包含非抗生素抗性选择标志物的选择系统的制作方法

专利名称：包含非抗生素抗性选择标志物的选择系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的选择系统，其基于araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段作为选择标志物的使用，并且涉及araD基因缺陷的细菌菌株的用途。本发明进一步涉及包含araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段的新载体，并且涉及araD基因缺陷的新的细菌菌株。本发明另外涉及选择用质粒转化的细胞的方法，所述质粒包含目标基因。
背景技术：
对于在细胞培养物中增殖的细菌和其它细胞的有效遗传工程改造的必需要求是选择具有特定基因型改变的细胞的能力。在重组DNA技术中最普遍的选择策略是在克隆载体或质粒中包括选择标志物。选择标志物可以是克隆的基因或DNA序列，其允许包含选择标志物的宿主细胞从不包含它的细胞中分离出来。选择标志物与合适的选择培养基一起将克隆载体保持在细胞中。另外，由于质粒的复制对于细菌宿主来说是一种能量负担，在细菌的生长培养物中，已经丢失了质粒的细菌将比具有质粒的细胞具有生长优势。
对于大多数目的来说，抗生素抗性基因是一种常用的选择标志物。不过，对于重组治疗剂的生产来说，其中目标是以高产量产生一种产物，诸如DNA疫苗用于患者中的施用，使用抗生素抗性基因出现问题抗生素抗性病原体的蔓延是严重的世界范围问题[Levy，S.B.，J.Antimicrob.Chemother.49(2002)25-30]。所以抗生素抗性基因不能在药物工业中具有广泛的用途，并且例如，按照美国食品与药物管理局的规定，在进入三期的实验性DNA疫苗中不允许抗生素抗性基因。
备选地，无抗生素的选择系统已经得到建议。这些无抗生素的选择系统包括细菌毒素-抗毒素系统[Engelberg-Kulka，H.和Glaser，G.，Annu RevMicrobiol 53(1999)43-70]，负责对抗重金属，诸如碲的基因[Silver，S.和Phung，L.T.，Annu Rev Microbiol 50(1996)753-789]，和其中质粒编码补足宿主营养缺陷型的基因的系统[Wang，M.D.等，J.Bacteriol.169(1987)5610-5614]。
美国专利申请2000/0014476 A1一般性地公开了，特别是，非抗生素选择标志物的使用，所述标志物可以是一种基因，其产物在某些培养条件下对于细胞的代谢是必需的，如异化作用基因，它使得细胞同化存在于培养基中的某些物质(特定的碳或氮源)等成为可能。没有给出这些合适基因的具体实例。这种方法并不一定可以用于商业生产，因为从生长培养基中缺失一种必需组分，诸如氨基酸或碳源减少了产量，这是不希望的。另外，就删掉一种必需养分来说生长培养基的处理可能会相当地提高生长培养基的成本，因为商业上现有的养分混合物必须由个别养分所替换。
对于商业治疗的目的而言，使用并非宿主生长所必需但其操作仍然影响在选定环境中生长的基因将是有利的。另外，考虑到治疗用途，使用这样一种基因将是有利的，所述基因的缺失导致对宿主细胞有毒性但对哺乳动物，包括人无毒性的化合物的积聚。使用较小的基因也将是有利的，其又将允许构建较小的质粒，对于所述质粒复制的能量消耗更小，因而细菌培养物生长速率和质粒产量得以提高。
发明简述本发明的目的是提供新的无抗生素选择系统，其避免了以往公开的用于生产重组治疗性产品的选择系统的问题。
本发明的另一个目的是提供新的无抗生素选择系统，其在环境和患者安全方面能够安全地用于重组治疗性产品的生产。
本发明的另一个目的是提供新的无抗生素选择系统，其能够利用标准生长培养基在成本上有效地用于重组治疗性产品的生产。
本发明的另一个目的是提供新的无抗生素选择系统，其提供增长的生长速率和提高的产量。
本发明的又一个目的是提供新的包含选择标志物的载体，其对于环境和人是无毒性的并且其能够长期保持在宿主中。
本发明的又一个目的是提供新的包含基因缺陷的宿主细胞，其对环境无害本发明的又一个目的是提供选择携带目标基因的细胞来生产重组治疗性产品的方法。
令人惊讶地发现通过使用araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段作为选择标志物和使用特异性的araD基因缺陷的细菌宿主可以达到本发明的目的。
