蛋白的相互作用，能检测在某种方面，方式或形式减弱它，抑制它或减少它。
这种背景信息导致检测GPCRs活化和抑制的方法的改变。这些方法涉及监控与抑制蛋白的相互作用。该方法的主要优势在于不需要了解G-蛋白通路。
Oakley，等，Assay Drug Dev.Technol.，121-30(2002)和U.S.专利Nos.5,891,646和6,110,693，在此引入作为参考，公开了检测方法，其检测细胞质中激活细胞表面受体的荧光标记的抑制蛋白分子的再分布。这些方法为了检测抑制蛋白的再定位和受体活性而对细胞图像分析的依赖程度很高。对本领域人员而言，这是一个涉及复杂过程的复合物。
涉及这些问题的各种其他的U.S.专利及专利申请已被登记。例如Bohn等人的U.S.专利No.6,528,271涉及用于筛选疼痛控制药物的筛选，其中检测了β-抑制蛋白的抑制剂。出版的U.S.专利申请，例如2004/0002119，2003/0157553，2003/0143626，和2002/0132327，全都公开了不同的涉及GPCRs的检测形式。出版的申请2002/0106379公开了一种随后例子中所用的构型；然而，它并没有教导或建议这里公开的本发明。
本发明的目的之一是研发一种更为简单的检测，其监控和/或确定特异蛋白/蛋白相互作用的调节，其中蛋白包括但不限于，膜结合蛋白，例如受体，尤其是GPCRs。这是如何实现的将在随后的例子中得以体现。

发明内容
因此，根据本发明，提供了一种用于确定是否检测化合物调节特异目标蛋白/蛋白相互作用的方法，其包括使所述化合物与已经用以下物质转化或转染的细胞接触(a)核酸分子其包含，(i)编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位点的核苷酸序列，以及(iii)编码在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列，和(b)核酸分子其包含，(i)编码在要被检测的所述检测化合物存在的情况下与所述第一检测蛋白相互作用的第二检测蛋白的核苷酸序列，以及(ii)编码对于所述剪切位点特异的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列，并且确定所述报道基因的活性以确定是否所述化合物调节所述蛋白/蛋白的相互作用。
第一检测蛋白可以是膜结合蛋白，例如跨膜受体，特别是GPCR。具体的跨膜受体包括β2-肾上腺素受体(ADRB2)，精氨酸血管加压素受体2(AVPR2)，血清素受体1a(HTR1A)，m2毒蕈碱性乙酰胆碱受体(CHRM2)，趋化因子(C-C模序)受体5(CCR5)，多巴胺D2受体(DRD2)，卡巴阿片样物质受体(OPRK)，或者ala-肾上腺素受体(ADRA1A)，但是要理解的是在所有情况下本发明并不限于这些特异的实施例。例如，例诸胰岛素生长因子-1受体(IGF-1R)，其为酪氨酸激酶，以及不是一般的膜结合的蛋白比如雌激素受体1(ESR1)和雌激素受体2(ESR2)的分子。蛋白酶或者蛋白酶片段可以是核内包涵体A蛋白酶的烟草蚀纹病毒。激活所述报道基因的蛋白可以是转录因子，例如tTA或GAL4。第二蛋白可以是抑制性蛋白，例如抑制蛋白。细胞可以是真核或原核的。报道基因可以是外源基因，例如β-半乳糖苷酶或荧光素酶. 编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列可以被修饰以增强与第二检测蛋白的相互作用。这样的修饰包括但不限于采用编码相比原始序列与所述第二检测蛋白具有更高亲和性的氨基酸序列的核苷酸序列替换所述第一检测蛋白的C-末端区域的全部或部分核苷酸序列。例如，C-末端区域可以被编码AVPR2，AGTRLI，GRPR，F2RL1，CXCR2/IL-8b，CCR4或GRPR的C-末端区域的核苷酸序列替换。
该方法可以包含使多于一个的检测化合物与多个细胞样本接触，每个所述样本与一个或更多所述检测化合物相接触，其中每个所述细胞样本已经用前述核酸分子转化或转染，并且在所述多个所述样本中确定报道基因的活性从而确定是否任何所述的检测化合物调节特异的蛋白/蛋白相互作用。该方法可以包含使每种所述样本与一种检测化合物接触，每一种都与其他的不一样，或者包含使所述检测化合物的混合物与每种所述样本接触。
在另一实施方案中，提供了一种用于确定是否检测化合物调节一种或更多感兴趣的多种蛋白相互作用的方法，其包含使所述检测化合物与多个细胞样本接触，这些细胞中的每种已经采用如下物质转化或转染(a)第一核酸分子，其包含，(i)编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列，编码蛋白酶剪切位点的核苷酸序列，(ii)编码激活在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列，和(b)第二核酸分子，其包含，(i)编码在感兴趣的将被检测的所述检测化合物存在的情况下与所述第一检测蛋白相互作用的第二检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码对于所述剪切位点特异的蛋白酶或蛋白酶的核苷酸序列，其中所述第一检测蛋白与在所述多个样本的每个中的其他第一检测蛋白不同，并且在一个或更多所述多个样本中确定所述报道基因的活性作为调节感兴趣的一个或更多蛋白相互作用的调节测定(结果)。
第二检测蛋白在每种样本中可以相同也可以不同。所有所述的样本可以放置于(combine)普通的容器中，并且每种样本包含不同的第一和第二检测蛋白。或者是，每种样本可以在不同的容器中检测。在给定的样本中的报道基因可以与其它样本中的报道基因不同。检测化合物的混合物可以包含或存在于生物样本中，例如脑髓液，尿液，血液，血清，脓液，腹水，滑液，组织提取物，或分泌物。
在另一实施方案中，提供了采用核酸分子转化或转染的重组细胞，该核酸分子包含，(a)核酸分子，其包含(i)编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码蛋白酶或蛋白酶片段所识别的剪切位点的核苷酸序列，以及(iii)编码在所述细胞中活化报道基因的蛋白的核苷酸序列，以及(b)核酸分子，其包含，(i)编码在要检测的所述检测化合物存在的情况下与第一所述检测蛋白相互作用的第二检测蛋白的核苷酸序列，以及(ii)编码对于所述剪切位点特异性的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。
所述核酸分子中的一个或两者能够稳定整合到所述细胞的基因组中。细胞也可以已经被所述报道基因转化或转染。第一检测蛋白可以是膜结合蛋白，例如跨膜受体，特别是GPCR。特别是跨膜受体包括ADRB2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2，OPRK，或ADRA1A。
蛋白酶或蛋白酶片段可以是烟草蚀纹病毒核内包涵体A蛋白酶。激活所述报道基因的蛋白可以是转录因子，例如tTA或GAL4。第二蛋白可以是抑制蛋白。细胞可以是真核或原核。报道基因可以是外源基因，例如β-半乳糖苷酶或荧光素酶。编码所述第一检测蛋白核苷酸序列可以被修饰以增强与所述第二检测蛋白的相互作用，例如通过采用编码相比于原始序列与所述第二检测蛋白具有更高亲和性的氨基酸序列的核苷酸序列替换所述第一检测蛋白C-末端区域的全部或部分核苷酸序列。C-末端区域可以被编码AVPR2，AGTRLI，GRPR，F2RL1，CXCR2/IL-8B，CCR4或GRPR的C-末端区域的核苷酸序列替换。
在另一实施方案中，提供了分离的核酸分子，其包含，(i)编码检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码用于蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位点的核苷酸序列，以及(iii)编码在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列。检测蛋白可以是膜结合蛋白，例如跨膜受体。跨膜蛋白的一个具体例子是GPCR。具体的跨膜受体包括ADRB2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2，OPRK，或ADRA1A。
蛋白酶或蛋白酶片段可以是烟草蚀纹病毒核内包涵体A蛋白酶。激活所述报道基因的蛋白可以是转录因子，例如tTA或GAL4。如上所述，本发明不能被视为仅仅限于这些具体的实施方案。
在另一实施方案中，提供了包含分离的核酸分子的表达载体，其包含，(i)编码检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码用于蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位点的核苷酸序列，以及(iii)编码在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列，并且其进而可被连接至一个启动子上。
在另一实施方案中，提供了分离的核酸分子，其包含，(i)编码在要被检测的检测化合物存在的情况下与另一种检测蛋白相互作用的检测蛋白的核苷酸序列，以及(ii)编码对于所述剪切位点特异性的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。检测蛋白可以是抑制蛋白，例如抑制蛋白。
还提供了包含分离的核酸分子的表达载体，其包含，(i)编码在要被检测的检测化合物存在的情况下与另一种检测蛋白相互作用的检测蛋白的核苷酸序列，以及(ii)编码对于所述剪切位点特异性的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列，所述核酸进而可被连接至一个启动子。
另一实施方案包括由以下核酸分子表达的融合蛋白 分离的核酸分子，其包含，(i)编码检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码用于蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位点的核苷酸序列，以及(iii)编码在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列，并且其进而可被连接至一个启动子；或 分离的核酸分子，其包含，(i)编码在要被检测的检测化合物存在的情况下与另一种检测蛋白相互作用的检测蛋白的核苷酸序列，以及(ii)编码对于所述剪切位点特异性的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。
在另一实施方案中，提供了用于测定是否检测化合物调节感兴趣的蛋白/蛋白相互作用的试剂盒，其包含分离的各部分a)核酸分子，其包含编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列，(i)编码用于蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位点的核苷酸序列，(ii)编码在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列，以及(b)核酸分子，其包含，(i)编码在要被检测的检测化合物存在的情况下与另一种检测蛋白相互作用的检测蛋白的核苷酸序列，以及(ii)编码对于所述剪切位点特异性的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列，以及用于分别容纳每种(a)和(b)的容器装置。
第一检测蛋白可以是膜结合蛋白，例如跨膜受体。跨膜受体的具体类型可以是GPCR。具体的跨膜蛋白是GPCR。具体的跨膜受体包括ADRB2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2，OPRK，或ADRA1A。蛋白酶或蛋白酶的片段可以是烟草蚀纹病毒核内包涵体A蛋白酶。激活所述报道基因的蛋白可以是转录因子，例如tTA或GAL4。第二蛋白可以是抑制蛋白，例如抑制蛋白。试剂盒可进一步包含分离的编码报道基因的核酸分子的独立的部分。报道基因可以编码β-半乳糖苷酶或荧光素酶。编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列可以被修饰以增强与所述第二检测蛋白的相互作用，例如通过采用编码相比于原始序列与所述第二检测蛋白具有更高亲和性的氨基酸序列的核苷酸序列替换所述第一检测蛋白C-末端区域的全部或部分核苷酸序列。所述C-末端区域核苷酸序列可以被编码AVPR2，AGTRLI，GRPR，F2RL1，CXCR2/IL-8B，CCR4，或GRPR的C-末端区域的核苷酸序列替换。
要考虑到这里所描述的任何方法或组合物可以被这里所描述的任何其它方法或组合物实现。单词“a”在权利要求或说明书中与术语“包含”连用时意味着“一个”，但是它也意味着“一个或更多”，“至少一个”以及“一个或多于一种”。
本发明的这些和其他实施方案结合下文中的说明书和相应的附图将被更好的领会。应该被理解的是，以下的说明书揭示了各种本发明的实施方案和大量具体的细节，其是通过说明而并非限制的方式给出。许多取代，修饰，添加和/或重排可以在不脱离本发明精神的情况下在本发明的范围内作出，因此本发明包括所有这样的替代，修饰，添加和/或重排。


以下的附图形成了本说明书的一部分并且被包括以进一步展示本发明的特定方面。通过这些附图中的一个或更多与具体实施方案的详细说明相结合可以更好的理解本发明。
图I以图画的形式显示了本发明的概念基础，采用配体-受体结合作为一个例子。
图2a和2b显示了在根据本发明的检测中目标对激活剂和拮抗剂剂量依赖的应答。
图3显示了不同的目标和不同激活剂的剂量应答曲线。
图4描述了根据本发明采用D2多巴胺受体获得的结果。
图5a和5b示例了检测结果，该检测显示可以同时研究两种分子。
图6表明另一“多个”检测的结果，即，在其中有两种分子被同时研究。
图8代表从根据本发明的检测中获得的数据，被设计成检测人I型干扰素受体的活性。
图9详细说明图7中的结果，显示被用于产生图7的细胞中的IFN-a剂量应答曲线。
图10显示补充试验的结果，其中采用不同的转录因子和不同的细胞系。
具体实施例方式本发明涉及方法，其用于确定是否感兴趣的物质调节第一检测蛋白，例如膜结合蛋白，象受体，例如跨膜受体，与第二检测蛋白，象抑制蛋白家族的成员之间的相互作用。该方法涉及用两个构建子共转化或共转染真核或原核细胞。第一构建子包括，一段序列，其编码(i)第一检测蛋白，例如跨膜受体，(ii)蛋白酶识别的剪切位点，以及(iii)编码激活报道基因的蛋白的序列。第二构建子包括，(i)编码与第一检测蛋白相互作用的被检测和/或被确定的第二检测蛋白的一段序列，以及(ii)编码充分作用于是第一构建子一部分的剪切位点的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。在特别优选的实施方案中，这些构建子被稳定整合入细胞中。
在图1中以图表示了本发明实施方案的特点。简言之，首先，采用标准技术将编码转录因子的DNA融合到编码第一检测蛋白的DNA中，例如要研究的跨膜受体分子。这种融合的实现包括在实验中采用不能被宿主细胞内源表达的蛋白酶识别和裂解位点。
编码这种第一融合蛋白的DNA被导入并且在依赖于被融合到第一检测蛋白(例如受体)的转录因子的启动子元件的控制下，被还包含报道基因序列的细胞表达。如果外源蛋白酶不存在，转录因子仍然维系在第一检测蛋白上并且不能进入核以刺激报道基因的表达。
重组技术也可以被用于生产第二融合。在所述的实施方案中，编码抑制蛋白家族成员的DNA被融合到编码外源蛋白酶的DNA分子上，结果在第二融合蛋白中包含第二检测蛋白，即抑制蛋白家族成员。
然后进行检测，其中第二融合蛋白与第一融合蛋白一起被表达，并且检测化合物与细胞接触，优选特异的时间长度。如果检测化合物调节两种检测蛋白的相互作用，例如通过刺激，提高或增强第一和第二检测蛋白的联系，这会导致转录因子的释放，其转而移动到核中，并且诱导报道基因的表达。报道基因的活性被检测。
