用于对在细胞薄片制作中使用的支撑体进行涂敷的组合物、细胞薄片制作用支撑体以及...的制作方法

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专利名称:用于对在细胞薄片制作中使用的支撑体进行涂敷的组合物、细胞薄片制作用支撑体以及 ...的制作方法
技术领域
本发明涉及一种用于对在细胞薄片制作中使用的支撑体进行涂敷的组合物、细胞薄片制作用支撑体以及细胞薄片的制造方法。
背景技术
对于已进入明显功能不全的心脏而言,作为代替供体不足的心脏移植的治疗方法,正在尝试利用各种干细胞的细胞移植。近年来,在从这样的细胞移植开始在体外立体构建心肌组织的基础上进行移植的组织移植的方法正在盛行。例如,早已有报道已成功地通过使用用电子射线将聚(N-异丙基丙烯酰胺)(简称为“PIAAm”)涂布于市售的聚苯乙烯培养皿表面而成的温度敏感性培养皿,制作各种细胞薄片,其中,对于心肌细胞,开发出了通过层叠化这样制作出的心肌薄片而可以作为移植片利用的心肌组织块(特开2003-38170号公报,国际公开01/068799号手册,Shimizuet.Al.Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel3-dimensional cell sheet manipulation technique and temperature-responsivecell culture surfaceCirc Res.1002;90e40-e48)。这样制作的心肌组织块在体内和体外均被确认为进行与正常的心肌组织相同的电活动。
关于对各种组织的原代培养特别是心肌细胞的培养,在其方法中,不同的单位之间多少会有差异。可是,使用上述温度敏感性培养皿的细胞薄片的制作方法,在以严格的方法进行原代培养以使在本特殊培养皿中的培养为最佳时,可以比较稳定地制作细胞薄片,而当将各单位中通常进行的方法直接应用时,则难以进行细胞的薄片化。

发明内容
本发明的目的在于提供一种方法,该方法可以使用由市售的且被确保安全性的身边的材料涂敷的支撑体,以简单的操作制造细胞薄片。
另外,本发明的目的还在于,提供一种用于对在细胞薄片制作中使用的支撑体进行涂敷的组合物。
进而,本发明的目的还在于,提供一种适合制造细胞薄片的支撑体。
本发明人等发现,如果在预先薄层涂敷了几乎被所有的细胞分解的纤维蛋白糊的培养皿上培养细胞几天,在细胞与培养皿表面之间的纤维蛋白消失,细胞成为结合成薄片状的悬空状态。通过用刮子剥离该状态的细胞薄片并回收,确立了以稳定的概率制作细胞薄片的方法。根据这些发现完成了本发明。
本发明的要旨如下所述。
(1)一种组合物,是用于用纤维蛋白涂敷在细胞薄片制作中使用的支撑体的表面的组合物,其特征在于,含有纤维蛋白原和凝血酶。
(2)一种细胞薄片制作用支撑体,其中,表面被纤维蛋白所涂敷。
(3)一种细胞薄片的制造方法,其中,包括在表面被纤维蛋白涂敷的支撑体的表面上将细胞培养到成为饱和状态,继续培养充分时间直至细胞底面的纤维蛋白被分解,然后从支撑体表面将培养的细胞剥离成薄片状。
(4)根据(3)所述的方法,包括进一步层叠化已剥离成薄片状的培养细胞。
(5)根据(3)或(4)所述的方法,其中,细胞薄片被用于再生医疗或药剂的生物学活性试验中。
通过本发明,无需变更各单位至今进行的原代培养细胞的方法,通过进行相同的原代培养,使利用各种细胞制作薄片成为可能,其成功率也稳定。
另外,通过本发明,不使用涂敷了PIAAm的高价的特殊培养皿,通过使用市售的纤维蛋白糊,可以立即而且大量地制作细胞薄片。
本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本国专利申请、特愿2003-328340号说明书和/或附图中记载的内容。


图1表示大鼠心肌细胞的薄片化的情况。
图2表示C2C12细胞的薄片化的情况。
图3表示成熟骨骼肌细胞的薄片化的情况。
图4表示心肌细胞薄片的心电图。
图5表示已移植到皮肤的大鼠心肌细胞薄片的状态。
图6表示在体外薄片化后第2天的大鼠心肌薄片的辅肌动蛋白和连接蛋白(connexin)43的免疫染色的结果。
图7表示向裸大鼠皮下移植后第7天的大鼠心肌细胞薄片的HE染色结果。
图8表示向裸大鼠皮下移植后第7天的大鼠心肌细胞薄片的辅肌动蛋白和连接蛋白43的免疫染色结果。
图9表示使用以纤维蛋白聚合物涂敷的皿的心肌细胞薄片的机构和操作的代表性方案。操作以A→B→C→D→E→F的顺序进行。
将原代培养大鼠新生儿心肌细胞铺展在用纤维蛋白聚合物涂敷的皿上(A,B,G)。在第4天,纤维蛋白聚合物被从心肌细胞分泌出的各种蛋白酶分解(C)。用细胞刮子(cell scraper)按照不刮破心肌细胞薄片(myocardial cell sheets,下面也记为“MCS”)的方式,逐渐从端部向皿的中央去掉细胞(D、E),得到皱缩的MCS(H)。向皱缩的薄片上滴几滴培养液,薄片则铺开(E、I)。用手术刀将变平的MCS的端部切成正方形。在几个实验中,重合两张MDS并留下2mm宽度的边缘,在用层粘连蛋白(laminine)涂敷的培养皿上进行共培养(F、J)。
图10表示MCS的组织学分析结果。
(A)MCS的制作和组织学分析的记录(protocol)。(B-E、H、I)MCS的H&E染色。(F、G、J、K)MCS的免疫荧光染色。红F-辅肌动蛋白,绿纤维蛋白,蓝TOTO-3染色的细胞核。在图中插入记录和标线(scale bar)进行显示。
图11表示MCS的性质。
(A)PX-S0的天数的样品中MCS制作的成功率。(B)PX-S0样品中MCS的直径。(C)使用PX-S3的天数的样品制作的MCS显示自律搏动的百分率。(D)P4-SX的天数的样品中自律搏动薄片的百分率。(E)P4-SX的天数的样品中获得了人工起搏(pacing)的MCS的百分率。(F)P4-SX的天数的样品中的搏动周期。
图12表示用于分析两张重合的MCS中的电活动而使用一对接触的双极电极所记录的心电图(ECG)和利用光学绘图(optical mapping)记录的活动电位的传播情况。