因此，本发明提供包含araD基因缺陷的细菌细胞的新选择系统，将携带araD基因、其互补序列或其催化活性片段的载体添加到所述细胞中作为选择标志物。本发明的一个实施方案涉及一种选择系统，其中所述araD基因是araD基因或L-5-磷酸-核酮糖4-差向异构酶(EC 5.1.3.4.)。本发明的另一个实施方案涉及一种选择系统，其中所述araD基因是突变的。
本发明进一步提供新的载体，其包含araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段作为选择标志物。
本发明进一步提供新的细菌菌株，其是araD基因缺陷的。
本发明进一步提供选择用质粒转化的细胞的方法，所述质粒包含1)araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段作为选择标志物和2)目标基因，该方法包括将所述质粒插入到araD缺陷的宿主细胞中并且在含有阿拉伯糖的生长培养基中培养细胞。
附1显示大肠杆菌(E.coli)细胞使用阿拉伯糖作为碳源(Lin，1987)。
图2显示S6wtd1 EGFP的图谱。通过箭头表示d1 EGFP，E2和卡那霉素抗性标志物氨基糖苷-3′-O-磷酸转移酶(kana)的编码序列。通过实心盒表示另外的特征10E2BS-十个具有高度亲和性的BPV E2结合位点；CMV-tk-人巨细胞病毒即刻早期启动子和HSV Th基因引导序列；内含子-具有优化的SD和SA位点的兔β-珠蛋白基因内含子；tkpa-HSV Tk基因多聚腺苷化信号；RSV LTR-劳氏肉瘤病毒长末端重复；bgh pA-牛生长激素基因多聚腺苷化信号；pUCori-源自pUC18质粒的细菌复制起点。
图3显示S6wtd1EGFPkana/araD1的图谱。通过箭头表示d1 EGFP，E2，卡那霉素抗性标志物氨基糖苷-3′-O-磷酸转移酶(kana)和L-5-磷酸-核酮糖4-差向异构酶(araD)的编码序列。通过实心盒表示另外的特征10E2BS-十个具有高度亲和性的BPV E2结合位点；CMV-tk-人巨细胞病毒即刻早期启动子和HSV Th基因引导序列；内含子-具有优化的SD和SA位点的兔β-珠蛋白基因内含子；tkpa-HSV Tk基因多聚腺苷化信号；RSVLTR-劳氏肉瘤病毒长末端重复；bgh pA-牛生长激素基因多聚腺苷化信号；pUCori-源自pUC18质粒的细菌复制起点。
图4显示S6wtd1EGFPkana/araD2的图谱。通过箭头表示d1 EGFP，E2，卡那霉素抗性标志物氨基糖苷-3′-O-磷酸转移酶(kana)和L-5-磷酸-核酮糖4-差向异构酶(araD)的编码序列。通过实心盒表示另外的特征10E2BS-十个具有高度亲和性的BPV E2结合位点；CMV-tk-人巨细胞病毒即刻早期启动子和HSV Th基因引导序列；内含子-具有优化的SD和SA位点的兔β-珠蛋白基因内含子；tkpa-HSV Tk基因多聚腺苷化信号；RSVLTR-劳氏肉瘤病毒长末端重复；bgh pA-牛生长激素基因多聚腺苷化信号；pUCori-源自pUC18质粒的细菌复制起点。
图5显示S6wtd1EGFP/araD1的图谱。通过箭头表示d1EGFP，E2和L-5-磷酸-核酮糖4-差向异构酶(araD)的编码序列。通过实心盒表示另外的特征10E2BS-十个具有高度亲和性的BPV E2结合位点；CMV-tk-人巨细胞病毒即刻早期启动子和HSV Th基因引导序列；内含子-具有优化的SD和SA位点的兔β-珠蛋白基因内含子；tkpa-HSV Tk基因多聚腺苷化信号；RSV LTR-劳氏肉瘤病毒长末端重复；bgh pA-牛生长激素基因多聚腺苷化信号；pUCori-源自pUC18质粒的细菌复制起点。
图6显示S6wtd1EGFP/araD2的图谱。通过箭头表示d1 EGFP，E2和L-5-磷酸-核酮糖4-差向异构酶(araD)的编码序列。通过实心盒表示另外的特征10E2BS-十个具有高度亲和性的BPV E2结合位点；CMV-tk-人巨细胞病毒即刻早期启动子和HSV Th基因引导序列；内含子-具有优化的SD和SA位点的兔β-珠蛋白基因内含子；tkpa-HSV Tk基因多聚腺苷化信号；RSV LTR-劳氏肉瘤病毒长末端重复；bgh pA-牛生长激素基因多聚腺苷化信号；pUCori-源自pUC18质粒的细菌复制起点。