在可替代的系统中，两种检测蛋白可以在缺乏检测化合物的情况下相互作用，并且检测化合物可以导致两种检测蛋白解离，减弱或抑制其相互作用。在这样的情况下，在检测化合物存在时自由的有功能的活性转录因子的水平会降低，导致蛋白水解的下降，并且可检测到报道基因活性的降低。
在所述的实施方案中，为第二检测蛋白的抑制蛋白，在激活剂存在的情况下结合至受体；然而，要理解的是由于受体仅是类型的蛋白，检测不依赖于受体分子的使用，也不取决于仅仅结合能被涉及的相互作用结合的激活剂。虽然明显感兴趣的跨膜蛋白，但是任何蛋白都将是可行的。而且，结合到受体的激活剂不是能被检测的结合的唯一类型。人们可以确定激活剂，以及确定根据本发明的不同拮抗剂和/或激活剂的相对强度。
本发明的其他细节包括制造和使用其中主要物质的具体方法和技术，将在下文中描述。
I.表达构建子和转化 术语″载体″被用来指载体核酸分子，在其中能够插入核苷酸序列以便将其导入能被复制的细胞。核苷酸序列可以是“外源”的，即意味着其对于载体被导入的细胞来说是外来的或与细胞中的序列同源的但是在宿主细胞核酸的位置通常并没有发现该序列。载体包括质粒，粘粒，病毒(噬菌体，动物病毒和植物病毒)，以及人工染色体(例如YACs)。本领域技术人员完全能够通过标准的重组技术构建载体(例如，参见Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor，1990)以及Ausubel，等，1994，Current Protocols InMolecular Biology(John Wiley & Sons，1996)，两者都引入作为参考)。
术语″表达载体″指的是任何类型的遗传构建子，其包含编码能够翻译的RNA的核酸。在某些情况下，RNA分子随后被翻译成蛋白，多肽或肽。在其他情况下，这些序列不被翻译，例如，反义分子或核酶的产物。表达载体可以包含多个“控制序列”，其指的是在特定的宿主细胞中可操作的连接编码序列转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了管理转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可以包含行使其它功能的核酸序列并在下文中描述。
在特定实施方案中，质粒载体被设计用于克隆和基因传递。一般地，包含取自能与宿主细胞相容物种中的复制子和控制序列的质粒载体被用于与这些宿主结合。载体通常携带了一个复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。在一个非限制性的例子中，E.Coli经常采用pBR322的衍生物转化，其为源自E.coli物种的质粒。pBR322含氨苄青霉素和四环素抗性的基因并且因而提供了识别转化细胞的简易方法。pBR质粒，或其他微生物质粒或噬菌体必须还要包含，或被修饰以包含，例如，能被微生物有机体利用以表达其自身蛋白的启动子。
此外，包含能与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可被用作转化载体与这些宿主结合。例如，噬菌体λGEMTM-11可用于制造重组噬菌体载体，其能被用于转化宿主细胞，例如，E.coli LE392。
细菌宿主细胞，例如，包含表达载体的E.coli，生长在任何合适的培养基，例如，LB。在特定载体中的重组蛋白的表达可以通过使宿主细胞与特定启动子特异的试剂相接触，例如通过转换到培养基中添加IPTG或通过在更高温度中间断而被诱导，这是本领域人员可以理解的。在培养菌株更长一段时间后，一般为2至24小时，通过离心收集细胞并清洗以去除残余的培养基。
表达系统的其他例子包括STRATAGENE的COMPLETECONTROLTM可诱导的哺乳动物表达系统，其包含合成蜕皮激素-可诱导的受体，或者它的pET表达系统，E.coli表达系统。另一种可诱导的表达系统的例子是来自INVITROGENO，其携带T-REXTM(四环素调节的表达)系统，采用全长CMV启动子的可诱导哺乳动物表达系统。INVROGEN还提供酵母表达系统名称为Pichia methanolica表达系统，其被设计成在嗜甲醇酵母Pichia methanolica中高表达生产重组蛋白。本领域技术人员知道如何表达载体，例如表达构建子，以生产核酸序列或其同源的多肽，蛋白，或肽。
调节信号 构建子可以包含附加的5′和/或3′元件，例如启动子，poly A序列等等。元件可以源自宿主细胞，即与宿主同源，或者它们可以源自不同的来源即异源的。
″启动子″是一段核酸序列的控制序列，其控制转录起始和速度。它可包含调节蛋白的分子可以结合的遗传元件，例如RNA聚合酶和其它转录因子，以起始核酸序列的特异转录。术语“可操作地位于”，“可操作地连接”，“控制下”和“转录控制下”意味着启动子相对于核酸序列是处于正确的功能位置和/或方向，从而控制该序列的转录起始和/或表达。
启动子一般包含位于RNA合成起始位点的序列。这种情况的最佳例子是TATA盒，但是在某些缺乏TATA盒的启动子中，例如，哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40后期基因的启动子，覆盖起始位点分离元件，以帮助固定起始位置。附加的启动子元件调节转录起始的频率。典型地，这些元件位于起始位点上游的30-110碱基区域，虽然许多启动子已被显示包含位于起始位点下游的功能元件。为了携带在启动子“控制下”的编码序列，将转录阅读框架的转录起始位点的5‘端定位于所选择启动子的“下游”(即3’端)。“上游”启动子刺激DNA的转录和所编码RNA的表达。
启动子元件之间的间隔通常是可变的，因此当元件被颠倒或彼此移动时启动子的功能被保持。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔在活性开始下降之前可以提高到50碱基。取决于启动子，表现出单个元件能够协同或单独激活转录。启动子可以或不可以与“增强子”结合，增强子指的是涉及核酸序列转录活性的顺式作用调节序列。
一个启动子可以是一个天然与核酸分子结合的，也可以是通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5’非编码序列。这样的一个启动子可以被称为“内源”的。相似地，一个增强子可以是一个天然与核酸分子结合的，位于该序列的上游或下游。可替换地，通过将编码核酸片段定位在重组或异源启动子的控制之下可获得一定的优势，其指的启动子是指在其正常的天然环境中没有与核酸结合。重组或异源的增强子也指的是正常的在其天然环境中没有与核酸结合的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，以及从其他病毒，原核或真核细胞分离的启动子或增强子，和非“天然产生的”启动子或增强子，即包含不同转录调节区域和/或改变表达的突变的不同元件。例如，最常用于重组DNA构建子中的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)，乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了产生合成的启动子和增强子核酸序列之外，序列可以采用重组克隆和/或核酸扩增技术产生，包括PCRTM，结合这里公开的组合物(参见U.S.专利Nos.4,683,202和5,928,906，在此引入作为参考)。而且，设计成在非核细胞器官例如线粒体，叶绿体，及其类似物中直接转录和/或表达序列的控制序列也可以被采用。
天然地，采用一个能在选择用于表达的细胞器官，细胞类型，组织，器官，或有机体中有效直接表达DNA片段的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员一般都知道采用启动子，增强子，和重组细胞类型用于蛋白表达，(参见，例如Sambrook，等，1989，在此引入作为参考)。所采用的启动子可以是组成性的，组织特异的，可诱导的，和/或在适宜条件下能够高表达被导入的DNA片段，这样在重组蛋白和/或肽的大规模生产中有优势。启动子可以是异源的或内源的。
此外，任何启动子/增强子组合(根据，例如，真核启动子数据基础库EPDB，www.epd.isb-sib.ch/)也可用于操纵表达。利用T3，T7或SP6细胞质表达系统是另一种可行的实施方案。如果提供了合适的细菌聚合酶，真核细胞可以支持从特定细菌启动子所进行细胞质的转录，作为释放复合物的一部分或作为附加的遗传表达构建子。
对于编码序列有效地翻译也可以要求一个特异的起始信号。这些信号包括ATG启动密码子或邻近序列。包括外源翻译控制信号ATG启动密码子，可能需要被提供。本领域的人员将很容易确定这一点并提供必需的信号。公知的是启动密码子必须“在框架内”处于预定的编码序列的框架中以确保整个插入子的翻译。外源翻译控制信号和启动密码子既可以是天然的也可以是合成的。表达的效率可以通过包含合适的转录增强子元件而被增强。
在本发明的特定实施方案中，内源核糖体进入位点(IRES)元件被用于产生多基因或多顺反子的信息。IRES元件能够绕过5′甲基化帽子依赖翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，Nature，334320-325(1988))。来自细小核糖核酸病毒家族的两个成员的IRES元件(脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒)已经被公开(上述的Pelletier和Sonenberg)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，Nature，35390-94(1991))1991)。IRES元件可以被连接至异源的开放阅读框架。多个开放阅读框架可以被一起转录，每个由一个IRES分离开，产生多顺反子信息。通过IRES元件的特性，每个开放阅读框架能靠近核糖体以便有效翻译。采用单个启动子/增强子转录单个信息就可以有效表达多个基因(参见U.S.专利Nos.5,925,565和5,935,819，每个在此引入作为参考)。
其它载体序列元件 载体可以包括多个克隆位点(MCS)，其为包含多个限制性酶位点的核酸区，其任何一个能被用于与标准的重组技术结合以消化载体(参见，例如，Carbonelli，等，FEMS Microbiol.Lett.，172(1)75-82(1999)，Levenson，等，Hum.Gene Ther.9(8)1233-1236(1998)，以及Cocea，Biotechniques，23(5)814-816(1997))，在此引入作为参考)“限制性酶消化”指的是用一种仅仅作用于核酸分子中特异位置的酶来催化核酸分子的剪切。许多这样的限制性酶可以从商品中获得。本领域技术人员普遍理解这样酶的利用。通常，一个载体采用限制性酶在MCS内剪切从而线性化或片断化以使外源序列被连接到载体。″连接″指的是在两个可以是或不是连续的核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。涉及限制性酶和连接反应的技术对于重组领域技术人员来说是公知的。
大多数转录的真核RNA分子要进行RNA剪接以从原始转录本中去除内含子。含有基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保用于蛋白表达的转录本的正确过程(参见，例如，Chandler等，1997，在此引入作为参考)。
本发明的载体或构建子一般包含至少一个终止信号。一个″终止信号″或″终止子″包含参与通过RNA聚合酶的RNA转录本特异终止的DNA序列。这样，在特定实施方案中设计了结束RNA转录本生产的终止信号。在体内一个终止子可能是必需的以达到理想的信号水平。
在真核系统中，终止子区域还可以包含允许新转录本位点特异剪切的特异DNA序列以便于暴露聚腺苷酸化位点。其指示一个特异的内源聚合酶一段大约200腺苷残基(polyA)的序列加至转录本的3′端。采用这种聚A尾巴修饰的RNA分子更加稳定并且被更有效地翻译。因此，在涉及真核的其他实施方案中，优选的是终止子包含一个用于RNA剪切的信号，更优选的是终止子信号提高了聚腺苷酸化的信息。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件可服务于增强信息水平并使从阅读框通读而进入其它序列最小化。
设计用于本发明的终止子包括任何这里描述的或本领域已知的转录本的终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列，例如牛生长激素终止子，病毒终止序列，例如SV40终止子。在特定实施方案中，终止信号可以是可转录的或可翻译序列的缺失，例如一个由于基因截断导致的不可转录或不可翻译的序列。
在表达中，特别是真核表达，其典型地包括一个聚腺苷酸化信号以有效促进转录本的正确聚腺苷酸化。聚腺苷酸化信号的特性不被认为是本发明成功操作的关键并可使用任何这样的序列。优选的实施方案包括SV40聚腺苷酸化信号或牛生长激素聚腺苷酸化信号，两者都是方便的，容易得到的，并且已知在各种目标细胞中都具有良好功能。聚腺苷酸化可以提高转录本的稳定性或促进细胞质运输。
为了在宿主细胞中增殖载体，可包括一个或更多复制位点(经常被称为″ori″)，其为复制被起始的特异核苷酸序列。可替代地，如果宿主细胞是酵母可采用一个自主复制序列(ARS)。
转化方法 用于本发明的合适的核酸递送方法被认为包括事实上任何这里所描述的或本领域公知的可将核酸分子(例如DNA)导入细胞中的方法。这样的方法包括，但不限于，直接分送DNA例如通过来自体内(ex vivo)的转染(Wilson等，Science，2441344-1346(1989)，(Nabel等，Science，2441342-1344(1989)，并通过注射(U.S.专利Nos.5,994,624，5,981,274，5,945,100，5,780,448，5,736,524，5,702,932，5,656,610，5,589,466和5,580,859每个都在此引入作为参考)，包括微注射(Harlan和Weintraub，J.Cell Biol.，101(3)1094-1099(1985)；U.S.专利No.5,789,215，在此引入作为参考)；通过电穿孔(U.S.专利No.5,384,253，在此引入作为参考；Tur-Kaspa等，Mol.Cell Biol.，6716-718(1986)；Potter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，817161-7165(1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，Virology，52456-467(1973)；Chen和Okayama，Mol.CellBiol.，7(8)2745-2752(1987)；Rippe等，Mol.CellBiol.，10689-695(1990)；通过采用DEAE-葡聚糖随后采用聚乙二醇(Gopal，Mol.Cell Biol.，51188-190(1985)；通过直接声波装载(Fechheimer，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(17)8463-8467(1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，Biochem.&Biophys.Acta.，721185-190(1982)；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，763348-3352(1979)；Nicolau，等，Meth.Enzym.，149157-176(1987)；Wong，等，基因，10879-894(1980)；Kaneda等，Science，243375-378(1989)；Kato等，J.Biol.Chem.，2663361-3364(1991)和受体介导的转染(Wu和Wu，J.Biol.Chem.，2624429-4432(1987)；Wu和Wu，1988)；通过PEG-介导的原生质体转化(Omirulleh，等，Plant Mol.Biol.，21(3)415-428(1987)；U.S.专利Nos.4,684,611和4,952,500，在此引入作为参考)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199(2)169-177(1985)，以及任何这样方法的结合。