(A)两张重合的MCS的模式图和接触的双极电极的位置。(B)两张重合的MCS的显微镜观察图像。(C)从显示完全同步化的各MCS得到的细胞外电位。(D)使用等时线显示利用光学绘图观察的活动电位的传播情况。各等时线的间隔为35毫秒。从薄片A的左下方发生的活动电位迂回到不显示电兴奋的接合部的下半部分,通过接合部上方的局限区域,传播到对侧的薄片B。(E)追踪兴奋波的前头,显示活动电位行进的情况。((D)的标有箭头的黑色曲线)图13表示在开始部分重叠的两张MCS的共培养后第1天,使用光学绘图观察重合的MCS的活动电位的传播情况的结果。
第1天的代表性数据。(A)通过相位差显微镜的观察图像。(B-D)分别为在薄片A的左端的起搏后在14、108和164毫秒得到的活动电位的观察图像。注意薄片B的局限捕捉可以观察(见箭头)。(E)MCS的截面模式图和起搏部位。(F)活动电位图。在这里,各等时线的间隔为7毫秒。在接合部的左端混有等时线,表明从这附近开始了传导延迟。活动电位的传播在接合部的末端被断开。(G)沿着兴奋波的前头,冲动(impulse)逐渐传播的情况((F)的标有箭头的红色曲线)。(H)对沿着兴奋波的前头的任意点中的活动电位的踪迹(trace)进行重合。记号与被记录活动电位的肌细胞的位置对应。
图14表示在第3天,使用光学绘图观察重合的MCS的活动电位的传播和电结合的情况的结果。
第3天的代表性数据。(A)通过相位差显微镜的观察图像。(B-D)为在薄片A的左端的起搏后在14、84和150毫秒得到的光学绘像。(E)MCS的截面模式图和起搏部位。(F)已计算的活动电位图(大小与图11F相同)表明活动电位的传播在两张MCS之间没有延迟,非常平稳地传导。(G)兴奋波的前头逐渐传播的情况表明在兴奋波的行进中没有延迟,在两张MCS之间形成紧密的(tight)电传送。(H)对沿着兴奋波的前头的任意点中的活动电位的踪迹进行重合。
图15表示在体外的两张心肌细胞之间形成良好的电结合的组织学依据。
用激光共焦点显微镜观察对重合的MCS(第3天)进行免疫组织染色的样品的结果。利用抗辅肌动蛋白(绿)、抗连接蛋白43(红)抗体和基于TOTO3的核染色对MCS进行三重染色。(A)从上方观察的结果。(B)从侧面观察的结果。(C)用高倍率,从上方观察的结果。注意到心肌细胞紧密配置,连接蛋白43明显存在于细胞的接合部。
图16表示在体内的3层心肌细胞薄片的移植情况。
将3层MCS移植到裸大鼠的皮下组织,在第14天观察样品。(A)移植区域(黑虚线)显示周期性自律搏动(200bpm)。(B)3层MCS移植(graft)的截面的H&E染色。Sk骨骼肌,Ct结缔组织,Cs被移植的3层MCS。(C)同一样品的アザン染色。(D)高倍率的截面图。注意到在被移植的MCS中可见微小血管。*微小血管。(E)图13中记载的、被移植的3层MCS的3重染色。注意到被移植的心肌细胞显示被很好地组织化的横纹结构,该横纹结构显示向同一方向的取向性。
图17表示用光学显微镜观察在纤维蛋白薄片上培养的兔角膜上皮细胞的结果(倍率100倍)。
图18表示用刮子剥下的兔角膜培养上皮细胞薄片。
图19表示用光学显微镜观察在纤维蛋白薄片上培养的兔口腔粘膜上皮细胞的结果(倍率100倍)。
图20表示用刮子剥下的兔口腔粘膜培养上皮细胞薄片。
图21表示作为阳性对照,对兔角膜和口腔粘膜上皮的角蛋白3/12进行染色的结果。
(A)角膜上皮的核染色像(B)角膜上皮的核和角蛋白3/12的染色像(C)口腔粘膜的核染色像(D)口腔粘膜的核和角蛋白3/12的染色像图22表示使用兔角膜上皮细胞和口腔粘膜上皮细胞制作的细胞薄片的免疫染色。
(A)角膜上皮细胞薄片的核染色像(B)角膜上皮细胞薄片的核和角蛋白3/12的染色像(C)口腔粘膜上皮细胞薄片的核染色像(D)口腔粘膜上皮细胞薄片的核和角蛋白3/12的染色像在培养上皮薄片中,角膜上皮多层化,被角蛋白3/12染色。在口腔粘膜上皮可见多层化,角蛋白3/12的染色很少但仍被染色。在纤维蛋白薄片上培养的兔角膜上皮、口腔粘膜上皮多层化并表达角蛋白,表明可以制作具有与正常组织接近的特性的培养上皮。
具体实施例方式
本发明提供一种用于通过纤维蛋白对在细胞薄片制作中使用的支撑体的表面进行涂敷的组合物,其特征在于,含有纤维蛋白原和凝血酶。
纤维蛋白是一种在纤维蛋白原的Aα链和Bβ链被凝血酶特异性水解后释放出血纤维蛋白肽A和B而产生的难溶性组分。参与纤维蛋白凝集的反应基之间通过氢键结合形成聚合物,以一定的排列凝胶化。
纤维蛋白原为一种分子量约34万的糖蛋白质,分子量分别为6.5万±0.1万、5.5万、4.7万的Aα链、Bβ链和γ链3种亚单位形成对,彼此以S-S键结合。利用凝血酶水解Arg-Gly结合,从Aα链和Bβ链释放出血纤维蛋白肽A和B,转变为纤维蛋白。
凝血酶为蛋白质分解酶(蛋白酶)的一种,作用于纤维蛋白原产生纤维蛋白。在本发明的组合物中,凝血酶作为将纤维蛋白原转换成纤维蛋白的酶,以有效量存在即可。
如果考虑到在使用纤维蛋白原和凝血酶形成的纤维蛋白涂层上培养细胞制作的细胞薄片是用于人,则优选使用人来源的纤维蛋白原和凝血酶,但不限定于此,也可以来源于其它动物(例如,已有出售的猴、猪、小鼠、大鼠、狒狒、狗、猫、羊、牛等)。
纤维蛋白原和凝血酶可以使用市售的商品。例如,可以使用バクスタ一公司的テイシ一ル试剂盒(kit)。テイシ一ル试剂盒包括人纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙2水合物、抗蛋白肽酶(aprotinin)。
本发明的组合物进一步可以含有氯化钙(可以是水合物)、抗蛋白肽酶、生理盐水等。
本发明的组合物16ml中的组成的一个例子如下所述。