图7A和7B显示由生长于不同培养基中大肠杆菌菌株AG1δaraD中提取的S6wtd1EGFP/araD1(7A)和S6wtd1EGFP/araD2(7B)的质粒DNA的电泳分析。
图8显示由大肠杆菌菌株AG1δaraD中提取的S6wtd1EGFP/araD1和S6wtd1EGFP/araD2的质粒DNA的限制性酶切图谱分析。
图9显示在稳定性测定中S6wtd1EGFP/araD2的电泳分析。


图10A和10B显示在稳定性测定中S6wtd1 EGFP/araD2的限制性酶切图谱分析。
图11显示在发酵期间测量和登记的AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2的补料分批发酵的生长参数。缩写如下sPump＝进料速率；pO2＝氧浓度；Temp＝生长温度；mys＝理想的生长速率；OD＝于600nm上的光密度。
图12显示AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2的裂解和纯化方案。
图13显示克隆#13的araD基因座序列。
图14显示质粒p3hCG的图谱。
图15显示质粒paraDMgB的图谱。
图16显示质粒p3araD1hCG的图谱。
图17显示质粒p3araD2hCG的图谱。
图18显示具有被破坏的araD的大肠杆菌菌株的L-阿拉伯糖灵敏性的分析结果。
图19显示在具有不同葡萄糖浓度和阿拉伯糖浓度的M9和酵母提取物培养基中L-阿拉伯糖灵敏性的分析结果。
图20显示质粒p2MG C#11的图谱。
图21显示质粒paraD MG C#145的图谱。
图22显示含有sgbE基因的大肠杆菌基因组片段。
图23显示含有ulaF基因的大肠杆菌基因组片段。
发明详述本发明是基于发现备选的，无抗生素的选择系统的努力，所述系统可以用于生产体内施用的重组治疗性产品，尤其是用于生产DNA疫苗。令人吃惊地发现所述araD基因涉及原核和真核生物，如包括人类的哺乳动物的磷酸戊糖途径，可以成功地用作营养缺陷型宿主细胞中对于质粒的选择标志物。使用营养缺陷型具有不涉及使用或产生毒性物质的优点，所述毒性物质以后能够污染质粒制品。
基于araD/araC基因已经构建了一种有效的选择系统[Ariza，R.R.等，Carcinogenesis 14(1993)303-305]。不过，这种选择系统已经用于诱变机制的研究但在以前未用作质粒保持的选择标志物。Ariza等使用一种菌株，其中araC基因包含终止密码子并且araD基因被灭活。将编码抑制剂tRNA的supF基因的产物引入到质粒上。在活性抑制剂tRNA存在的情况下，产生来自araC的有酶学活性的产物，引发细胞生长阻滞(因为araD基因是失活的)。这种系统允许通过supF tRNA研究突变的抑制在supF被突变所灭活时，细胞能够在阿位伯糖的基础-上生长。所以，这种选择系统是基于araC基因上的并且不是基于araD基因上的。araD基因并未导入质粒中，系统也不是为质粒生产的目的而进行设计或赋予特征的。
araD基因编码负责将5-磷酸核酮糖差向异构为5-磷酸木酮糖的酶(图1)，所以允许将在磷酸戊糖途径中使用阿位伯糖[Engelsberg，E.等，J.Bacteriol.84(1962)137-146]。如果araD被灭活，5-磷酸核酮糖在细菌细胞中积聚导致生长阻滞。
如果araD的染色体拷贝在宿主细胞中被灭活，将完整拷贝的araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段插入质粒中，作为来自两种效应的结果实现在含有L-阿拉伯糖的培养基中含有质粒的细胞的生长优势。首先，含有质粒的细胞可以利用阿拉伯糖作为碳源，其次，毒性的5-磷酸核酮糖未积聚。这允许使用补充了阿拉伯糖的丰富生长培养基。在丰富培养基中大肠杆菌细胞快速生长并且质粒产量高。便宜的细菌生长培养基标准组分，如酵母提取物，可以用作氨基酸源。当体内施用所述制品时，理论上能够污染质粒制品的痕量5-磷酸核酮糖并不是问题，因为5-磷酸核酮糖能够有效地被人细胞代谢并且是无毒的。
使用araD基因的突变形式提供特别的优点。包含araD基因缺陷细菌细胞的本发明的选择系统产生最佳浓度的araD基因产物L-5-磷酸核酮糖4-差向异构酶以提供细菌的快速不受抑制的生长，向所述细胞中导入携带araD基因突变形式的载体作为选择标志物。通过使用选择系统获得类似的优点，所述系统含有携带完整的araD基因，但在araD基因座的其它地方包含缺失或突变的载体。