II.检测系统的组成 对于这里所描述的方法，作为本发明特征的产品具有优选的实施方案。例如，在“三部分构建子”中，即包含编码检测蛋白，剪切位点，和活化剂蛋白的序列，检测蛋白优选膜结合蛋白，例如跨膜受体，例如，GPCR家族的成员。这些序列可以被修饰以便它们编码的蛋白的C末端具有与第二蛋白更好和更强的相互作用。修饰可以包括，例如，用编码AVPR2，AGTRLI，GRPR，F2PLI，CCR4，CXCR2/IL-8，CCR4，或GRPR的C末端编码区域置换例如GPCR检测蛋白编码序列的C-末端，，所有这些如前定义。
激活报道基因的蛋白可以是在核内作用的蛋白，就像转录因子(例如tTA，GAL4等)，或者它可以是产生级联反应的分子，导致通过另蛋白的细胞核内反应。本领域人员很熟悉这样的级联反应。
第二构建子，如上所述，包括编码与第一蛋白相互作用的蛋白的区域，导致一些可检测的现象。该蛋白可以是活化剂，抑制剂或，更多，通常地，第一蛋白的“调节剂”。抑制蛋白家族成员是优选的，特别是在第一蛋白是GPCR时，但是也可以采用其他蛋白编码序列，特别是在第一蛋白不是GPCR时。这些两部分构建子的第二部分编码蛋白酶，或蛋白酶的片段，其用于从由第一构建子编码的融合蛋白中去除活化分子。
然而，这些优选的实施方案如随后要讨论的补充实施方案一样并不是限制本发明。
宿主细胞 这里所用的术语“细胞”，“细胞系”和“细胞培养物”可以相互变化使用。所有这些术语也包括它们的后代，任何以及所有随后的传代。要理解的是后代可能因为计划或偶然的突变而不相同。宿主细胞一般已经被工程化以表达可筛选的或可选择的标记，其被随着第一检测蛋白，作为融合蛋白一部分的转录因子激活。
在表达异源的核酸序列的内容中，″宿主细胞″指的是能够复制载体和/或表达由载体所编码的异源基因的原核或真核细胞。当宿主细胞用核酸分子″转染″或″转化″时，它们被称为″重组″细胞或宿主细胞，例如，一种被外源核酸序列，例如载体所引入的细胞。因此，重组细胞是可以与不包含被引入重组核酸的天然发生细胞相区别的。
大量的细胞系和培养物可被用作宿主细胞，作为它们可以从American Type Culture Collection(ATCC)中获得，其为获得活培养物和遗传材料的机构(www.atcc.org)。本领域人员可以根据载体的主链和预期的结果来确定合适的宿主。例如质粒或粘粒，可以被引入原核宿主细胞用于复制许多载体。可得到用于载体复制和/或表达的细胞类型包括但不限于，细菌，例如E.coli(例如，E.coli菌株RR1，E.coli LE392，E.coli B，E.coli X 1776(ATCC No.31537)以及E.coliW3110(F-，lambda-，prototrophic，ATCC No.273325)，DH5α，JM109，和KC8，杆菌例如枯草芽孢杆菌；以及其它肠杆菌例如鼠伤寒沙门氏菌，粘质沙雷菌(Serratia rnarcescens)，各种假单胞杆菌属种类，以及各种商业可获得的细菌宿主例如SURECompetent细胞和SOLOPACKTMGold细胞(STRATAGENELa Jolla)。在特定实施方案中，细菌细胞例如E.coli LE392被特别设计作为噬菌体病毒的宿主细胞。
用于复制和/或表达载体的真核宿主细胞的例子包括，但不限于，HeLa，NIH3T3，Jurkat，293，COS，CHO，Saos，和PC12。来自各种细胞类型和有机体的宿主细胞是可获得的并且对本领域人员是已知的。相似的，病毒载体可被用于与真核或原核宿主细胞相结合，尤其是能够用于载体的复制或表达的细胞。
检测蛋白 本发明考虑任何两种相互作用是已知的或猜测的蛋白。蛋白将作为融合蛋白存在，第一检测蛋白融合到一个转录因子，而第二检测蛋白融合到识别位于第一检测蛋白的剪切位点的蛋白酶上，该位点的剪切导致转录因子释放。对于检测蛋白/融合子的唯一要求是(a)第一检测蛋白在剪切前不能定位于核，并且(b)在与第二检测蛋白融合以及第一检测蛋白与第二检测蛋白结合之后该蛋白酶都要维持活性。
对应于第一构建子，第一检测蛋白可以是，例如，天然膜结合蛋白，或者是通过标准的技术被工程化后成为膜结合的。第一检测蛋白可以是，例如，跨膜受体，例如任何的GPCRs，或感兴趣的任何跨膜受体，包括，但不限于，酪氨酸激酶受体，丝氨酸苏氨酸激酶受体，细胞因子受体等等。而且，公知的是蛋白片段，将以与第一检测蛋白全长同样的方式起作用，第一检测蛋白这样的活性片段通过这里定义的蛋白来囊括。
对于本领域技术人员来说显然的是，本发明可以用于检测任何蛋白的相互作用，并且不限于检测膜结合受体，比如GPCRs。例如，其它种类跨膜受体的活性，包括但不限于受体酪氨酸激酶(RTKs)，例如IGF11R，例如表皮生长因子受体(EGFR)，ErbB2/HER2/Neu或相关RTKs；丝氨酸/苏氨酸激酶受体，例如转化生长因子-beta(TGFβ)，活化素，或骨形态发生蛋白(BMP)受体；细胞因子受体，例如干扰素家族受体，白细胞介素、促红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF、肿瘤坏死因子(TNF)和瘦素leptin受体；以及其它受体，其不一定必须是膜结合的，例如雌激素受体1(ESR1)，和雌激素受体2(ESR2)。在每种情况中，该方法涉及用调控包含感兴趣的受体的嵌合蛋白表达的经修饰了的受体构建子转染细胞，该构建子添加了蛋白酶剪切位点以及编码转录因子的核酸分子。调控由感兴趣的蛋白融合至识别和裂解上面所述位点的蛋白酶组成的嵌合蛋白的表达的第二构建子对细胞进行共转染，。在RTKs的情况下，例如EGFR，这种相互作用的蛋白可以由班汉蛋白或其片段的SH2组成(Src同源结构域2)，例如磷脂酶C(PLC)或包含转化蛋白1(SHC1)的Src同源结构域2。在丝氨酸/苏氨酸激酶受体的情况下，例如TGFβ，活化素，BMP受体，这种相互作用蛋白可以是Smad蛋白或其片段。在细胞因子受体的情况下，例如干扰素-α/β或干扰素-γgamma受体，这种相互作用蛋白可以是信号转导子和转录活化子(STAT)蛋白，例如，但不限于，Statl，Stat2；Janus激酶(JAK)蛋白Jak1，Jak2或Tykk2或其片段。在每种情况中，转染细胞包含一个被融合至受体的转录因子所调节的报道基因。然后，检测通过用检测化合物处理转染细胞一定的时间并且在检测时期结束时检测报道基因的活性而得以进行。如果检测化合物激活感兴趣的受体，感兴趣的受体和相互作用蛋白之间的相互作用被刺激，导致蛋白酶位点的剪切和融合的转录因子的释放，其作为报道基因活性的提高转而可得到检测。
其它可能的蛋白对包括抗体-配体，酶-底物二聚蛋白，信号级联转导的成员，以及本领域公知的其他蛋白对。
报道基因 激活报道基因的蛋白可以是对基因具有影响的任何蛋白，其表达或缺乏会导致可检测的信号。典型的蛋白报道基因包括酶，例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)，β-葡糖醛酸酶(GUS)或β-半乳糖苷酶。也考虑荧光素和化学发光蛋白例如绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，蓝绿色荧光蛋白，荧光素酶，β内酰胺酶，以及碱性磷酸酶。
转录因子和阻抑蛋白 根据本发明，转录因子被用于激活在工程化宿主细胞中的报道基因的表达。转录因子典型的根据它们的DNA结合区域来分类，一般为(a)锌指，(b)螺旋-拐弯-螺旋，(c)亮氨酸拉链，(d)螺旋-圈-螺旋，或(e)高度可变基团。转录因子的活化结构域与转录装置的元件(RNA聚合酶)以及其它调节蛋白相互作用，因此影响DNA结合的效率。
Rel/核因子κB(NF-κB)和激活因子-1(AP-1)是最常被研究的转录因子家族。它们被鉴定为信号转导通路重要的成员，会导致病理结果，例如炎症和肿瘤发生。其它转录因子家族包括热休克/E2F家族，POU家族和ATF家族。具体的转录因子，例如tTA和GAL4，被考虑用在本发明中。
虽然转录因子是一类可以利用的分子，检测也可以被修饰以接受采用转录抑制分子，其中可检测信号是信号发生器的下调节，或甚至是细胞死亡。
蛋白酶和剪切位点 蛋白酶是特征为在特定位点剪切其他蛋白的酶。Ser/Thr蛋白酶家族，在丝氨酸和苏氨酸残基剪切。其它蛋白酶包括半胱氨酸或巯基蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，金属蛋白酶，氨基肽酶，双&三肽酶，羧基肽酶，以及肽基肽酶。这些物质的选择留给本领域技术人员并且特定的需要并不局限于在这里描述的这些分子。公知的是酶具有催化区域并且这些可以被用来替代全长的蛋白酶。这些也包括在本发明中。一个具体实施方案是烟草蚀纹病毒核内包涵体A蛋白酶，或其活性片段。也可以采用其他用于蛋白酶的特异剪切位点，这对于本领域人员是显而易见的。
检测蛋白的修饰 在此检测中，第一检测蛋白可以被修饰以增强与相互作用蛋白的结合。例如，已知的是特定的GPCRs在配体的刺激下能更稳定或更具亲和性地结合抑制蛋白并且这种增强的相互作用被独立的介导，例如，C-末端的丝氨酸和苏氨酸残基簇(Oakley等，J.Biol.Chem.，27432248-32257，1999和Oakley，等，J.Biol.Chem.，27619452-19460，2001)。采用这作为例子，清楚的是受体编码序列本身可以被修饰，以便提高膜结合蛋白的亲和性，例如受体与其结合的蛋白。这样修饰的例子是对膜结合蛋白C-末端区域的修饰，例如，受体，例如如上所描述的那些，其包括用相应的与结合蛋白具有更高亲和性但是不影响受体功能的另一种受体的区域替换其一部分。在前的例子16和20，显示了本发明这种特征的实施方案。
此外，第二检测蛋白可以被修饰以增强其与第一检测蛋白的相互作用。例如，检测可以掺入点突变的、截断的或其它变体的第二检测蛋白，例如，已知的与激活剂-偶联的GPCRs结合更稳定的或在磷酸化非依赖方式中的抑制蛋白(Kovoor，等，J.Biol.Chem.，2746831-6834，1999)。
III.检测方式 如上所述，本发明在一个实施方案中提供了一个直接的方法去检测当表达在一个相同的细胞中时两种蛋白的相互作用。一个第一构建子，如上所述，包含编码第一蛋白的序列，其连接至一个编码用于蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位点的序列，该序列本身连接在编码报道基因激活子的序列。采用″连接着″指的是所描述的序列被融合以产生单一的，完整的开放阅读框架，其可以被翻译成包含所有元件的单一多肽的序列。这些可以是，但不必须是，被可以编码或不编码附加蛋白或肽的附加核苷酸序列分离开。插入重组细胞中的第二构建子也在上文中被描述了，即它既包含编码第二蛋白的序列也包含编码蛋白酶或蛋白酶片段的序列。总而言之，这些元件在与能够影响所寻找的目标蛋白相互作用的待选试剂结合时构成了基本的检测方式。
然而，本发明也用于检测多于膜结合蛋白，例如受体，同时采用不同的报道基因，每被一个蛋白激活，例如这里所描述的蛋白种类。例如，这可以通过采用不同的受体构建子和不同的报道基因转染细胞的混合而实现，或者通过将不同的转录因子融合至每个检测受体，并且采用检测化合物检测每个报道基因的活性。例如，它可以是确定是否感兴趣的分子激活第一受体并还可以确定作为与第二受体相互作用的结果的副效应是否是预期的。在这样的情况中，例如，采用编码第一受体和第一报道子的第一细胞系，例如lacZ，以及编码第二受体和第二报道子的第二细胞系，例如GFP。这样系统的优选实施方案见于实施例17和18。人们可以混合这两种细胞系，加入感兴趣的化合物，并寻找对一个具有正效应而对另一个没有效应的物质。
要知道的是本发明既涉及检查的是相互作用检测蛋白的单一对的方法，但是更为优选的是，其也可以指的是这里的采用“多个”检测的方法。这样的检测可以各种方法进行，但是在所有的情况下，多于一对的检测蛋白被同时检测。这可以被实现，例如，通过提供多于一个细胞样本，每种都已经被转化或转染，以检测每种的蛋白相互作用对。不同的转化细胞可以在一个容器中结合并被同时检测，或者将每种不同类型的转化置于不同的孔中，然后检测。
这里所描述的用于多个检测的细胞可以是，但不必须是相同的。类似地，在每种样本中所采用的报道子系统可以是，但不必须是相同的。在样本或多个样本被置入容器中后，例如微量检测板的孔中，抗(against)容器中所产生的多个蛋白相互作用一种或多种化合物可以被筛选。
构建子所表达的融合蛋白也是本发明的一个特征。对于本领域人员来说本发明的其它特征很清楚包括，能鉴别融合蛋白以及用于确定蛋白存在的检测基础上的各种蛋白的抗体，以及杂交检测，例如基于PCR(确定基因的表达)的检测。
III.试剂盒
这里所描述的任何组合物都将包含在试剂盒中。这样，试剂盒将包含处于合适包装方式的本发明的载体或细胞，以及根据本发明所采用的任何附加试剂。
试剂盒可以包含合适的整数倍的本发明的组合物。试剂盒的成分可以为液体的或冻干的形式包装起来。试剂盒的包装中一般包括至少一个玻璃瓶，试管，培养瓶，瓶子，注射器或其他容器方式，在其中可放置成分，并且优选地，合适的整数倍。在试剂盒中有多于一种成分时，试剂盒也一般会包含第二，第三或其他附加容器，使得附加成分可以单独放置。然而，各种成分的结合物可以放置在一个瓶子中。本发明的试剂盒还典型的包含用于容纳试剂容器的装置，以便用于商品销售。这样的容器可以包括注射或吹模塑料容器以便放置预定的瓶子。
当试剂盒的成分是以一种和/或更多液体溶液提供时，液体溶液是一种水溶液，特别优选无菌水溶液。然而，试剂盒的成分可以以干的粉末提供。当试剂和/或成分以干的粉末提供时，粉末可以通过合适的溶剂而重构成。预想的是溶剂可以以另一种包装方式提供。
IV.实施例
描述本发明的特异实施方案将见于以下实施例中，但本发明不限于此。
实施例1
一个融合构建子采用编码人β2肾上腺素受体的DNA而产生，编码人β2肾上腺素受体的DNA根据标准术语在这里及以后被称为″ADRB2″。它的核苷酸序列可以在GenBank中找到，其登记号为NM_000024(SEQ ID NO1)。四环素控制的反式激活蛋白(transactivator)tTA，由Gossen等公开，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，875547-5551(1992)，引入作为参考及使用。一个编码烟草蚀纹病毒核内包涵体A蛋白酶识别和剪切位点的序列(由Parks等公开，Anal.Biochem.，216413-417(1994)，引入作为参考)，被插入在融合编码基因中的这些序列之间。CMV启动子区域被置于ADRB2编码区域的上游，而一个polyA序列被置于tTA区域的下游。
融合构建子通过缺乏内源BamHI和BglII限制位点的ADRB2的第一产生形式而被制备。而且，内部终止密码子被唯一的BamHI位点替换。
采用重叠PCR做到这一点。详细来说，编码区域的5′部分采用如下序列扩增gattgaagatctgccttcttgctggc(SEQ ID NO2)，以及gcagaacttggaagacctgc ggagtcc(SEQ ID NO3)，而编码区域的3′部分采用如下序列扩增ggactccgca ggtcttccaa gttctgc(SEQID NO4)，以及ttcggatcct agcagtgagt catttgt(SEQ ID NO5)。