·纤维蛋白原45~108mg·凝血酶0.2~0.8U·氯化钙2水合物 0.5~1.0mg·抗蛋白肽酶1500~6000U·生理盐水 16ml在上述组合物中,由于凝血酶作用于纤维蛋白原时生成纤维蛋白,所以纤维蛋白原和凝血酶分别被保存在不同的容器中,在使用时混合即可。也可以在纤维蛋白原中添加血清白蛋白、氨基乙酸、抗蛋白肽酶、四丁酚醛、氯化钠、柠檬酸钠。也可以在凝血酶中添加血清白蛋白、氨基乙酸、氯化钠。由于钙离子促进纤维蛋白原的水解,所以氯化钙2水合物也与纤维蛋白原保存在不同的容器中,在使用时混合即可。例如,氯化钙2水合物可以溶解于液体(下面称为“凝血酶用溶解液”)而保存在容器中,所述的液体用于在使用时溶解凝血酶。另外,由于抗蛋白肽酶抑制纤维蛋白原的聚合,所以可以添加到纤维蛋白原中,还可以将其溶解于液体(下面称为“纤维蛋白原用溶解液”)而保存在容器中,所述的液体用于在使用时溶解纤维蛋白原。下面对上述组合物的使用方法的一个例子进行说明。首先,在含有抗蛋白肽酶的纤维蛋白原用溶解液中溶解纤维蛋白原,作为A液。在含有氯化钙2水合物的凝血酶用溶解液中溶解凝血酶,作为B液。混合A液、B液和生理盐水,将混合液涂布于细胞薄片制作用支撑体的表面。
可以使用本发明的组合物,用纤维蛋白涂敷细胞薄片制作用支撑体的表面。
本发明还提供一种表面被纤维蛋白涂敷的细胞薄片制作用支撑体。
支撑体只要可以培养细胞,任意物质均可,可以例示为培养皿、皿、6~96孔板培养皿、细胞圆盘(disc)LF(SUMILON)等。作为支撑体的材质,可以例示为玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、陶瓷类等,但不限定于此。
为了制造本发明的细胞薄片制作用支撑体,可以在支撑体上涂布本发明的组合物形成纤维蛋白的被膜。下面对其中的一个例子进行详细说明。
首先,混合纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙2水合物、抗蛋白肽酶、生理盐水,将混合液涂布于支撑体的表面。室温下放置适当的时间(通常1~3小时),形成纤维蛋白。在无菌条件下、4℃保存直到将其作为细胞制作用支撑体使用。
本发明还提供一种细胞薄片的制造方法,该方法包括在表面被纤维蛋白涂敷的支撑体的表面上将细胞培养至饱和状态,并继续培养充分时间直到细胞底面的纤维蛋白被分解,然后从支撑体表面将培养的细胞剥离为薄片状。通过剥离在培养皿上增殖到无间隙的饱和状态的细胞,能够得到膜状的薄片。在本说明书中,“饱和状态”是指细胞无间隙并列的状态,可以用显微镜观察其状态。
作为需要培养的细胞,可以例示为心肌细胞、成骨骼肌细胞、成熟骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨髓间质细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、皮肤细胞等,但不被这些所限定。使这些细胞在培养皿上处于饱和状态包括只铺满一种细胞的方法和同时铺满多种细胞的方法。在使一种细胞处于饱和状态的方法中,还包括开始时将少数具有增殖能力的单克隆细胞种到培养皿上并使其增殖到饱和状态的方法,和开始时播种很多增殖能力低的细胞的多克隆细胞而且使其一粘附培养皿底面就很快处于饱和状态的方法。作为前者的例子,包括播种少数小鼠成骨骼肌细胞来源的细胞株C2C12细胞或CMG细胞之类的永生细胞株,使其在培养皿上增殖成饱和状态的方法。作为后者的例子,通过原代培养的方法,从心肌、骨骼肌、平滑肌、骨髓等分别提取心肌细胞、成骨骼肌细胞、骨髓间质细胞等,使用细胞分离器(cell sorter)、Percoll(パ一コ一ル)、粘附分离法等,选择收集细胞,提高纯度之后,将充分的细胞量播种到培养皿的方法。作为使多种细胞处于饱和状态的方法的例子,在以心肌细胞或骨骼肌细胞制作薄片时,如果混合成纤维细胞,即使心肌细胞或骨骼肌细胞的数量不够,由于增殖能力高的成纤维细胞进入心肌细胞之间、骨骼肌细胞之间的间隙,所以培养皿的底面也会被任意种细胞覆盖而处于饱和状态。这样,即使利用难以提取足够量而且增殖能力低的细胞,也可以通过共培养成纤维细胞等成为连接物的细胞而容易地制作薄片。此时作为用于连接物细胞,除了成纤维细胞以外,还可以使用平滑肌细胞、内皮细胞等,通过改变用于连接物的细胞,可以根据用途改变所制作的细胞薄片的强度或伸缩性。
细胞可以源自于人,还可以源自于人以外的动物(例如猴、猪、小鼠、大鼠、狒狒、狗、猫、羊、牛等)。细胞可以从动物等供给源直接提取,也可以是被株化的培养细胞或未被株化的培养细胞。
为了制造细胞薄片,可以在表面被纤维蛋白涂敷的支撑体的表面上,将细胞培养到饱和状态,并继续培养充分时间直至细胞底面的纤维蛋白被分解,然后从支撑体表面将培养的细胞剥离成薄片状。细胞的培养只要在表面被涂敷纤维蛋白的支撑体的表面上进行即可,可以在任何方法和条件下进行,可以持续培养直至细胞成为饱和状态而且纤维蛋白分解而使细胞能够从支撑体表面剥离成薄片状的程度。另外,在需要长时间培养细胞直至薄片化时,在进行薄片化的几天前,通过向培养液中加入适量的抗蛋白肽酶,可以在必要的天数之前不使纤维蛋白溶解而延长培养。通常在培养基中培养细胞直至饱和状态,然后在不含有抗蛋白肽酶的培养液中继续培养3~4天。此间,细胞底面的纤维蛋白被培养细胞自然分解,但此时通过向培养液中添加分解纤溶酶(plasmin)等纤维蛋白的物质,也可以有意地调节细胞底面的纤维蛋白分解的速度。接着,可以吸出培养液,使用刮子等剥离机构,从支撑体剥离膜状的细胞薄片。在剥离细胞薄片结束之后,通过向起皱的细胞薄片滴下新的培养液,可以使细胞薄片伸展。
也可以进一步层叠化被剥离的薄片状培养细胞。下面对层叠化细胞薄片的方法的一个例子进行说明。
从在培养皿上伸展后的第1张细胞薄片进一步吸出培养液,在37℃饱和水蒸气的孵箱中放置适当的时间(例如15~30分钟)。此间,第1张细胞薄片粘附在培养皿上。接着,用吸液管(pipette)连同培养液一起吸引刚刚剥离之后的第2张细胞薄片,向固定在培养皿上的第1张细胞薄片上滴下。在皱缩状态下将第2张薄片滴在已伸展的第1张薄片上,然后在该第2张薄片上进一步缓慢滴新培养液,这样可以在将其重叠在第1张薄片上的状态下伸展第2张薄片。重复同样的技术,可以逐渐层叠化细胞薄片。
通过使用本发明的方法来薄片化各种细胞而且层叠化薄片,对于各种脏器而言,体外的组织块构建成为可能,通过使用这样制作的组织块,能够确立从细胞水平到组织水平的体外分析方法。
通过本发明的方法制造的细胞薄片,可以用于再生医疗或药剂的生物学活性试验中。
作为用于再生医疗的细胞薄片,可以举出心肌细胞薄片、角膜上皮细胞薄片、口腔粘膜上皮细胞薄片、皮肤细胞薄片等。心肌细胞薄片可以用作心肌梗塞或各种心肌炎、心肌病等引起的心功能不全、心律不齐等的治疗或心肌移植用材料。角膜上皮细胞薄片和口腔粘膜上皮细胞薄片可以用作角膜移植用材料。皮肤细胞薄片可以用于烫伤、外伤等引起的创伤的治疗等。另外,也可以用于通过成纤维细胞来促进创伤的治愈的治疗方法等中。
作为药剂的生物学活性试验,可以举出药剂的药理活性试验、药剂的毒性试验、药剂的结合活性试验等。作为药剂的结合活性,可以例示为配体-受体的结合活性、抗体-抗原的结合活性等。与迄今为止已进行的向细胞培养的培养液中添加各种药物并研究细胞的变化的方法相比,在向细胞薄片的培养液中添加各种药物研究对细胞薄片的影响的情况下,不仅可以研究对细胞单体的影响,而且还可以研究检测对细胞间的构造、构建等的影响,不仅可以在细胞水平上研究药剂的影响,而且还可以在脏器水平上研究药剂的影响成。另外,将各种人脏器来源的细胞薄片移植到免疫(功能)不全脏器(裸小鼠、スキツド小鼠、裸大鼠等)中,在向该移植模型动物给药之后,通过研究细胞薄片的状态,可以预测药剂在生物体内对人脏器的影响。
通过使用了由本发明的方法制造的细胞薄片的药剂的生物学活性试验,可以挑选具有需要的生物学活性的医药、农药等候补物质。
下面,通过实施例具体地说明本发明。此外,这些实施例是用于说明本发明的例子,而不限定本发明的范围。
在本实施例中使用的材料的产地和调制方法如下所述。
培养皿(FALCON 35 3001,直径3.5cm)
Wistar大鼠(日本クレア出售)2.5%胰蛋白酶(trypsin)(GIBCO 15090-046)胶原酶(collagenase)(SIGMA C-5138)DNase I(SIGMA DN-25)FBS(JRH Bioscience)青霉素、链霉素以及两性霉素B(GIBCO 15240-062)培养基199(ICN Biomedicals 1023126)DMEM(GIBCO 12100-046)小鼠成骨骼肌细胞来源的C2C12(从ATCC购买)CMG细胞(在庆应义塾大学医学部呼吸循环器内科教室,向小鼠骨髓细胞添加5-氮胞苷,得到获得向心肌转化的能力而永生化的细胞株,对该得到的细胞株进行克隆而得到的细胞株)裸大鼠(日本クレア)兔来源抗小鼠连接蛋白(cennexin)抗体(SIGMA C6219)小鼠来源抗辅肌动蛋白抗体(SIGMA A7811)TRITC结合猪来源抗兔IgG抗体(DAKO R 0156)Alexa 488结合山羊来源小鼠IgG抗体(Molecular Probes A-11029)兔(日本白色种(J.W.,雌,约3Kg,白石实验动物饲养所))SHEM·DMEM/F12Gibco BRL D-MEM/F12(1袋/1L用),12400-016;15.6g装;含HEPES·NaHCO3Waco(使用时的浓度2.5g/l)·胰岛素SIGMA人重组体在大肠杆菌的表达(human recombinantexpressed in E.coli);I-0259;50mg装(使用时的浓度5μg/ml)·人-EGF(Human-EGF)Gibco BRL重组体人EGF(BRLRecombinantHuman EGF);13247-010;100μg装(使用时的浓度10μg/ml)·霍乱毒素(Cholera toxin)SIGMA c-3012;1mg装(使用时的浓度1μg/ml)·0.5%DMSOSIGMA DIMETHYL SULFOXIPE;D-2650;5ML×5瓶装·15%FCS三光纯药(Vitromex);VMS1500;Lot,F000210802;500mlDMEM(Gibco)牛胎儿血清(ニチレイ)3T3细胞(American Type Culture Collection)抗蛋白肽酶(Wako)庆大霉素、青霉素、两性霉素B(Wako)Dispase II(合同酒精)DMEM/F12(Gibco)胰蛋白酶(Gibco)EDTA(Gibco)正常驴血清(Normal Donkey Serum)(CHEMICON;S30-100ML;Lot,23031387;100ml)BSA(Sigma)DAPI(Sigma)[实施例1]利用人纤维蛋白的培养皿涂敷混合人纤维蛋白原90mg、凝血酶0.4U、氯化钙2水合物0.59mg、抗蛋白肽酶3000U(以上使用Baxter公司制テイシ一ル1ml试剂盒)、生理盐水16ml,在每一张3.5cm培养皿的培养皿底面上快速涂布0.3ml,在保持水平的状态下,室温放置1小时。然后,形成纤维蛋白且底面的テイシ一ル稀释液已固化的培养皿,在保持无菌状态下4℃保存。通过在该状态下保存,使用可以长达2个月。可以利用テイシ一ル1ml的试剂盒制作40~50张3.5cm培养皿。
在纤维蛋白涂敷的培养皿中的细胞培养(1)大鼠心肌细胞从1天龄的Wistar大鼠新生鼠仔摘取心室,利用0.03%胰蛋白酶、0.03%胶原酶、20μg/ml DNase I进行酶处理,分离出心室肌细胞。向每张纤维蛋白涂敷的3.5cm培养皿中注入含有10%FBS和青霉素(50U/mL)/链霉素(50μg/ml)/两性霉素B(25μg/ml)的培养基199/DMEM 2ml和2×106个本细胞,在37℃、5%CO2的孵箱中进行培养。
(2)小鼠成骨骼肌细胞利用的C2C12细胞使用含有10%FBS的DMEM培养基,在5%CO2、37℃的孵箱中培养从ATCC购买的小鼠成骨骼肌细胞来源的细胞株C2C12,在80%饱和的状态下进行传代。
(3)小鼠C2C12细胞来源的成熟骨骼肌样细胞在75cm烧瓶中播种1×107个细胞的利用(2)的方法传代的C2C12细胞,添加含有5%马血清的DMEM20ml。在观察细胞的状态的同时,1~2次/周换培养基。
(4)骨髓间质细胞在无菌状态下,从小鼠的大腿骨提取骨髓,在每一张3.5cm纤维蛋白涂敷的碟(dish)中播种1×107个细胞的有核细胞,添加三光纯药株式会社制间充质系干细胞用增殖培养基(PT-3001)3ml,以1次/周的频度换培养基。