PCR也可以用于修饰tTA的编码区域以便内源开始密码子被置换为TEV NIa-Pro剪切位点。该剪切位点，由七个氨基酸序列ENLYFQS(SEQ ID NO6)限定，是由Parks等教导的，Anal.Biochem.，216413-417(1994)，引入作为参考。第七个氨基酸已知是作为PI′位置，并且将它与其它氨基酸已知减小TEV NIa-Pro剪切效率的。见于Kapust等，Biochem.Biophys.Res.Commun..294949-955(2002)。
产生了第七氨基酸变成Tyr和Leu的变体。这些导致与天然的高效率位点相比，中等的和低效率的剪切位点。
在两个步骤中将编码天然高效率位点的DNA序列加入tTA编码区域。简言之，通过以下序列进行PCR而使BamHI和XbaI限制位点被加入到tTA编码区域5′端而Xhol限制位点被加入到tTA区域3′端，ccggatcctc tagattagat aaaagtaaag tg(SEQ ID NO7)，以及gactcgagct agcagtatcctcgcgccccc taccc(SEQ ID NO8)，通过将具有如下序列gagaacctgt acttccag(SEQ ID NO9)的寡核苷酸连接在5′端，而在BamHI和XbaI位点之间加入TEV NIa-Pro剪切位点。
进行修饰以编码中等的和低效率剪切位点的DNA序列的PCR采用如下序列ggatccgaga acctgtacttccagtacaga tta(SEQ ID NO10)，以及ctcgagagatcctcgcgccc cctacccacc(SEQ ID NO11)，而用于ENLYFQY(SEQID NO12)，以及
ggatccgagaacctgtactt ccagctaaga tta(SEQ ID NO13)，以及ctcgagagatcctcgcgccc cctacccacc(SEQ ID NO11)而用于ENLYFQL(SEQ ID NO14)。
这些PCR步骤还包括将一个BamHI限制位点引入编码每个剪切位点的序列中5′端，以及一个XhoI限制位点至tTA终止密码子的3′端。
这样修饰的ADRB2编码区域采用在编码区域中的核苷酸位置260使用PstI以及BamHI消化。这个3′片段与具有TEV NIa-Pro剪切位点修饰的tTA的三个变体连接，其已被BamHI和Xhol消化，并且最终复合物被克隆进BlueScriptII，其已被PstI和Xhol消化。
再次通过PCR将NotI限制位点引至ADRB2编码区域的开始密码子中的5′端，其采用gcggccgcca ccatgaacggtaccgaaggc cca(SEQ ID NO15)，以及ctggtgggtggcccggtacc a(SEQ ID NO16)。
通过NotI和PstI消化分离修饰的ADRB2编码区域5′片段并且连接至在之前已经被消化的ADRB2-TEV-NIa-Pro-剪切位点tTA融合蛋白的3′片段的每个构建子之中，以产生三个编码融合蛋白的全长构建子。
每个被NotI和XhoI消化的构建子，随后被插入到用NotI和Xhol消化的商业可得的表达载体pcDNA 3中。
实施例2
第二构建子也可以被制造，通过将这里及以后被称为″β抑制蛋白2或ARRB2″(GenBank，NM_004313)(SEQ ID NO17)的编码序列，被连接至TEV蛋白中的TEV NIa蛋白酶的催化结构域(即成熟NIa蛋白酶的氨基酸189-424，残基2040-2279)。为了做到这一点，编码ARRB2的DNA序列被修饰，以便在其5′端加入一个BamHI限制位点。而且，该序列被修饰以一个BamHI位点替换内源终止密码子。寡核苷酸caggatcctctggaatgggggagaaacccg ggacc(SEQ ID NO18)，以及ggatccgcagagttgatcat catagtcgtc(SEQID NO19)被采用。PCR结果的产品被克隆进商业可得的载体pGEM-T EASY(Promega)。pGEM-TEASY载体的多克隆位点包括一个在ARRB2开始密码子5′的EcoRI位点。
TEV NIa-Pro编码区域随后被修饰以用BglII位点替换内源开始密码子，并且在3′端插入编码流行性感冒血凝素(hemagluttinin)表位YPYDVPDYA(SEQ ID NO20)的序列，根据Kolodziej等，Meth.Enzvmol.，194508-519(1991)，之后为一个终止密码子和NotI限制位点。这通过PCR实现，采用agatctagct tgtttaaggg accacgtg(SEQ ID NO21)，以及gcggccgctc aagcgtaatc tggaacatca tatgggtacg agtacaccaattcattcatg ag(SEQID NO22). 结果，修饰了的ARRB2编码区域被EcoRI和BamHI消化，而修饰了的TEV编码区域被BglII和NotI剪切。两个片段被连接至商业可得的采用EcoRI和NotI消化的pcDNA3表达载体。
实施例3
将编码ADRB2-TEV-NIa-Pro剪切位点-tTA和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合蛋白的质粒转染到HEK-293T细胞，并且进入为HEK-293T衍生物的″克隆41″，其具有稳定整合的在tTA依赖的启动子控制之下的β-半乳糖苷酶基因。大约5×104细胞被放置在24孔板的每个孔中，用带有10％胎牛血清的，2mM L-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，100μg/ml G4I8，和5μg/ml purimycin的DMEM培养基中培养。第二天细胞达到50％融合度，然后采用0.4μg质粒DNA，和2μl Fμgene(一种合适的包含脂质体和其他材料转染试剂)转染。混合物在100μl DMEM培养基中混合，并且在加入细胞之前在室温下孵育15分钟。转染细胞在通过加入已知的受体拮抗剂进行检测之前孵育8-20小时，然后在药物加入后孵育16-24小时。
实施例4
细胞中β-半乳糖苷酶活性水平首先通过用产色的底物染色细胞而检测，即“X-gal”，由MacGregor等，Somat.Cell Mol.Genet.，13253-265(1987)教导，引入作为参考。培养后，细胞采用带有钙和镁的D-PBS清洗两次，在4％多聚甲醛中固定5分钟，随后再用D-PBS(含钙和镁)清洗两次，每次10分钟。固定了的细胞用含有钙和镁、5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，2mM MgCl2，由储存在二甲基甲酰胺中的4％X-Gal中1∶40稀释而制备的0.1％X-Gal的D-PBS孵育。
室温下反应在黑暗中被孵育3-4小时至过夜。去除底物溶液，采用mowiol封固介质(mounting medium)(10％mowiol，0.1％1.4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷，24％甘油)将细胞封固在玻璃盖玻片下。
结果显示无论是单独采用ADRB2-TEV-NIa-Pro剪切位点-tTA质粒还是ARRB2-TEV-NIa蛋白酶质粒转染的细胞都不表达β-半乳糖苷酶。采用两种质粒转染的小部分细胞则表达β-半乳糖苷酶，可能是由于未刺激的ADRB2和ARRB2之间存在基底水平的相互作用。在采用10uM异丙基肾上腺素，或10uM肾上腺素(这两者均为ADRB2激活剂)处理细胞后，大约3-5倍更多的细胞表达报道基因。
当细胞采用ADRB2拮抗剂阿普洛尔(alprenolol)(10uM)预处理5分钟时，激活剂所引起的细胞中β-半乳糖苷酶表达的提高被阻断，而单独采用阿普洛尔处理不会引起明显的效果。
这些结果使人们可以将激活剂结合与GPCR刺激报道基因的转录活性相联系。
实施例5
为了更加精确的定量报道基因在细胞中的活性水平和使检测信号对背景最大化而进行了一系列的试验。这通过采用商业可得的针对β-半乳糖苷酶的化学发光检测进行报道基因诱导水平的检测而实现。克隆41细胞用前述的包含高，中或低效应的剪切位点的ADRB2-tTA融合构建子以及ARRB2-TEV-NIa蛋白酶表达质粒转染。转染之后20小时采用或不采用1uM异丙基肾上腺素处理细胞，并且在药物加入后的24小时后进行发光检测。简言之，细胞培养后，去除培养基，将50μl裂解缓冲液(100mM磷酸钾，pH7.8，0.2％TritonX-100)加入到每孔中。通过在室温下轻微搅拌5分钟而裂解细胞。收集裂解物并且通过商业可得的产品进行分析。
在所有情况下，采用激活剂处理会提高β-半乳糖苷酶活性水平。然而，在带有低效应剪切位点的未处理的细胞中报道基因活性的背景水平相对于中间和高的效应位点来说是最低的。而且，激活剂处理后，带有低效应剪切位点的细胞中报道基因的活性为4.8倍而相比于含有中等效应剪切位点的2.8倍的活性和含有高效应剪切位点的细胞的1.2倍的活性。这样，通过采用低效应蛋白酶剪切位点就获得了最高的信噪比。
实施例6
这些试验被设计以确定。激活剂刺激引起的报道基因表达的提高是依赖于被激活剂结合和激活的受体。
为了做到这一点，采用前述方式产生了ADRB2-tTA融合构建子的变体，其中不包括每个中在位置113从D到S的单个氨基酸变化的突变，其导致对激活剂异丙基肾上腺素亲和性的大量降低，参见Strader等，J.Biol.Chem.，2665-8(1991)。形成了带有不同剪切位点的三种受体-tTA融合构建子突变体。
在采用包含前述的D113S点突变的ADRB2-tTA融合构建子和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶表达质粒共转染的克隆41细胞中检测β-半乳糖苷酶活性的水平。活性检测如前述进行。结果显示激活剂异丙基肾上腺素不刺激报道基因在表达突变的ADRB2-tTA融合构建子的细胞中的表达。
实施例7
这些试验被设计以检查是否激活剂刺激的报道基因表达的提高是依赖于TEV NIa-Pro与ARRB2的融合。
为了做到这一点，检测在采用带有低效应剪切位点的ADRB2-tTA融合构建子和前述的ARRB2TEV-NIa蛋白酶表达质粒，或者和一个融合至磷脂酶C的SH2结构域的TEV-NIa蛋白酶对照共转染的克隆41细胞中检测β-半乳糖苷酶活性水平。活性检测如前述进行。结果表明激活剂刺激报道基因表达的提高仅仅在TEV蛋白酶被融合至ARRB2上被检测到而在融合至不相关的多肽时不能检测到。
实施例8
这些试验被设计以确定是否基因表达是由目标受体的激活剂选择性诱导的，或者其能被其他分子刺激。
ATP是G蛋白偶联受体P2Y1和P2Y2的激活剂，其被HEK-293T细胞内源表达。
采用前述的带有低效应剪切位点的ADRB2-tTA融合构建子和抑制蛋白TEV-NIa蛋白酶融合共转染的，并用异丙基肾上腺素、ATP或未处理的克隆41细胞进行试验。检测如前述进行。
结果显示报道基因活性的诱导是目标受体激活所特异的。另一种GPCR通路的刺激是不相关的。
实施例9
采用前述的带有低效应剪切位点的ADRB2-tTA融合构建子和ARRB2TEV-NIa蛋白酶融合共转染的克隆41细胞进行一系列试验，其采用数量变化的肾上腺受体激活剂之一的异丙基肾上腺素和肾上腺素处理。检测如前所述进行。图2a中所代表的结果显示报道基因表达对这两种配体刺激的剂量应答曲线。每个点代表从三个试验中获得的平均值。
一系列的试验如前述进行，在其中共转染的克隆41细胞采用各种浓度的肾上腺素受体拮抗剂阿普洛尔预处理15分钟，然后用1uM肾上腺素处理。在图2b中显示的结果说明这种拮抗剂的剂量抑制曲线。
实施例10
制造类似的系列构建子以建立对于偶联的G蛋白的精氨酸血管加压素受体2(AVPR2)检测。AVPR2编码区域(Genbank登记号NM_000054)(SEQ ID NO23)被修饰为在5’端放置EcoRI位点并且用BamHI位点替换终止密码子，采用如下引物进行PCRgaattcatgc tcatggcgtc caccac(SEQ ID NO24)以及ggatcccgat gaagtgtcct tggccag(SEQ ID NO25)。
修饰的AVPR2编码区域被连接至前述的已经被EcoRI和BamHI剪切的三种ADRB2-tTA构建子。这用AVPR2的编码序列替换了ADRB2的整个编码序列。
克隆41细胞被前述的包含低效应剪切位点的AVPR2-tTA融合构建子和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合蛋白共转染，并且采用各种浓度(1pM到2uM)的[Arg8]血管加压素(AVPR2激活剂)进行检测。在图3中代表的数据显示对这种激活剂的剂量应答曲线，采用3.3nM的EC50，与以前公开的数据一致(Oakley，R.等，Assay and DrμgDevelopment Technologies，121-30，(2002))。最大应答结果是诱导的报道基因表达大约是背景水平的40倍。
实施例11
一系列相似的构建子被制造以建立G蛋白偶联的血清素受体1a(HTR1A)的检测。HTR1A编码区域(Genbank登记号NM_000524)(SEQ ID NO26)被修饰为在5’端放置一个EcoRI位点而用一个BamHI位点替换终止密码子，采用如下引物进行PCRgaattcatggatgtgctcagccctgg(SEQ ID NO27)，以及ggatccctgg cggcagaact tacac(SEQ ID NO28). 修饰的HTR1A编码区被连接至前述的已被EcoRI和BamHI剪切的AVPR2-tTA构建子。这采用HTR1A的编码序列替换了整个AVPR2编码序列。最终构建子在这里即以后被称为“HTR1A-tTA”。
克隆41细胞被前述的包含低效应剪切位点的HTR1A-tTA融合构建子和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合构建子共转染，并采用10μM 8-氢氧基-DPAT HBr(OH-DPAT)，HTR1A激活剂，以及10uM血清素，HTR1A天然激活剂进行检测。检测如前述进行。对OH-DPAT最大应答结果是诱导的报道基因表达大约是背景水平的6.3倍，而血清素最大应答结果是诱导的报道基因表达大约是背景水平的4.6倍。
实施例12
相似的构建子被制造以建立G蛋白偶联的m2毒蕈碱性乙酰胆碱受体(CHRM2)的检测。CHRM2编码区域(Genbank登记号NM_000739)(SEQ ID NO29)被修饰为在5’端放置一个EcoRI位点并且采用一个BglII位点替换终止密码子，采用如下引物进行PCRgaattcatga ataactcaac aaactcc(SEQ ID NO30)以及agatctccttgtagcgccta tgttc(SEQ ID NO31)。
修饰的CHRM2编码区域被连接至前述AVPR2-tTA构建子，其已被EcoRI和BamHI剪切。这用CHRM2的编码序列替换了整个AVPR2编码序列。
克隆41细胞被前述的包含高效应剪切位点的CHRM2-tTA融合构建子和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合构建子共转染，其中ARRB2-蛋白酶融合构建子在单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)启动子的控制下表达，并采用10uM氨甲酰基胆碱Cl(卡巴胆碱carbochol)，CHRM2激活剂，如前述进行检测。卡巴胆碱最大应答结果是诱导的报道基因表达大约是背景水平的7.2倍。
实施例13
构建子也可被制造以建立G蛋白偶联趋化因子(C-C模序)受体5(CCR5)的检测。CCR5编码区域(Genbank登记号NM_000579)(SEQID NO32)被修饰以在5’端放置一个Not I位点并采用一个BamHI位点替换终止密码子，采用如下引物进行PCRgcggccgcat ggattatcaa gtgtcaagtc c(SEQ ID NO33)以及ggatccctggcggcagaact tacac(SEQ ID NO34)。
CCR5编码区域也被修饰以在5’端放置一个BsaI位点，其在被剪切时，留下与EcoRI剪切DNA相容的核苷酸突出端，采用如下引物ggtctccaattcatggatta tcaagtgtca agt(SEQ ID NO35)，以及gacgacagcc aggtacctat c(SEQ ID NO36)。
第一修饰的编码区域被ClaI和BamHI剪切而第二被Bsal和Clal剪切。这两个片段被连接至前述AVPR2-tTA构建子，其已被EcoRI和BamHI剪切。这用CCR5的编码序列替换了整个AVPR2编码序列。
含有低效应剪切位点的CCR5-tTA融合构建子被转染至″克隆34″细胞，其为前述HEK细胞系″克隆41″的衍生物，但是其包含一个在CMV启动子控制之下的稳定整合了的ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合基因。采用1μg/ml“调节正常T-细胞表达和分泌活性”(RANTES)的已知CCR5激活剂进行检测。对RANTES的最大应答如前述检测的结果为诱导大约40倍于背景的报道基因的表达。
实施例14
其次，一系列构建子被制造以建立G蛋白偶联的多巴胺2受体(DRD2)的检测。DRD2编码区域(Genbank登记号NM_000795)(SEQ ID NO37)被修饰以在5’端放置一个EcoRI位点并且用一个BglII位点替换整个终止密码子，采用如下引物进行PCRgaattcatgg atccactgaa tctgtcc(SEQ ID NO38)，以及agatctgcag tggaggatct tcagg(SEQ ID NO39). 修饰的DRD2编码区域被连接至前述用EcoRI和BamHI剪切的AVPR2-tTA构建子。这用DRD2的编码序列替换了整个AVPR2编码序列。
克隆41细胞被前述的包含中等效应剪切位点的DRD2-tTA融合构建子和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合构建子共转染，并且采用10uM多巴胺HCl(多巴胺)，一种DRD2激活剂进行检测。结果在前述的检测中被检测。对多巴胺的最大应答为诱导的报道基因表达是背景的2.7倍。
实施例15
这些试验被设计来证明采用结合激活剂-偶联的GPCRs的抑制蛋白变体的增强作用更稳定。首先，构建TEV NIa蛋白酶至(β-抑制蛋白-1(ARRB1)的融合构建子。ARRB1的编码区域(Genbank登记号NM_004041)(SEQ ID NO40)被修饰以在5’端放置一个Asp718位点并用一个BamHI位点替换终止密码子，采用如下引物进行PCRggtaccatgg gcgacaaagggacgcgagtg(SEQ ID NO41)，以及ggatcctctg ttgttgagctgtggagagcc tgtaccatcc tcctcttc(SEQ ID NO42)。
结果，修饰的ARRB1编码区域被Asp718和EcoRI以及EcoRI和BamHI剪切，而前述的修饰的TEV NIa-Pro编码区域被BglII和NotI剪切。所有这三个片段被连接至商业可得的pcDNA3表达载体，其已经被Asp718和NotI消化。
克隆41细胞被包含中等效应剪切位点的DRD2-tTA融合构建子和ARRB1-TEV-NIa蛋白酶融合构建子共转染，并且检测采用如前述的10μM多巴胺HCI(多巴胺)，一种D2受体的激活剂进行。对多巴胺的最大应答为诱导的报道基因表达是背景的2.1倍。
在氨基酸382后截断ARRB1已被报道会导致不依赖GRK-介导的磷酸化对激活剂结合的GPCRs亲和性增加，(Kovoor A.等，J.Biol.Chem.，274(11)6831-6834(1999))。为了在目前的检测中使用这样的“组成性活性的”抑制蛋白，β-抑制蛋白-1的编码区域被修饰以在5’端放置一个Asp718位点并在氨基酸382之后放置一个BamHI位点，采用如下序列以及前述的SEQID NO41进行PCRggatccattt gtgtcaagtt ctatgag(SEQ ID NO43)。
结果产生比全长的编码区域短36个氨基酸的ARRb1编码区域于。称为″ARRB1(Δ383)″的获得的修饰的ARRB1编码区域采用Asp718和EcoRI以及采用EcoRI和BamHI剪切，而前述的修饰的TEV NIa-Pro编码区域采用BglII和Notl剪切。所有这三种片段被连接至商业可得的采用Asp718和NotI消化pcDNA3表达载体。
克隆41细胞被包含中等效应剪切位点的DRD2-tTA融合构建子和ARRB1(Δ383)-TEV-NIa蛋白酶融合构建子共转染，并且采用10μM多巴胺HCl(多巴胺)，一种前述的DRD2受体激活剂进行检测。对多巴胺的最大应答是诱导的报道基因表达是背景的8.3倍。。
为了检查ARRB2编码区域类似的截断，ARRB2的编码区域被修饰以在5’端放置一个Asp718位点并且用一个BamHI位点替换3’端的81核苷酸，采用如下引物进行PCRggtaccatgggggagaaacc cgggacc(SEQ ID NO44)，以及ggatcctgtg gcatagttgg tatc(SEQID NO45)。
结果产生短于全长的编码区域27个氨基酸的ARRB2编码区。最终修饰的ARRB2编码区域采用Asp718和BamHI剪切，而前述修饰的TEV NIa-Pro编码区域采用BglII和Notl剪切。这两种片段被连接至商业可得的采用Asp718和NotI消化pcDNA3表达载体，。
克隆41细胞被包含中等效应剪切位点的DRD2-tTA融合构建子和ARRB2(Δ383)-TEV-NIa蛋白酶融合构建子共转染，并且采用10μM多巴胺HCl(多巴胺)，如前述的一种DRD2受体拮抗剂进行检测。对多巴胺的最大应答是诱导的报道基因为背景的2.1倍。
这些结果如图4所代表，证明DRD2多巴胺受体检测显示采用抑制蛋白变体ARRB1(Δ383)获得最高信噪比。
实施例16
进行一系列的试验已证明采用被设计成提高蛋白相互作用的受体修饰增强了检测。在这个实施例中，检测受体的C-末端区域被用来自AVPR2的相应尾巴区域替换，其为一种已知的具有高亲和性结合抑制蛋白的物质。在这些实施例中，在第七跨膜螺旋末端保存的NPXXY模序之后15-18个氨基酸融合连接，其典型的相对应于紧挨着受体C末端的公认的棕榈酰化位点之后。
首先，PCR被用来生产一个编码AVPR2C-末端29个氨基酸DNA片段，之后为低效应TEV剪切位点和tTA转录因子。该片段还被设计成前两个氨基酸(Ala，A和Arg，R)被BssHII限制位点GCGCGC编码。这通过扩增具用前述低效应剪切位点的AVPR2-tTA构建子而实现，引物如下tgtgcgcgcg gacgcacccc acccagcctg ggt(SEQ ID NO46)，以及ctcgagagat cctcgcgccc cctacccacc(SEQ ID NO11). 其次，DRD2的编码区域被修饰以在5’端放置一个EcoRI位点并将一个BssHII位点插入到编码区域中的最后氨基酸之后(Cys-443)。这采用如下引物进行PCRgaattcatgg atccactgaatctgtcc(SEQ ID NO47)，以及tgtgcgcgcg cagtggagga tcttcaggaa ggc(SEQ ID NO48)。
获得的修饰的D2编码区域采用EcoRI和BssHII剪切并且获得的AVPR2C-末端低效应剪切位点-tTA片段采用BssHII和BamHI剪切。这两个片段被连接至前述的用EcoRI和BamHI剪切的AVPR2-低效应剪切位点-tTA构建子。
克隆41细胞被包含低效应TEV剪切位点的DRD2-AVPR2尾巴-tTA融合构建子和前述的ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合构建子共转染，并且采用如前述的10μM多巴胺HCl(多巴胺)，一种DRD2受体激活剂，进行检测。对多巴胺的最大应答是诱导的报道基因为背景的60倍。
制造了一种构建子，其中通过在5’端插入一个Asp718位点和在Cys-341之后放置一个BssHII位点而修饰ADRB2受体。通过如下引物进行PCRgcggccgcca ccatgaacgg taccgaaggc cca(SEQ ID NO49)，以及tgtgcgcgcgcacagaagct cctggaaggc(SEQ ID NO50)。
修饰的ADRB2受体编码区域采用EcoRI和BssHII剪切而AVPR2C-末端尾巴低效应剪切位点-tTA片段采用BssHII和BamHI剪切。这两个片段被连接至前述的采用EcoRI和BamHI剪切的AVPR2-低效应剪切位点-tTA构建子，。获得构建子是″ADRB2-AVPR2尾巴-tTA.″(也参见出版的上述专利U.S.2002/0106379，特别是SEQ IDNO3)
克隆41细胞被包含低效应剪切位点的DRB2-AVPR2尾巴-tTA融合构建子和前述的ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合构建子共转染，并且采用如前述的10μM异丙肾上腺素，一种ADRB2受体激活剂进行检测。对异丙肾上腺素的最大应答是诱导的报道基因为背景的10倍。
制造了一种构建子，其中通过在Cys-345之后放置一个BssHII位点而修饰卡巴阿片样物质受体(OPRK；Genbank登记号NM_000912)(SEQID NO51)编码区域。通过如下引物进行PCRggtctacttg atgaattcct ggcc(SEQ ID NO52)，以及gcgcgcacag aagtcccgga aacaccg(SEQ ID NO53)
修饰的OPRK受体编码区域采用EcoRI和BssHII剪切而AVPR2C-末端尾巴低效应剪切位点-tTA片段采用BssHII和Xhol剪切。这两个片段被连接至包含克隆进入在Asp718(5′)和XhoI(3′)的pcDNA3.1+的修饰的OPRK受体序列的质粒中，其被EcoRI和Xhol剪切。
克隆41细胞被包含低效应剪切位点的OPRK-AVPR2尾-tTA融合构建子和前述的ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合构建子共转染，并且采用10μMU-69593，一种OPRK受体激活剂进行检测。对U-69593的最大应答是诱导的报道基因为背景的12倍。
实施例17
该试验被设计已证明利用该检测方法采用一种多重方式同时检测两种待测受体的活性。
克隆41细胞和″克隆1H10″细胞，其为包含受tTA依赖的启动子控制的荧光素酶基因稳定整合的HEK-293T细胞系，每个被置于24孔培养盘中并且分别用前述嵌合的ADRB2-AVPR2尾-tTA或DRD2-AVPR2尾-tTA融合构建子瞬时转染。采用每孔100μμl培养基，0.4μg DNA和2μl Fμgene试剂实现瞬时转染。孵育24小时之后，表达ADRB2-AVPR2尾-tTA的克隆41细胞和表达DRD2-AVPR2尾-tTA的克隆H10细胞被胰酶消化，等量混合，重置于96孔板的12孔中。三个孔不加药进行孵育或立刻用1μM异丙基肾上腺素，1μM多巴胺，或1μM两者的混合物处理。在配体加入之后的24小时对细胞报道基因的活性检测。培养基被废弃，细胞在40μμl裂解缓冲液中[100mM磷酸钾，pH 7.8，0.2％Triton X-100]中裂解而细胞裂解物采用商业可获得的发光检测试剂检测β-半乳糖苷酶和荧光素酶活性。
图5A和5B代表了结果。用异丙基肾上腺素处理的结果是β-半乳糖苷酶报道基因活性大约诱导了7倍，而荧光素酶活性维持不变。用多巴胺处理的结果是荧光素酶活性大约诱导了3.5倍，而β-半乳糖苷酶活性维持不变。用异丙基肾上腺素和多巴胺同时处理的结果是分别诱导了7倍的β半乳糖苷酶和3倍的荧光素酶活性。
实施例18
这个试验被设计证明采用一个多重方式利用该检测方法同时检测两种待测受体。
″克隆34.9″细胞，其为克隆41细胞的衍生物并且包含一个稳定整合的ARRB2-TEV NIa蛋白酶融合蛋白基因，采用前述的嵌合的OPRK-AVPR2尾巴-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA融合构建子瞬时转染。平行地，″克隆HTL 5B8.1″细胞，其为包含在tTA依赖的启动子控制下的荧光素酶基因稳定整合子的HEK-293T细胞系，采用前述的ADRB-AVPR2尾-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA融合构建子瞬时转染。在每种情况下，5×105细胞被置入6孔盘的每个孔中，并且在添加有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μg/ml G418和3μμg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基中培养24小时。细胞用100μl的DMEM，0.5μg的OPRK-AVPR2尾-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA DNA和2.5μlFμgene(″克隆34.9细胞″)或100μμl的DMEM，0.5μμlg的ADRB2-AVPR2尾-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTADNA，0.5μgμl的ARRB2-TEV NIa蛋白酶DNA和5μlFμgene(″克隆HTL5B8.1细胞″)瞬时转染。瞬时转染细胞被培养24小时，然后用胰酶消化，等量混合并重置于96孔板中。在采用10μM U-69593，10μM异丙基肾上腺素或10μM这两者的混合物处理之前细胞孵育24小时。每种试验条件检测16个孔。24小时之后，细胞被裂解并且采用前述的方法检测β-半乳糖苷酶和荧光素酶报道基因活性。结果见于图6。采用U-69593处理结果诱导了大约15倍的β-半乳糖苷酶报道基因活性，而荧光素酶活性维持不变。采用异丙基肾上腺素处理结果诱导了145倍的荧光素酶活性，而β-半乳糖苷酶活性维持不变。采用U-69593和异丙基肾上腺素结果分别诱导了9倍的β-半乳糖苷酶和136倍的荧光素酶活性。
实施例19
实施该试验以证明在本发明的检测中不同转录因子和启动子的使用。
制造一种融合构建子，包含编码AVPR2的DNA，融合进入编码包括前述的TEV Nla-Pro低效应剪切位点的氨基酸连接子GSENLYFQLR(SEQ ID NO54)的DNA序列的框架中，融合进入编码酵母GAL4蛋白(GenBank登记号P04386)(SEQ ID NO55)氨基酸2-147的DNA序列中，其后为一个连接子，即序列PELGSASAELTMVF (SEQ ID NO56)，其后为鼠核因子卡巴-B链p65蛋白(GenBank登记号A37932)(SEQ ID NO57)的氨基酸368-549。CMV启动子被放置于AVPR2编码区域的上游而一个polyA序列被放置于GAL4-NFkB区域的下游。这种构建子是重新设计的AVPR2-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-GAL4。
HμL 5C1.1是HEK-293T细胞的一种衍生物，其包含在一个商业可得的pFR-LUC的GAL4上游激活序列(UAS)控制之下稳定整合的荧光素酶报道基因。
这个AVPR2-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-GAL4质粒和前述的β-抑制蛋白2-TEV Nla蛋白酶共转染入HμL 5C1.1细胞。大约2.5×104细胞被放置在96孔板的每孔中，在10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μμg/ml G418以及3μμg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基中培养。第二天细胞生长至50％融合度融合度并且采用10μμl每孔的包含85μμl 的DMEM，0.1μμg的AVPR2-TEV-Nia-Pro剪切(Leu)-GAL4DNA，0.1μμg的ARRB2-TEVNla蛋白酶DNA，以及1μμl的Fμgene的混合物进行转染，这些物质在加入细胞之前在室温孵育15分钟。在采用10μM血管加压素处理之前培养细胞大约16小时。6小时之后，裂解细胞并且如前述进行荧光素酶活性检测。在这些条件下，血管加压素处理导致报道基因活性提高180倍。