细胞的薄片化(1)大鼠心肌细胞薄片的制作在原代培养后第4天,细胞在培养皿底面成为饱和状态进行搏动。吸出培养液,使用刮子缓慢从培养皿周缘部向中央部剥下已结合成膜状的心肌细胞而且不破坏细胞。在全部剥离结束之后,通过缓慢地向皱缩的细胞薄片滴新培养液,可以在培养皿上伸展细胞薄片。将大鼠心肌细胞的薄片化的情况显示在图1。
(2)利用C2C12细胞、成熟骨骼肌细胞以及骨髓间质细胞制作细胞薄片用实施例2的方法,继续在纤维蛋白涂敷培养皿上将细胞培养至饱和状态。然后,在继续培养3~4天后,同样使用刮子剥离膜状的细胞薄片。将C2C12细胞和成熟骨骼肌细胞的薄片化的情况分别显示在图2和图3。
细胞薄片的多层化如实施例3中所述,通过滴培养液使第一张薄片在培养皿上伸展。然后,极力地吸引培养液,在37度饱和水蒸气的孵箱中放置15分钟。此间,第1张细胞薄片以较弱的力粘附在培养皿上。接着,用10ml吸液管连同培养液一起吸引刚刚剥离的第2张细胞薄片,向固定在培养皿上的第1张细胞薄片上滴下。以皱缩的状态将第2张薄片滴在已伸展的第1张薄片上,通过进一步向该第2张薄片上缓慢地滴新培养液,可以以与第1张薄片重合的状态伸展第2张薄片。反复进行相同的技术,逐渐层叠化细胞薄片。
心肌细胞薄片的功能分析(1)在体外的电活动向部分重叠的两张心肌细胞薄片上添加1ml的培养液,每天更换培养液,继续培养。在2天后,在显微镜下观察各薄片以相同的心率数自律收缩的情况,根据分别从心肌薄片的两端测得的心电图,确认了以相同的节律进行收缩(图4)。
(2)在体内的存活将两张重叠的大鼠心肌薄片移植到5周龄的裸大鼠的皮下,在1周后,切开皮肤,观察心肌薄片(图5)。肉眼确认了心肌薄片的节律性收缩。
(3)通过免疫组织染色的肌瘤宿(筋腫宿)蛋白、间隙连接(Gapjunction)的研究在体外,相对于大鼠心肌薄片制作2天后的组织,进行心肌细胞的作为代表性收缩蛋白的辅肌动蛋白和作为间隙连接的结构蛋白的连接蛋白43的免疫染色。结果显示在图6。另外,在体内,将2层的大鼠心肌薄片移植到3周龄的裸大鼠的皮下,7天后摘出,进行HE染色以及辅肌动蛋白与连接蛋白43的免疫染色。结果分别显示于图7和图8。确认了辅肌动蛋白和连接蛋白43的表达在体外、体内被良好地维持。另外,关于体内的模型,与体外的模型相比,可以确认正在形成心肌细胞的取向。另外,从HE染色所见可观察到微小血管正在向被移植的心肌薄片之间浸入并供给血流。
心肌细胞薄片的制作、移植、组织学分析和电活动分析材料和方法·心肌细胞薄片制作方法从Baxter公司购买テイシ一ル(含有人纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙、抗蛋白肽酶)。将人纤维蛋白原90mg、人白蛋白20mg、凝血酶0.4U、氯化钙2水合物0.59mg、抗蛋白肽酶3000U稀释到15ml的生理盐水中,其中将0.3ml涂布于35mm培养皿上。约2小时后可以得到表面被涂敷了纤维蛋白聚合物的培养皿。该培养皿可以在4℃下无菌保存1个月左右。可以用以往方法从生后1天龄的Wistar大鼠新生鼠仔的心室肌得到心肌细胞(Kodama H,Fukuda K,Pan J et al.Leukemia inhibitory factor,a potentcardiac hypertrophic cytokine,activates the JAK/STAT pathway in ratcardiomyocytes.Circ Res.1997;81656-663.)。以(2.8×105/cm2)的密度,将得到的心肌细胞播种到已涂敷了纤维蛋白的培养皿上。(图9A、B、G)。己聚合的纤维蛋白被培养细胞分泌出的非特异性蛋白酶缓慢分解,在培养开始后3~7天,细胞与培养皿表面之间的接触逐渐变粗(图9C)。
因而,在第4天,使用细胞刮子从培养皿表面剥离心肌成为可能,可以得到心肌细胞薄片(图9D、H)。已皱缩的心肌细胞薄片通过浮游在培养液中而伸展(图9E、I),然后被切成正方形的形状。为了之后的分析,部分地重叠两张心肌细胞薄片(图9F、J),用以前的方法(Murata M,FukudaK,Ishida H et al.Leukemia inhibitory factor,a potent cardiac hypertrophiccytokine,enhances L-type Ca2+ current and [Ca2+]i transient incardiomyocytes.J Mol Cell Cardiol.1999;31237-245.),在涂敷了层粘连蛋白(laminine)的培养皿上进行共培养1~3天。
·心肌细胞薄片移植物向成熟大鼠皮下组织的移植全部实验技术遵守“庆应大学动物照料和使用委员会和遵守NIH的实验室动物的照料和使用的管理”(the Animal Care and Use Committeesof the Keio University and conformed to the NIH Guide for the Care and Useof Laboratory Animals)的原则进行。吸入二乙醚之后,将1%盐酸普鲁卡因5~10ml局部注射到雄F344裸大鼠(8周龄,n=10)的背部皮下,切开皮肤。在同一部位移植重叠了三层的心肌细胞薄片。
·组织学分析使用抗纤维蛋白抗体(Monosan,Netherland)、抗α-辅肌动蛋白抗体(Sigma)、连接蛋白43抗体(Sigma),用以前的方法进行免疫组织染色(Agbulut O,Menot ML,Li Z et al.Temporal patterns of bone marrow celldifferentiation following transplantation in doxorubicin-inducedcardiomyopathy.Cardiovasc Res.2003;58451-459.)。利用アレキサ488标记抗小鼠IgG抗体(Molecular Probes)或TRITC标记抗兔IgG抗体(Dako),对这些样品进行二次染色。在几个实验中,利用アレキサ488标记鬼伞素(phalloidin)进行染色(Molecular Probes)。利用TOTO-3(Sigma)进行细胞核染色。用共焦点激光显微镜观察已染色的样品(LSM510,Zeiss)。