实施例20
进行这一系列的试验以证明采用进一步的受体修饰可增强检测，该受体修饰被设计成提高与相互作用蛋白的亲和性。在这个实施例中，检测受体的C末端尾巴区域采用如下受体相应的尾巴区域替换apelin J受体-AGTRL1(登记号NM_005161)(SEQ ID NO58)，胃泌激素释放肽受体-GRPR(登记号NM_005314)(SEQ ID NO59)，蛋白酶活化受体2-F2RL1(登记号NM_005242)(SEQ ID NO60)，CCR4(登记号NM 005508)(SEQ ID NO61)，趋化因子(C-X-C模序)受体4-CXCR4(登记号NM 003467)(SEQ ID NO62)，以及白细胞介素8受体，β-CXCR2/IL8b(登记号NM_001557)(SEQ ID NO63)。
用第一PCR产生编码上述受体C-末端尾巴的DNA片段。这些片段是这样设计的，即前两个氨基酸(Ala，A和Arg，R)通过BssHII限制位点编码。
AGTRL1C-末端片段采用如下引物扩增tgtgcgcgcggccagagcag gtgcgca(SEQID NO64)，以及gaggatccgt caaccacaagggtctc(SEQ ID NO65)。
GRPR C-末端片段采用如下引物扩增tgtgcgcgcg gcctgatcatccggtct(SEQ ID NO66)，以及gaggatccgacataccgctc gtgaca(SEQ ID NO67)。
F2RL1C-末端片段采用如下引物扩增tgtgcgcgcagtgtccgcactgtaaagc(SEQ ID NO68)以及gaggatccataggaggtcttaacagt(SEQ ID NO69). CCR4C-末端片段采用如下引物扩增tgtgcgcgcggcctttttgtgctctgc(SEQIN N70)，以及gaggatccca gagcatcatg aagatc(SEQ ID NO71)。
CXCR2/IL8b C-末端片段采用如下引物扩增tgtgcgcgcggcttgatcagcaagggac(SEQ ID NO72)，以及gaggatccga gagtagtgga agtgtg(SEQ ID NO73)。
CXCR4C-末端片段采用如下引物扩增tgtgcgcgcgggtccagcct caagatc(SEQ ID NO74)，以及gaggatccgc tggagtgaaaacttga(SEQ ID NO75)。
获得的编码这些受体C-末端修饰的DNA片段采用BssHII和BamHI剪切并且片段被连接至OPRK受体编码区域框架，在前述的OPRK-AVPR2尾巴-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA表达构建子中替换AVPR2-C-末端片段。
前述的HTL 5B8.1细胞采用上面修饰的每个OPRK编码区域-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA构建子和前述的β-抑制蛋白2-TEVNIa蛋白酶融合构建子进行共转染。放置每孔大约2.5×104细胞在96孔板中，用10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μg/ml G418，和3μμg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基培养。第二天细胞生长至50％融合度融合度并且采用每孔10μl的如下混合物进行转染85μl的DMEM，0.25μμg的AVPR2-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-GAL4DNA，0.25μμg的ARRB2-TEV NIa蛋白酶DNA，以及2.5μμl的Fμgene(一种合适的包含脂质体和其他材料的转染试剂)，在加入细胞之前在室温下孵育15分钟。转染细胞在用10μM U-69593处理前孵育大约16小时。6小时之后，裂解细胞并如前述检测荧光素酶活性。在这些条件下，采用U-69593处理，结果导致对于每种修饰的OPRK受体下述的报道基因活性的提高OPRK-AGTRLI C-末端尾巴-30倍；OPRK-GRPRC-末端尾巴-312倍；OPRK-F2RL1 C-末端尾巴-69.5倍；OPRK-CCR4C-末端尾巴-3.5倍；OPRK-CXCR4C-末端尾巴-9.3倍；OPAK-IL8b C-末端尾巴-113倍。
实施例21
这个实验被设计以生产前述的稳定表达ARRB2-TEVNIa蛋白酶融合蛋白的细胞系。
制造了一种在EFlα启动子控制之下表达ARRB2-TEVNIa蛋白酶融合蛋白并且还在胸腺嘧啶核苷激酶(TK)启动子控制之下表达潮霉素抗性基因的质粒。
该质粒被转染进HTL 5B8.1，并且通过在100μμg/ml潮霉素存在下进行培养而选择出质粒稳定整合在基因组的克隆。抗性克隆被分离的和扩展并且通过前述的ADRB2-AVPR2尾巴-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA质粒转染而进行筛选。采用这一程序进行选择的三个细胞系，分别称为″HTLA 4C2.10″，″HTLA 2C11.6″和″HTLA 5D4″。大约每孔2.5×104细胞被植入到96孔板上，在带有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μμg/ml G418，3μμg/ml嘌呤霉素，和100μg/ml潮霉素的DMEM培养基中培养。第二天细胞生长至50％融合度融合度并且被每孔10μl的如下混合物转染85μμl的DMEM，0.25μμg的ADRB2-AVPR2-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-GALADNA和0.5μμl的Fμgene，其在加入细胞之前在室温孵育15分钟。在用10μM异丙基肾上腺素处理之前培养转染细胞大约16小时。6小时之后，细胞被裂解并如前述检测荧光素酶活性。在这些条件下，用异丙基肾上腺素处理导致这三个细胞系中分别有如下报道基因活性的提高112-倍(″HTLA 4C2.10″)，56-倍(″HTLA 2C11.6″)和180-倍(″HTLA 5D4″)。
实施例22
该实验被设计以生产稳定表达前述的ARRB2-TEV NIa蛋白酶和ADRB2-AVPR2尾巴-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA融合蛋白的细胞系。
包含潮霉素抗性基因的ARRB2-TEV NIa蛋白酶质粒与前述的ADRB2-AVPR2尾巴-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA融合蛋白质粒一起转染进HTL 5B8.1细胞并且通过在100μμg/ml潮霉素的存在下培养而选择包含质粒稳定整合到基因组的克隆。抗性克隆被分离并扩展，并通过采用10μM异丙基肾上腺素处理而被筛选并检测如前述诱导的报道基因活性。采用该程序选择的三个细胞系被称为″HTLAR1E4″，″HTLAR lC10″和″HTLAR 2G2″。用异丙基肾上腺素处理6小时结果导致分别在三种细胞系中如下报道基因活性的提高208-倍(″HTLAR 1E4″)，197-倍(″HTLAR lC10″)和390-倍(″HTLAR 2G2″)。
实施例23
该实验被设计以证明利用该检测方法检测受体酪氨酸激酶表皮生长因子受体(EGFR)的活性。
制造第一融合构建子，包含编码人EGFR的DNA，其可以在GenBank登记号NM 005228(SEQ ID NO76)中找到，融合进入编码前述四环素控制的反式激活蛋白(transactivator)tTA的氨基酸3-335的DNA序列的框架中。插入在这些序列之间的是一个编码包括前述TEV NIa-Pro，ENLYFQL(SEQ ID NO14)低效应剪切位点的氨基酸序列GGSGSENLYFQL(SEQID NO77)的DNA序列。CMV启动子被放置在表皮生长因子受体编码区域的上游，而polyA序列被放置在tTA区域的下游。这一构建子被称为EGFR-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA。
制造第二融合构建子，其包含编码两个人磷脂酶CGamma 1相应于氨基酸538-759(基因Bank登记号NP_002651.2)(SEQ ID NO78)的SH2结构域的DNA，其被融合进入一个编码前述成熟TEV NIa蛋白酶对应于氨基酸2040-2279(基因Bank登记号AAA47910)(SEQ ID NO79)的催化结构域的DNA序列的框架中。在这些序列之间插入的一个编码氨基酸NSSGGNSGS(SEQ ID NO80)的连接子DNA序列。CMV启动子被放置在PLC-Gamma SH2结构域编码序列的上游并且polyA序列被放置在TEV NIa蛋白酶序列的下游。这个构建子被称为PL CGammal-TEV。
EGFR-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA和PLC Gammal-TEV融合构建子被转染进入前述克隆HTL5B8.1细胞。大约2.5×104细胞被放置于96孔板的每孔中，在带有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μg/ml G418，和3μμg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基培养。第二天细胞生长至50％融合度融合度并采用每孔15μl如下混合物进行转染100μμl的DMEM，0.4μμg的pcDNA3DNA(″携带子″载体DNA)，0.04μμg的EGFR-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA DNA，0.04μμg的PLC Gammal-TEV DNA，以及2μμlFμgene(一种合适的包含脂质体和其他材料的转染试剂)，在加入细胞之前在室温下孵育15分钟。在采用特异的受体激活剂和抑制剂处理之前转染细胞被培养大约16小时。6小时之后，裂解细胞并如前述方法检测荧光素酶活性。结果见图7。
加入2.5ng/ml人表皮生长因子(对应于该配体的EC80)结果导致荧光素酶报道基因活性增加12.3倍，而加入100ng/ml人转化生长因子-Alpha结果导致增加18.3倍。在加入人表皮生长因子之前采用酪氨酸激酶抑制子(70μM AG-494；0.3μM AG-1478；2mMRG-130022)预处理阻断了报道基因活性的诱导。
实施例24
该实验被发计以证明采用该检测方法检测人I型干扰素受体的活性。
制造一种融合构建子，其包含编码人干扰素受体I(IFNAR1)(557氨基酸)的NA，可以在Genbank登记号NM_000629(SEQ ID NO81)中找到，被融合进入编码前述四环素控制的反式激活蛋白tTA的氨基酸3-335的DNA序列框架中。在这些序列之间插入的是一个编码包括前述TEV NIa-Pro，ENLYFQL(SEQ ID NO14)的低效应剪切位点的氨基酸序列GSENLYFQL(SEQ ID NO82)的DNA序列。CMV启动子被放置于人干扰素受体I(IFNAR1)编码区域的上游，而一个poly A序列被放置于tTA区域的下游。这个构建子被称为IFNAR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA。
制造一个第二融合构建子，采用编码人干扰素受体2的DNA，即剪接变体2(IFNAR2.2)(515个氨基酸)，其可以在Genbank登记号L41942(SEQ ID NO83)中找到，被融合进入一个编码前述对应于氨基酸2040-2279(GenBank登记号AAA47910)(SEQ ID NO84)的TEV NIa蛋白酶的催化结构域的DNA序列的框架中。在这些序列之间插入的是一个编码氨基酸序列RS(Arg-Ser)的DNA序列。CMV启动子区域被放置于人干扰素受体2(IFNAR2.2)编码区域的上游，而一个poly A序列被放置于TEV区域的下游。该构建子被称为IFNAR2.2-TEV。
构建了Genbank登记号为NM_007315(SEQ ID NO85)的人信号传导和转录激活因子1(STAT1)的基因和人转录本2(STAT2)信号转换和活化子见于Genbank登记号为NM_005419(SEQID NO86)的人信号传导和转录激活因子2(STAT2)的基因的表达构建子，其表达受CMV启动子区域控制。这些构建子分别被称为CMV-STAT1和CMV-STAT2。
IFNAR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA和IFNAR2.2-TEV融合构建子与CMV-STAT1和CMV-STAT2一起被瞬时转染进入前述HTL5B8.1细胞。大约2.5×104细胞被种植在96孔板的每孔中并在带有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，100μμg/mlG418，和5μμg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基中培养。孵育24小时之后，细胞采用每种15ng的IFNAR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA，IFNAR2.2-TEV，CMV-STAT1和CMV-STAT2DNA，或者采用60ng对照pcDNA质粒，与0.3μl Fμgene每孔进行转染。转染细胞在采用5000U/ml人干扰素α或5000U/ml人干扰素β处理之前孵育8-20小时。在加入干扰素时，吸出培养基并采用带有2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，3μμg/ml嘌呤霉素和500μμg/ml的G418的293SFM II培养基替换。在进行前述的荧光素酶报道基因活性检测之前干扰素-处理的细胞被培养18-20小时。结果见图8。采用5000U/ml IFNα处理结果导致报道基因活性提高15倍，而采用5000U/ml IFNβ处理导致10倍的提高。用干扰素处理采用对照质粒pcDNA3转染的HTL5B8.1细胞对报道基因活性没有影响。图9显示在采用前述的IFNAR1(ENLYFQ(L)-tTa，IFNAR2.2-TEV，STAT1和STAT2表达构建子转染的HTL5B8.1细胞中对于IFNa所产生的剂量应答曲线。
实施例25
该实验证明该检测方法采用不同的转录因子和不同的细胞系检测人I型干扰素受体的活性。
制造融合构建子，采用编码人干扰素受体I(IFNAR1)的DNA，融合进入一个编码前述GAL4-NF-KB融合子的DNA序列。在这些序列之间插入的是一个编码包括前述的TEV NIa-Pro，ENLYFQL(SEQ ID NO14)的低效应剪切位点的氨基酸序列GSENLYFQL(SEQID NO87)的DNA序列。CMV启动子被放置在人干扰素受体I(IFNAR1)编码区域的上游，而一个poly A序列被放置在GAL4-NE-κB区域的下游。该构建子被称为IFNAR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-GAL4-NF-κB。
CHO-K1细胞随后被采用如下5种质粒的混合物瞬时转染IFNAR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-GAL4-NF-κB，IFNAR2.2-TEV，CMV-STAT1，CMV-STAT2和GAL4依赖的启动子控制下的荧光素酶报道基因质粒pFR-Luc。在转染前大约每孔1.0×104细胞被种植在96孔板中，采用带有如下成分的DMEM培养基培养10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，100units/ml青霉素。细胞在第二天被转染，采用10ng报道基因质粒(pFR-Luc)，加上20ng前述的每种表达构建子，或者采用10ng报道基因质粒加上80ng对照pcDNA3质粒，以及每孔0.3μl Fμgene。在采用5000U/ml人干扰素-α处理之前培养转染细胞8-20小时。在加入干扰素之前，吸出培养基，用带有2mM L-谷氨酰胺，100units/ml青霉素的DMEM培养基替换。干扰素α处理的细胞在进行前述的荧光素酶报道基因活性检测之前培养6小时。结果见图10。采用报道基因，IFNAR和STAT构建子CHO-K1转染的细胞经IFN α处理结果导致报道基因活性提高3倍，而采用报道基因和对照质粒转染的转染细胞经干扰素处理对报道基因活性没有影响。
实施例26
设计本系列的试验以证明采用设计好的提高检测受体与相互作用蛋白之间亲和性的修饰增强检测。在这些例子中，在检测受体和GRPR(Genbank登记号NM 005314)(SEQ ID NO59)C-末端尾巴区域之间的融合连接在第七跨膜螺旋末端保存的NPXXY模序之后形成17-23个氨基酸。
首先，PCR被用来产生一个编码在假定的棕榈酰化位点之后的从GRPR开始2个氨基酸的C-末端42氨基酸的DNA片段(自此以后被称为GRPR 42aa)。该片段被设计魏C-末端尾巴的第一氨基酸之前为由XbaI限制位点TCTAGA所编码的两个氨基酸(Ser，S andArg，R)，而终止密码子被由BamHI限制位点GGATCC所编码的两个氨基酸(Gly，G and Ser，S)替换。这通过扩增包含GRPR编码区域的质粒而完成，采用的引物是tctagaggcctgatcatccggtctcac(SEQ ID NO88)，以及gaggatccgacataccgctcgtgaca(SEQ ID NO67)
接下来OPRK(Genbank登记号NM_000912)(SEQ IDNO51)的编码区域被修饰以在Pro-347之后插入Xbal位点。采用如下引物进行PCRggtctacttgatgaattcctggcc(SEQ ID NO52)，以及tctagatggaaaacagaagtcccggaaac(SEQ ID NO89)
此外，ADRA1A(Genbank登记号Nom_000680)(SEQIDNO90)的编码区域被修饰以在Lys-349之后插入Xbal位点。采用如下引物进行PCRctcggatatctaaacagctgcatcaa(SEQ ID NO91)，以及tctagactttctgcagagacactggattc(SEQ ID NO92) 此外，DRD2(Genbank登记号NM_000795)(SEQ IDNO37)的编码区域被修饰以在Cys-343之后插入两个氨基酸(Leu和Arg)以及XbaI位点。这采用如下引物进行PCRgaattcatggatccactgaatctgtcc(SEQ ID NO38)，以及tctagatcgaaggcagtggaggatcttcagg(SEQ ID NO93)
修饰的OPRK受体编码区域采用EcoRI和XbaI剪切而GRPR 42aa C-末端尾巴片段采用XbaI和BamHI剪切。两个片段被连接至包含具有前述的AVPR2C-末端尾巴-低效应剪切位点-tTA的OPRK受体的质粒中，其采用EcoRI和BamHI消化。
修饰的ADRA1A受体编码区域采用EcoRV和Xbal剪切而包含低效应剪切位点的OPRK-GRPR 42aa尾-tTA融合构建子采用XbaI和XhoI剪切。两个片段被连接至包含ADRA1A受体的质粒中，其被EcoRV和XhoI消化。
修饰的DRD2受体编码区域采用EcoRI和Xbal剪切而包含低效应剪切位点的OPRK-GRPR 42aa尾巴-tTA融合构建子采用XbaI和Xhol剪切。两个片段被连接至pcDNA6质粒，其被EcoRI和XhoI消化。
如前述的HTLA 2C11.6细胞，被包含低效应剪切位点的OPRK-GRPR 42aa尾巴-tTA融合构建子转染并且检测采用10μMU-69593，一种OPRK激活剂而进行。对U-69593的最大应答为报道基因活性提高大约200倍。
HTLA 2C11.6细胞采用包含低效应剪切位点的ADRA1A-GRPR 42aa尾巴-tTA融合构建子转染并且检测采用10μM肾上腺素，一种ADRAIA激活剂而进行。对肾上腺素最大应答为报道基因活性提高大约14倍。
HTLA 2C11.6细胞采用包含低效应剪切位点的DRD2-GRPR 42aa尾巴-tTA融合构建子转染并且检测采用10μM多巴胺，一种DRD2激活剂而进行。对多巴胺最大应答为报道基因活性提高大约30倍。
实施例27 本系列的试验本设计以证明采用设计好的提高检测受体与相互作用蛋白之间亲和性的修饰的不同检测受体进一步增强检测。在这些实施例中，检测受体的C-末端区域被GRPR内源的C-末端尾巴结构域的一个片断替换。
首先，PCR被用于生产一个编码截断的GRPR尾巴的DNA片段，特别是编码从Gly-343至Asn-365的23氨基酸的序列。片段被设计为C-末端尾巴的第一氨基酸之前为由XbaI限制位点TCTAGA所编码的两个氨基酸(Ser，S和Arg，R)，而Ser-366被由BamHI限制位点GGATCC所编码的两个氨基酸(Gly，G和Ser，S)替换。这通过扩增一个包含GRPR编码区域的质粒而完成，所用引物如下tctagaggcctgatcatccggtctcac(SEQ ID NO94)以及cggatccgttggtactcttgagg(SEQID NO95)。
接下来，截断的GRPR片段(自此以后被称为GRPR23aa尾巴)采用Xbal和BamHI剪切并插入到包含这里所述的低效应检测位点的OPRK-GRPR 42aa尾巴-tTA融合构建子中，其采用Xbal和BamHI消化。
同样地，GRPR 23aa尾巴片段采用Xbal和BamHI消化并且被插入到这里所述的包含低效应剪切位点的ARRA1A-GRPR42aa尾巴-tTA融合构建子中，其采用Xbal和BamHI消化。
HTLA 2C11.6细胞采用包含低效应剪切位点的OPRK-GRPR 23aa尾巴-tTA融合构建子转染并且检测采用10μMU-69593，一种OPRK激活剂而进行。对U-69593的最大应答为报道基因表达比背景提高了大约115倍。
HTLA 2C11.6细胞采用包含低效应剪切位点的ADRA1A-GRPR 23aa尾-tTA融合构建子转染并且检测采用10μM肾上腺素，一种ADRA1A激活剂而进行。对肾上腺素的最大应答为报道基因的表达比背景提高了大约102倍。
实施例28
该实验被设计以证明利用该检测方法能检测受体酪氨酸激酶胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)的活性，特别是通过监控配体诱导细胞内信号蛋白SHCI(包含Src同源2结构域转化蛋白1)的募集而检测。
制造第一融合构建子被，包含编码人IGF-1R的DNA，其可在GenBank登记号NM_000875(SEQ ID NO96)下找到，其被融合进入一个编码前述的四环素控制的反式激活蛋白tTA的氨基酸3-335的DNA序列中。在这些序列中插入的是一个编码包括前述的TEVNIa-Pro，ENLYFQL(SEQ ID NO14)低效应剪切位点的氨基酸序列GSENLYFQL(SEQID NO82)的DNA序列。CMV启动子被放置在IGF1R编码区域的上游，并且polyA序列被放置在tTA区域的下游。该构建子被称为IGF1R-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA。
制造第二融合构建子，包含编码人SHC1，对应于氨基酸1-238(基因Bank登记号BC014158)(SEQ ID NO97)的PTB区域的DNA被融合进入一个编码前述的成熟TEV NIa蛋白酶，对应于氨基酸2040-2279(基因Bank登记号AAA47910)(SEQ ID NO79)的催化结构域的DNA序列中。在这些序列中插入的是一个连接子DNA序列，其编码氨基酸NSGS(SEQ ID NO98)。CMV启动子被放置在SHC1PTB结构域编码序列的上游而一个polyA序列被放置在TEV NIa蛋白酶序列的下游。该构建子被称为SHC1-TEV。
IGF1R-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA和SHC1-TEV融合构建子被转染进入前述的克隆HTL5B8.1细胞中。大约2.5×104细胞放置于96孔板的每孔中，采用带有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μμg/ml G418，和3μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基培养。第二天细胞生长至50％融合度融合度并且采用每孔15μl如下混合物进行转染100μμgl DMEM，0.2μμg IGF1R-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA DNA，0.2μμg SHC1-TEV DNA，以及2μμl Fμgene(一种合适的包含脂质体和其他材料的转染试剂)，在加入细胞之前在室温下孵育15分钟。在采用特异受体激活剂处理之前，转染细胞被培养大约16小时。24小时之后，裂解细胞并如前述检测荧光素酶活性。
加入1μM人胰岛素样生长因子1导致荧光素酶报道基因活性提高90倍。
实施例29
该试验本设计以证明采用该检测方法能检测不是正常膜结合蛋白的两种检测蛋白之间的相互作用。在这个实施例中，该检测方法被用来检测配体诱导的核类固醇激素受体，ESR1(雌激素受体1或ERα)和ESR2(雌激素受体2或ERβ)二聚化。在这个实施例中，ESR1被融合至转录因子tTA，其中TEV NIa-Pro蛋白酶剪切位点在ESRI和tTA序列之间插入。该ESRI-tTA通过融合细胞内跨膜蛋白CD8的C末端而系在膜上。CD8基本功能为一个插入支架，而使ESR1连系在细胞膜的细胞质侧。这样融合的转录因子不能进入核直到与ESR2和蛋白酶相互作用。可采用任何跨膜蛋白。这种CD8-ESR1-TEV NIa Pro剪切-tTA融合蛋白与一个包含ESR2和TEV NIa-Pro蛋白酶的第二融合蛋白一起在包含一个tTA依赖的报道基因的细胞系中表达。雌激素诱导的ESR1和ESR2二聚化因而触发了tTA转录因子从膜结合的融合蛋白中释放，其可以通过随后诱导的报道基因活性而得以检测。
制造融合构建子，其包含编码人CD8基因(235氨基酸)的DNA序列，其可在Genbank登记号NM_001768(SEQ ID NO99)下发现，被融合进入编码人ESR1(596氨基酸s)的DNA序列中，其可在Genbank登记号NM_000125(SEQ ID NO100)下发现。在这些序列中插入的是一个编码氨基酸序列GRA(Gly-Arg-Ala)的DNA序列。最终构建子随后被融合至编码前述的四环素控制的反式激活蛋白tTA的氨基酸3-335的DNA编码序列框中。在这些序列中插入的是一个编码包含前述的TEV NIa-Pro，ENLYFQL(SEQ ID NO14)的低效应剪切位点的氨基酸序列GSENLYFQL(SEQID NO82)的DNA序列。CMV启动子被放置在人CD8编码区域的上游，而poly A序列被放置在tTA区域的下游。该构建子被称为CD8-ESR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA。
制造第二融合构建子，采用编码人雌激素受体β(ESR2)(530个氨基酸)的DNA，其可在Genbank登记号NM_001437(SEQIDNO101)下被找到，其被融合进入一个编码前述的TEV NIa蛋白酶催化结构域，对应于氨基酸2040-2279(GenBank登记号AAA47910)(SEQ ID NO84)的DNA序列中。在这些序列中插入的是一个编码氨基酸序列RS(Arg-Ser)的DNA序列。CMV启动子区域被放置在人雌激素受体β(ESR2)编码区域的上游，而poly A序列被放置在TEV区域的下游。该构建子被称为ESR2-TEV。
CD8-ESR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA和ESR2-TEV融合构建子，与pCDNA3一起被瞬时转染入前述的HTL5B8.1细胞中。大约2.0×104细胞被种植在96孔板的每孔中并且在带有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，100μμg/ml G418和5μμg/ml嘌呤霉素的不含酚的DMEM培养基中培养。在孵育24小时后，细胞每孔采用5ng的ESR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA，15ngESR2-TEV和40ng pCDNA3以及0.3μμl Fμgene的混合物一起进行转染。转染6小时之后，细胞用PBS清洗并在采用50nM 17-β雌二醇处理之前用100μμl不含酚和血清的DMEM中孵育24小时。配体处理的细胞在如前述检测荧光素酶报道基因活性之前再培养18-20小时。用50nM 17-β雌二醇处理使得报道基因活性增加16倍。
本发明的其它特征对于本领域技术人员是清楚的并且不需要在此再介绍。
序列表<110>K·J·李R·阿谢尔W·斯特拉波斯G·巴尔内亚<120>检测蛋白-蛋白相互作用的方法<130>SENTI203.3PCT<140>PCT/US2004/021887<141>2004-07-09<150>60/566,113<151>2004-04-27<150>60/511,918<151>2003-10-15<150>60/485,968<151>2003-07-09<160>101<210>1<211>2015<212>DNA<213>人<400>1actgcgaagc ggcttcttca gagcacgggc tggaactggc aggcaccgcg agcccctagc 60acccgacaag ctgagtgtgc aggacgagtc cccaccacac ccacaccaca gccgctgaat 120gaggcttcca ggcgtccgct cgcggcccgc agagccccgc cgtgggtccg cccgctgagg 180cgcccccagc cagtgcgctt acctgccaga ctgcgcgcca tggggcaacc cgggaacggc 240agcgccttct tgctggcacc caatagaagc catgcgccgg accacgacgt cacgcagcaa 300agggacgagg tgtgggtggt gggcatgggc atcgtcatgt ctctcatcgt cctggccatc 360gtgtttggca atgtgctggt catcacagcc attgccaagt tcgagcgtct gcagacggtc 420accaactact tcatcacttc actggcctgt gctgatctgg tcatgggcct ggcagtggtg 480ccctttgggg ccgcccatat tcttatgaaa atgtggactt ttggcaactt ctggtgcgag 540ttttggactt ccattgatgt gctgtgcgtc acggccagca ttgagaccct gtgcgtgatc 600gcagtggatc gctactttgc cattacttca cctttcaagt accagagcct gctgaccaag 660aataaggccc gggtgatcat tctgatggtg tggattgtgt caggccttac