·利用光学绘图系统(Optical mapping system)对心肌薄片的电活动的分析以2mm的宽度相互重叠两张心肌细胞薄片。使用1组双极电极,分别在心肌薄片的两端测定细胞外电位。
通过使用了细胞膜电位敏感性色素di4-ANEPPS(Molecular probes)的光学绘图系统,记录方向性的活动电位的传播,评价两张重叠的心肌薄片之间的活动电位的传播。
将di-4-ANEPPS的保存用溶液20mM溶解于含有20%pluronic F-127(P-3000,Molecular probes)的DMSO中,在培养液中稀释并使di-4-ANEPPS的终浓度为10μM。将样品放置在37℃的孵箱内30分钟,然后用蒂罗德液(Tyrode’s resolution)(NaCl 140、KCl 4、MgCl20.5、CaCl21.8、HEPES 5、D-葡萄糖55mmol/L、(用NaOH将pH调节成7.4)和100mg/L BSA)置换培养液。将装有心肌细胞薄片的培养皿安装在恒温灌流装置(37℃)上,放在荧光显微镜的载物台(stage)上。(BX50WI,Olympus,Japan)高析像度CCD照相机系统(MiCAM01,Brain Vision,192×128 points,3.5毫秒时间分辨力(time resolution)),以610nm以上的激发波长、520nm的兴奋波,记录来自样品的信号。心肌薄片在细胞松弛素(cytochalasin)-D(25μM)的作用下不动化。在自律搏动下和通过双极氯化银电极的起搏刺激下,记录活动电位。用以前(Koura T,Hara M,Takeuchi S et al.Anisotropic conduction properties in canine atria analyzed byhigh-resolution optical mappingpreferential direction of conduction blockchanges from longitudinal to transverse with increasing age.Circulation.2002;1052092-2098.)的方法,通过使用Igor Pro software(Wavemetrics)制作的独自的分析程序处理得到的数据。
结果
·利用涂敷了纤维蛋白的培养皿制作的心肌薄片的组织学分析在分析利用本方法得到的心肌薄片时,本发明人等在将心肌细胞播种到纤维蛋白培养皿上后经过了各种时间的时点,进行使用细胞刮子的薄片制作(图10)。在3天之后可以从培养皿剥离心肌细胞薄片。剥离之后的直径与原来的培养皿相比,收缩到了38±3.6%(n=30)。在普通的培养皿、涂敷了明胶(gelatin)、层粘连蛋白(laminine)、纤连蛋白(fibronectin)的培养皿上培养心肌细胞,长满(confluent)后,尝试用同样的技术,使用细胞刮子剥离细胞,但在这些情况下不可能薄片状回收细胞(没有显示数据)。在本实验中,本发明人等将从原代培养开始到制作薄片为止的天数定义为PX days,从薄片制作开始到采集数据为止的天数定义为SXdays。在从原代培养开始4天后制作的心肌薄片的底面(P4-S0)可见残存纤维蛋白。但是,在从原代培养开始6天后制作的心肌薄片(P6-S0)可见残存纤维蛋白。
在P4-S1的心肌薄片之间可见尚残存的纤维蛋白。但是,在进一步继续培养2天之后的P4-S3的心肌薄片中,纤维蛋白完全消失。有趣的是,明确了当向培养液中添加600KIU/ml的抗蛋白肽酶时,相当量的纤维蛋白没有分解,在心肌薄片之间继续残存(H-K)。这些实验结果表明心肌薄片内的残存纤维蛋白完全分解需要6天。
·利用纤维蛋白涂敷培养皿制作的心肌薄片的性质首先,研究从心肌细胞的原代培养开始到心肌薄片制作为止的理想的天数(图11)。制作心肌薄片时的成功率从3天后上升,在第4天达到峰值(成功率100%,各n=12)(图11A)。得到的心肌薄片的直径根据从原代培养开始到薄片制作为止的期间,通过细胞密度的增加或细胞的伸展的机制而缓慢舒张(图11B)。接着,在从薄片制作后开始继续培养3天的时点,对在自原代培养的不同期间制作的心肌薄片显示自律搏动的比率进行调查。从原代培养开始到薄片制作为止的天数(PX)对心肌薄片的自律搏动重新开始率没有影响。但是,在从原代培养开始第4天设定心肌薄片制作(P4),在薄片制作后继续培养时,观察从何时开始自律搏动,结果与薄片制作后第2天开始,显示大幅度的自律搏动出现率的增加,进而在第6天(S6),100%的心肌薄片显示自律搏动(6days SX;图11C、D)。检测心肌薄片是否对起搏刺激产生反应并显示节律性收缩,结果与S2相比,显示节律性收缩的比例开始增加,在S5时点达到100%(图11E)。图11F是在制作心肌薄片之后、经时观察显示律动收缩的心肌薄片的搏动周期(心率)的结果。从这些结果可以确定在此次使用心肌薄片进行电生理学分析时,使用P4-S3的心肌薄片。
·在分析活动电位的传播时对使用光学绘图系统和双极电极的方法的比较接着,分析在心肌薄片内的活动电位的传播情况,另外还分析活动电位在两张心肌薄片之间是否通过接合部传播。对使双极电极接触来记录心肌薄片的心电图的结果与利用光学绘图系统测量的活动电位的记录进行比较(图12)。在心电图上记录了A、B双方薄片同步进行自律搏动的情况。心电图上表明,薄片A和薄片B的QRS complex完全同步,两张心肌薄片之间确立了电结合。但是,与预想相反,在利用光学绘图系统对活动电位的记录中,记录了活动电位从薄片A的左下方向右上方行进,通过接合部的上部,向薄片B传播,扩张到薄片B内的情况。即,表明活动电位在两张薄片的接合部不是直线传播最短距离。表明图12D中的箭头上的活动电位传导速度在薄片间的接合部没有延迟而顺利地传播(图12E)。因而,表明在分析心肌薄片的活动电位的传播、心肌薄片之间的电结合的情况时,光学绘图系统是唯一的有用性高的方法。
·两张心肌薄片间确立电结合的过程为了调查在两张心肌薄片之间是否确立了电结合,本发明人等利用光学绘图系统对部分重合的心肌薄片中的活动电位的传播情况进行分析。在P4-S1的心肌薄片之间,活动电位并没有从一个心肌薄片向另一个心肌薄片传播(图13)。有趣的是,在几个情况中(3/10),在薄片B中可见捕捉到了部分活动电位(图13D中的箭头)。图13F表示用等时线显示活动电位的传播情形。另外,在图中线(line)上,兴奋波的前头行进时的传导速度被显示在图13G,可知活动电位的行进在t点停止。
这些实验结果表明,尽管在P4-S1的心肌薄片中,电结合被局限地形成,但在两张薄片之间还没有确立稳定的电结合。
另一方面,在P4-S3的心肌薄片中,活动电位从薄片A到薄片B无传导延迟地传播(图14)。在全部实验样品中,在两张心肌薄片之间,形成了良好的电结合(n=10/10),在传导速度的分析中,也未见传导延迟。这些结果可能表明为了在已重叠化的心肌薄片之间形成稳定的电结合,需要3天(S3)以上的共培养期间。
·与两张心肌薄片的结合有关的组织学研究(在生物体以外的模型中)将P4-S3的心肌薄片的荧光免疫染色像显示在图15。在心肌细胞内可见明显的横纹结构。在心肌细胞的接合部存在Cx43。心肌细胞之间接触会引起横纹结构朝向相同的方向。两张重叠化的心肌薄片的厚度为约15±2μm。两张薄片完全结合,不能分出两张薄片的边界。
·重叠成三层的心肌薄片的生物体内移植模型及其组织学研究将重叠化为3层的心肌薄片移植到裸大鼠的皮下,14天后进行观察,显示强有力的周期性收缩(图16)。用HE染色和azane染色显示,被移植的心肌薄片被宿主来源的结缔组织上下覆盖(图16B、C)。心肌薄片的厚度为102±11μm,与在体外继续培养3层心肌薄片相比,变得更厚。利用共焦点激光显微镜的观察发现,每个心肌细胞的大小比体外的情形大。进而在被移植的心肌薄片内可见丰富的新生血管(图16D)。这些血管系在10~25μm时,不是毛细血管的水平,而具有微小血管水平的直径。心肌细胞内的横纹结构很发达,在心肌细胞的分布中可见朝向同一方向的取向(图16E)。从这些所见可以认为使用纤维蛋白涂敷的培养皿制作的心肌薄片在组织中的存活性良好,具有与正常组织相似的组织结构,具有良好的收缩能力。
研究自从使用涂敷了PIAAm的敏感性培养皿制作细胞薄片的技巧被报道以来,作为各种脏器中的二维或三维组织工程的方法之一,细胞薄片工程被发展起来。结果,目前细胞薄片工程在再生医疗的领域占有重要的位置。至今已报道了使用温度敏感性培养皿,利用血管内皮细胞、肝细胞、肾上皮细胞、角膜细胞等制作细胞薄片的报道(Shimizu T,Yamato M,Kikuchi Aet al.Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstruction.Biomaterials.2003;242309-2316.)。
此次本发明人等报道的方法具有几个特征。其一是,不需要特别的设备,可以仅通过使用容易得到的纤维蛋白轻松地制作细胞薄片。因而,可以不需要特别的技巧而制作理想尺寸的、各种形状的细胞薄片。第2个特征是指可以利用粘附系细胞的所有种类的细胞制作细胞薄片。这是因为,即使是难以粘附通常的细胞培养皿或涂敷了纤连蛋白的培养皿那样的细胞,也对涂敷了纤维蛋白的培养皿显示极好的粘附性。第3个特征是快速制作细胞薄片成为可能。开发本方法的当初担心在用细胞刮子薄片状回收细胞时,心肌薄片的细胞结构可能会被破坏。但是,利用显微镜观察时,没有观察到明显的细胞的坏死像等。推测其原因在于随着从心肌细胞分泌的非特异性蛋白分解酶分解纤维蛋白,细胞与培养皿的粘附逐渐缓解,另外,还猜想少量残存的纤维蛋白起到保护细胞免受回收细胞时的物理刺激的像缓冲垫(cushion)那样的作用。本发明人等确认了自进行心肌的原代培养之后总计第7天,残存纤维蛋白完全消失。但是,关于此期间,有可能会随着细胞自身分泌的蛋白分解酶的性质或长满时的细胞密度等而发生变动。
在生物体内,作为从肝脏分泌的具有强有力的蛋白分解作用的酶,很明确的是纤溶酶(Ritchie DG,Levy BA,Adams MA et al.Regulation offibrinogen synthesis by plasmin-derived fragments of fibrinogen and fibrinanindirect feedback pathway.Proc Natl Acad Sci USA.1982;791530-1534.)。因而,在从培养皿剥离细胞薄片的时点,即使心肌薄片内存在残存纤维蛋白,在移植后,生物体内的纤溶酶也会使残存纤维蛋白消失。综上所述,此次显示的结果表明,利用涂敷了纤维蛋白的培养皿制作各种细胞薄片的技术在心肌细胞薄片工程中是现实且简单的方法。
为了使用心肌薄片作为在心肌组织工程的领域有用的移植物,需要心肌薄片内或心肌薄片间的活动电位的扩张、传导良好。关于这一点,光学绘图系统作为详细地研究活动电位的扩张的方法是极为有用的。通过使用光学绘图系统的分析,在显微镜下完全被确认为同步收缩的两张心肌薄片也显示了借助在其结合部形成良好的电结合的一部分区域,活动电位的扩张迂回传播。因而,当分析将心肌薄片移植到心脏时的宿主与移植物之间有无电结合时,利用光学绘图系统的电生理研究是极为有用的。此次实验表明,为了在两张心肌薄片之间形成充足的电结合,需要3天时间。同样,研究通过使用光学绘图系统来研究在心肌薄片移植模型中形成电结合的过程的实验正在进行中。
作为结论,此次显示的心肌薄片制作方法和心肌薄片的电生理分析方法会给在心脏及其它脏器方面的再生医学领域带来极大进步。
细胞的薄片化(1)角膜上皮细胞薄片的制作按照下述步骤,在涂敷到组织培养皿(IWAKI)上的纤维蛋白薄片上制作角膜上皮细胞薄片。
1)用棉棒擦去兔的角膜后弹性层和虹膜,切下结膜。
2)分为12份,使上皮朝下,放置在涂敷了纤维蛋白的内孔(inner well)上。