ctccttcttg 720cccattcaga tgcactggta ccgggccacc caccaggaag ccatcaactg ctatgccaat 780gagacctgct gtgacttctt cacgaaccaa gcctatgcca ttgcctcttc catcgtgtcc 840ttctacgttc ccctggtgat catggtcttc gtctactcca gggtctttca ggaggccaaa 900aggcagctcc agaagattga caaatctgag ggccgcttcc atgtccagaa ccttagccag 960gtggagcagg atgggcggac ggggcatgga ctccgcagat cttccaagtt ctgcttgaag 1020gagcacaaag ccctcaagac gttaggcatc atcatgggca ctttcaccct ctgctggctg 1080cccttcttca tcgttaacat tgtgcatgtg atccaggata acctcatccg taaggaagtt 1140tacatcctcc taaattggat aggctatgtc aattctggtt tcaatcccct tatctactgc 1200cggagcccag atttcaggat tgccttccag gagcttctgt gcctgcgcag gtcttctttg 1260aaggcctatg ggaatggcta ctccagcaac ggcaacacag gggagcagag tggatatcac 1320gtggaacagg agaaagaaaa taaactgctg tgtgaagacc tcccaggcac ggaagacttt 1380gtgggccatc aaggtactgt gcctagcgat aacattgatt cacaagggag gaattgtagt 1440acaaatgact cactgctgta aagcagtttt tctactttta aagacccccc cccccccaac 1500agaacactaa acagactatt taacttgagg gtaataaact tagaataaaa ttgtaaaaat 1560tgtatagaga tatgcagaag gaagggcatc cttctgcctt ttttattttt ttaagctgta 1620
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1.一种用于确定是否一种检测化合物调节感兴趣的特异蛋白/蛋白相互作用的方法，其包含使所述化合物与采用如下物质转染或转化的细胞接触(a)包括下述物质的核酸分子(i)编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码蛋白酶或蛋白酶片段识别的剪切位点的核苷酸序列，(iii)编码在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列，和(b)包括下述物质的核酸分子(i)编码在要检测的所述检测化合物存在下与所述第一检测蛋白相互作用的第二检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码对于所述剪切位点特异的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列，并确定所述报道基因的活性从而确定是否所述化合物调节所述蛋白/蛋白相互作用。
2.根据权利要求1的方法，其中所述第一检测蛋白是膜结合蛋白。
3.根据权利要求2的方法，其中所述膜结合蛋白是跨膜受体。
4.根据权利要求3的方法，其中所述跨膜受体是GPCR。
5.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白酶或蛋白酶片段是烟草蚀纹病毒核内包涵体A蛋白酶。
6.根据权利要求1的方法，其中激活所述报道基因的所述蛋白是转录因子。
7.根据权利要求6的方法，其中所述转录因子是tTA或GAL4。
8.根据权利要求1的方法，其中所述第二蛋白是抑制性蛋白。
9.根据权利要求8的方法，其中所述抑制性蛋白是抑制蛋白，并且所述第一蛋白是跨膜受体。
10.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是真核细胞。
11.根据权利要求1的方法，其中所述报道基因是外源基因。
12.根据权利要求11的方法，其中所述外源基因编码β-半乳糖苷酶或荧光素酶。
13.根据权利要求1的方法，其中编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列被修饰以提高与所述第二检测蛋白的相互作用。
14.根据权利要求13的方法，其中所述修饰包含采用编码相比于原始序列与所述第二检测蛋白具有更高亲和性的氨基酸序列的核苷酸序列替换所述第一检测蛋白C-末端区域的全部或部分核苷酸序列。
15.根据权利要求14的方法，其中所述C-末端区域的核苷酸序列被编码AVPR2，AGTRLI，GRPR，F2PL1，CXCR2/IL-8B，CCR4或GRPR的C-末端区域的全部或部分的核苷酸序列所替换。
16.根据权利要求1的方法，包含使多于一种化合物与多个细胞样本接触，所述样本中的每个与一个或更多所述化合物接触，其中所述细胞样本中的每个采用(a)和(b)进行转染或转化，并且在所述多个所述样本中确定报道基因的活性，从而确定是否任何所述化合物调节所述特异蛋白/蛋白相互作用。
17.根据权利要求2的方法，其中所述膜结合蛋白是β2-肾上腺素受体(ADRB2)，精氨酸血管加压素受体2(AVPR2)，血清素受体1a(HTR1A)，m2毒蕈碱性乙酰胆碱受体(CHRM2)，趋化因子(C-C模序)受体5(CCR5)，多巴胺D2受体(DRD2)，卡巴阿片样物质受体(OPRK)或ADRA1A。
18.根据权利要求16的方法，包含使所述样本的每个与一种化合物接触，其中的每种与其他不相同。
19.根据权利要求16的方法，包含使所述样本的每个与所述化合物的混合物接触。
20.一种用于确定是否一种检测化合物调节感兴趣的多个蛋白的一个或多个的相互作用的方法，包含使所述检测化合物与多个细胞样本接触，每种细胞样本已经被如下物质转染或转化(a)第一核酸分子，包含(i)编码第一检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码蛋白酶识别剪切位点的核苷酸序列，(iii)编码在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列，(b)第二核酸分子，包含(i)编码在要检测的感兴趣的所述检测化合物存在下与所述第一检测蛋白相互作用的第二检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码对所述剪切位点特异的蛋白酶或蛋白酶核苷酸序列，其中在所述多个样本的每个中，所述第一检测蛋白不同于其他的第一检测蛋白，并且在一个或多个所述多个样本中确定所述报道基因的活性从而确定感兴趣的一个或多个蛋白相互作用的调节。
21.根据权利要求20的方法，其中所述第二检测蛋白在每个样本中是不同的。
22.根据权利要求20的方法，其中所述第二检测蛋白在每个样本中是相同的。
23.根据权利要求20的方法，其中所有的所述样本放置于一个普通容器中，每个样本包含一个不同的第一和第二检测蛋白对。
24.根据权利要求20的方法，其中每个样本在不同的容器中进行检测。
25.根据权利要求20的方法，其中在给定样本中的报道基因不同于其他样本中的报道基因。
26.根据权利要求19的方法，其中所述化合物的混合物包含生物学样本。
27.根据权利要求26的方法，其中所述生物学样本为脑脊液，尿液，血液，血清，脓液，腹水，滑液，组织提取物或分泌物。
28.采用如下物质转染或转化的重组细胞(a)核酸分子，包含(i)编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码蛋白酶或蛋白酶片段识别的剪切位点的核苷酸序列，(iii)编码在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列，和(b)核酸分子，包含(i)编码在要检测的所述检测化合物存在下与所述第一检测蛋白相互作用的第二检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码对于所述剪切位点特异的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。
29.根据权利要求28中的重组细胞，其中所述核酸分子中的一个或两个被稳定整合到所述细胞的基因组中。
30.根据权利要求28中的重组细胞，其中所述细胞被所述报道基因转染或转化。
31.根据权利要求28中的重组细胞，其中所述第一检测蛋白是膜结合蛋白。
32.根据权利要求31中的重组细胞，其中所述膜结合蛋白是跨膜受体。
33.根据权利要求32中的重组细胞，其中所述跨膜受体是GPCR。
34.根据权利要求28中的重组细胞，其中所述蛋白酶或蛋白酶片段是烟草蚀纹病毒核内包涵体A蛋白酶。
35.根据权利要求28中的重组细胞，其中所述激活所述报道基因的蛋白是转录因子。
36.根据权利要求31中的重组细胞，其中所述膜结合蛋白是ADBR2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2或OPRK。
37.根据权利要求28中的重组细胞，其中所述转录因子是tTA或GAL4。
38.根据权利要求28中的重组细胞，其中所述第二蛋白是抑制性蛋白。
39.根据权利要求38中的重组细胞，其中所述抑制性蛋白是抑制蛋白，并且所述第一蛋白是跨膜受体。
40.根据权利要求28中的重组细胞，其中所述细胞是真核细胞。
41.根据权利要求28中的重组细胞，其中所述细胞是原核细胞。
42.根据权利要求28中的重组细胞，其中所述报道基因是外源基因。
43.根据权利要求42中的重组细胞，其中所述外源基因编码β-半乳糖苷酶或荧光素酶.
44.根据权利要求28中的重组细胞，其中编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列被修饰以提高与所述第二检测蛋白的相互作用。
45.根据权利要求44中的重组细胞，其中所述修饰包含采用一种编码相比于原始序列与所述第二检测蛋白具有更高亲和性的氨基酸序列的核苷酸序列替换所述第一检测蛋白C-末端区域的全部或部分核苷酸序列。
46.根据权利要求44中的重组细胞，其中所述C-末端区域的核苷酸序列被编码AVPR2，AGTRLI，GRPR，F2PL1，CXCR2/IL-8B或CCR4的C-末端区域的核苷酸序列所替换。
47.一种分离的核酸分子，其包含，从5′至3′顺序，(i)编码检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码蛋白酶或蛋白酶片段识别的剪切位点的核苷酸序列，(iii)编码在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列。
48.根据权利要求47的分离的核酸分子，其中所述检测蛋白是膜结合蛋白。
49.根据权利要求48的分离的核酸分子，其中所述膜结合蛋白是跨膜受体。
50.根据权利要求49的分离的核酸分子，其中所述跨膜受体是GPCR。
51.根据权利要求47的分离的核酸分子，其中所述蛋白酶或蛋白酶片段是烟草蚀纹病毒核内包涵体A蛋白酶。
52.根据权利要求47的分离的核酸分子，其中所述激活所述报道基因的蛋白是转录因子。
53.根据权利要求52的分离的核酸分子，其中所述转录因子是tTA或GAL4。
54.根据权利要求48的分离的核酸分子，其中所述膜结合蛋白是ADBR2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2或OPRK。
55.包含权利要求47的分离的核酸分子的表达载体，可操作的连接到启动子。
56.一种分离的核酸分子，其包含(i)编码在要检测的检测化合物存在下与另一种检测蛋白相互作用的检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码对所述剪切位点特异的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。
57.根据权利要求56的分离的核酸分子，其中所述检测蛋白是抑制性蛋白。
58.根据权利要求57的分离的核酸分子，其中所述抑制性蛋白是抑制蛋白.
59.包含权利要求56的分离的核酸分子的表达载体，可操作的连接到启动子。
60.由权利要求47的分离的核酸分子的表达所产生的融合蛋白。
61.由权利要求56的分离的核酸分子的表达所产生的融合蛋白。
62.一种用于确定是否检测化合物调节感兴趣的特异蛋白/蛋白相互作用的检测试剂盒，包括每种独立的部分(a)核酸分子，其包含(i)编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码蛋白酶或蛋白酶片段识别的剪切位点的核苷酸序列，(iii)编码在所述细胞中激活报道基因的蛋白的核苷酸序列，(b)核酸分子，其包含(i)编码在要检测的检测化合物存在下与所述第一检测蛋白相互作用的第二检测蛋白的核苷酸序列，(ii)编码对所述剪切位点特异的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列，(c)分别独立容纳每种(a)和(b)的包装方式。
63.根据权利要求62的检测试剂盒，其中所述第一检测蛋白是膜结合蛋白。
64.根据权利要求63的检测试剂盒，其中所述膜结合蛋白是跨膜受体。
65.根据权利要求64的检测试剂盒，其中所述跨膜受体是GPCR。
66.根据权利要求62的检测试剂盒，其中所述蛋白酶或蛋白酶片段是烟草蚀纹病毒核内包涵体A蛋白酶。
67.根据权利要求62的检测试剂盒，其中所述激活所述报道基因的蛋白是转录因子。
68.根据权利要求67的检测试剂盒，其中所述转录因子是tTA或GAL4。
69.根据权利要求62的检测试剂盒，其中所述第二蛋白是抑制性蛋白。
70.根据权利要求69的检测试剂盒，其中所述抑制性蛋白是抑制蛋白，并且所述第一蛋白是跨膜受体。
71.根据权利要求61的检测试剂盒，进一步包含编码报道基因的分离的核酸分子的独立部分。
72.根据权利要求71的检测试剂盒，其中所述报道基因编码β-半乳糖苷酶或荧光素酶.
73.根据权利要求62的检测试剂盒，其中编码所述第一检测蛋白的核苷酸序列被修饰以提高与所述第二检测蛋白的相互作用。
74.根据权利要求73的检测试剂盒，其中所述修饰包含采用编码相比于原始序列与所述第二检测蛋白具有更高亲和性的氨基酸序列的核苷酸序列替换所述第一检测蛋白C-末端区域的全部或部分核苷酸序列。
75.根据权利要求74的检测试剂盒，其中所述C-末端区域的核苷酸序列被编码AVPR2，AGTRLI，GRPR，F2PL1，CXCR2/IL-8B或CCR4的C-末端区域的全部或部分的核苷酸序列所替换。
76.根据权利要求63的检测试剂盒，其中所述膜结合蛋白是ADRB2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2或OPRK。
全文摘要
本发明涉及一种用于确定是否一种检测化合物或化合物的混合物调节感兴趣的两种蛋白的之间相互作用的检测方法。确定过程可以通过利用两种重组分子，一个包含第一蛋白和用于蛋白水解分子的剪切位点，以及基因的激活剂。第二重组分子包括第二蛋白和蛋白水解分子。如果检测化合物结合至第一检测蛋白，启动反应而由此激活剂被剪切，并且激活报道基因。
文档编号C12Q1/68GK1894581SQ200480024864
公开日2007年1月10日 申请日期2004年7月9日 优先权日2003年7月9日
发明者K·J·李, R·阿谢尔, W·斯特拉波斯, G·巴尔内亚 申请人:森蒂金生物科学公司, 纽约市哥伦比亚大学托管会