3)加入已添加了666KIU/ml的抗蛋白肽酶的0.6ml SHEM。如果产生上皮,则使SHEM(添加666KIU/ml的抗蛋白肽酶)为1ml。
4)将培养3T3细胞的DMEM+FCS(+)变更为2ml SHEM(添加666KIU/ml的抗蛋白肽酶)。
5)上皮长满之后(直到长满需要1~2周),进行空气提升(air lift)(1周左右)。培养基为SHEM,但不添加抗蛋白肽酶。
6)用刮子剥离培养的上皮。
图17表示用光学显微镜观察在纤维蛋白薄片上培养的兔角膜上皮细胞的情形(×100倍)。图18表示用刮子剥离的培养上皮薄片的照片。可以从在纤维蛋白薄片上培养的兔角膜上皮细胞开始,通过进行3T3共培养和空气提升制作具有厚度的上皮薄片。
(2)口腔粘膜上皮细胞薄片的制作按照下述步骤,在涂敷到组织培养皿(IWAKI)上的纤维蛋白薄片上制作口腔粘膜上皮细胞薄片。
1)采集兔的口腔粘膜(采集两处2mm×2mm×1mm)2)清洗组织(在添加了庆大霉素和抗生素-抗真菌剂的培养基中15分钟×3次室温(RT)、在添加了抗生素的PBS(-)中15分钟室温)。
3)进行DispaseII处理(37℃1小时)。
4)从实质剥离上皮,加到DMEM/F12+FCS(-)中。
5)进行胰蛋白酶-EDTA处理(8分钟室温)。
6)以1500rpm离心5分钟(以2×105个/1ml SHEM(添加666KIU/ml的抗蛋白肽酶),播种到内孔中)。
7)将培养3T3细胞的DMEM+FCS(+)变更为2ml SHEM(添加666KIU/ml的抗蛋白肽酶)。
8)上皮长满之后(直到长满需要1~2周),进行空气提升(air lift)(1周左右)。培养基为SHEM,但不添加抗蛋白肽酶。
9)用刮子剥离培养的上皮。
图19表示用光学显微镜观察在纤维蛋白薄片上培养的兔口腔粘膜上皮细胞的情形(×100倍)。图20表示用刮子剥离的培养上皮薄片的照片。可以从在纤维蛋白薄片上培养的兔口腔粘膜上皮细胞开始,通过进行3T3共培养和空气提升制作具有厚度的上皮薄片。
(3)纤维蛋白薄片培养的Amex包埋固定法按照下述步骤,利用Amex法包埋上皮薄片。
1)将上皮薄片加入到筛网(mesh)中。
2)加入到4℃的丙酮中。
3)连同丙酮一起移至-20℃中,固定一个昼夜。
4)换加4℃的丙酮,浸透15分钟。
5)换加室温的丙酮,浸透15分钟。
6)换加苯甲酸甲酯,浸透15分钟。进行该操作2次。
7)换加二甲苯,浸透15分钟。进行该操作2次。
8)浸透石蜡1个小时。进行该操作3次。
9)用石蜡包埋。
(4)纤维蛋白薄片培养的免疫染色对兔的角膜组织、口腔粘膜组织、培养角膜上皮、培养口腔粘膜上皮的样品,按照下述步骤,对用Amex包埋法制作的石蜡切片进行免疫染色。
1)用3%H2O2在室温下处理30分钟。
2)在室温下进行1个小时封闭(10%正常驴血清-1%BSA-0.01MPBS)。
3)与第一抗体(AE5;PROGEN 618071/1000)反应。同型对照(Isotypecontrol)(小鼠IgG1Dako1/500)0/N
4)室温下与第二抗体(Donkey anti Ms IgG-FITC、Jackson711-095-1521/50)反应30分钟。
5)室温下进行5分钟核染色(DOJINDO1μg/ml DAPI)。
图21表示兔角膜上皮细胞组织和口腔粘膜上皮组织的免疫染色(AE5)的情形。蓝色核染色(DAPI)。绿色AE5染色(角蛋白3/12)。对作为阳性对照的角膜和口腔粘膜的上皮的角蛋白3/12进行染色的结果,上皮细胞均显示着色性(图21B和D)。
图22表示兔角膜培养上皮细胞和口腔粘膜培养上皮细胞的免疫染色(AE5)的情形。在培养上皮中,角膜上皮重叠化,被角蛋白3/12染色(兔22B和D)。在口腔粘膜上皮中可见重叠化,角蛋白3/12的染色虽然少但还是被染色了。
从上述可知,在纤维蛋白薄片上培养的兔角膜上皮、口腔粘膜上皮出现重叠化,表达角蛋白,这表明可以制作具有与正常组织相近的特性的培养上皮。
在本说明书中引用的全部发行刊物、专利和专利申请被直接作为参考引入到本说明书中。
工业上的可利用性通过使用以本发明的方法制造的细胞薄片,可以制作各种病态(例如心肌细胞中的心律不齐)的分析模型,还使在再生医疗等临床水平进行组织移植成为可能。另外,通过使用以本发明的方法制造的细胞薄片,可以进行药剂的生物学活性试验,所以可以挑选具有需要的生物学活性的医疗、农药等候补物质。
权利要求
1.一种组合物,是用于对在细胞薄片制作中使用的支撑体的表面进行涂敷的组合物,其中,含有纤维蛋白原和凝血酶。
2.一种细胞薄片制作用支撑体,其中,表面被纤维蛋白所涂敷。
3.一种细胞薄片的制造方法,其中,包括在表面被纤维蛋白涂敷的支撑体的表面上将细胞培养到成为饱和状态,继续培养充分时间直至细胞底面的纤维蛋白被分解,然后从支撑体表面将培养的细胞剥离成薄片状。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,包括进一步层叠化已剥离成薄片状的培养细胞。
5.根据权利要求3或4所述的方法,其中,细胞薄片被用于再生医疗或药剂的生物学活性试验。
全文摘要
本发明提供一种细胞薄片的制造方法,它包括在表面被涂敷纤维蛋白的支撑体的表面上培养细胞直至细胞达到饱和状态,继续培养一段充分的时间以使细胞底面的纤维蛋白被分解,然后将培养的细胞从支撑体表面剥离成薄片状。进而,本发明还提供一种表面被纤维蛋白涂敷的细胞薄片制作用支撑体。本发明还提供一种上述组合物,是用于对在细胞薄片制作中使用的支撑体的表面进行涂敷的组合物,其中的支撑体用于制作细胞薄片,其特征在于,含有纤维蛋白原和凝血酶。可以使用由市售的且被确保安全性的熟悉的材料涂敷的支撑体,通过简单的操作制造细胞薄片。
文档编号C12N5/00GK1852972SQ20048002702
公开日2006年10月25日 申请日期2004年3月25日 优先权日2003年9月19日
发明者福田惠一, 板桥裕史, 坪田一男 申请人:学校法人庆应义塾
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