本发明的选择系统包含1)携带araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段作为选择标志物的载体和2)araD基因缺陷的特定细菌菌株，所述菌株中加入了载体。当在存在阿拉伯糖的情况下培养araD基因缺陷的特定宿主时，唯一存活的细胞是含有载体的细胞，其含有araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段。
在本发明的选择系统中可以采用任何普遍用于生产治疗性产品的表达载体，其中利用本领域公知的方法将araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段插入到载体中。在本发明的上下文中，araD基因优选包含由SEQ ID NO.1，由SEQID NO.19所标识的序列，或其可杂交的序列。不过，还希望包括任何可应用的araD基因。在本发明的上下文中，术语“araD基因的催化活性片段”是任何编码能够将5-磷酸核酮糖差向异构为D-5-磷酸木酮糖的多肽或蛋白质的基因片段。在本发明的具体实施方案中将araD基因、其互补序列，或其催化活性片段插入载体中，所述载体能够长期保持并且由此能够提供所需抗原的稳定表达。
在本发明的另一个具体实施方案中将araD基因的突变形式、其互补序列，或其催化活性片段插入载体中，所述载体能够长期保持并且由此能够提供所需抗原的稳定表达。
在本发明的特别优选的实施方案中，所用的载体是一种表达载体，其包含(a)与异源启动子操作性连接的编码核锚定蛋白的DNA序列，所述核锚定蛋白包含(i)结合特异性DNA序列的DNA结合结构域，和(ii)结合核组分的功能性结构域，或其功能等同物；和(b)形成核锚定蛋白结合位点的多聚的(multimerized)DNA序列，其中所述载体缺失乳头状瘤病毒复制起点，和(c)araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段。
这些载体已经在国际专利申请WO02/090558中进行过详细描述，在此将其并入作为参考。
最优选地用于本发明的选择方法中的载体是一种表达载体，其包含
(a)1型牛乳头状瘤病毒(BPV)的E2蛋白，和(b)作为簇并入载体中的多个BPV E2蛋白结合位点，其中所述位点可以是头-尾结构或者可以通过间隔定位包括入载体中，其中所述载体缺失乳头状瘤病毒复制起点，和(c)araD基因、其互补序列或其催化活性片段。
在本发明的选择系统中原则上可以采用任何已知的araD基因缺陷并且适用于生产治疗性产品的宿主。在本文中术语“缺陷的”表示一种宿主，其中araD基因被完全缺失或通过任何已知的方法灭活。
在本发明的优选实施方案中，使用大肠杆菌菌株，优选可商购的已经用公知方法缺失了araD基因的大肠杆菌菌株DH5α-T1，AG1或JM109，如在下面的实施例所述的那些。在本发明的另一个优选实施方案中，已经对大肠杆菌菌株，优选大肠杆菌菌株DH5α-T1，AG1或JM109进行联合缺失，以便缺失其它编码具有L-5-磷酸核酮糖4-差向异构酶活性的蛋白的基因。或者，可以采用可商购的大肠杆菌菌株，优选大肠杆菌菌株DH5α-T1，AG1或JM109，其中已经通过任何已知方法对araD基因和/或其它编码具有L-5-磷酸核酮糖4-差向异构酶活性的蛋白的基因进行灭活。在选择生产重组治疗性产品的携带目标基因的细胞的方法中，利用本领域众所周知的方法将所述目标基因插入araD基因和/或其它编码具有L-5-磷酸核酮糖4-差向异构酶活性的蛋白的基因缺陷的宿主细胞中，将所述细胞在培养性培养基和适于所述(in question)宿主的条件下培养于含有阿拉伯糖的生长培养基中。
可以使用任何适于培养大肠杆菌细胞的生长培养基。对于商业生产来说将自然地根据产量对生长培养基进行优化。合适的生长培养基的实例是可商购的生长培养基，诸如M9和LB(可以获自几个生产商，诸如Fermentas，Lithuania)。加在生长培养基中的阿拉伯糖的量不是关键的，但自然地阿拉伯糖应当以对于整个培养时期充足的量而存在。已经发现低至0.1％的量足以进行选择。典型地以大约0.1％到大约2.0％的量，优选以大约0.2％到大约1.0％的量，最优选以大约0.2％到大约0.5％的量向培养基中加入阿拉伯糖。不过在低至0.01％的浓度上观察到L-阿拉伯糖的效应并且L-阿拉伯糖可以在生长培养基中加到高达5％。在特别的实施方案中，其中L-阿拉伯糖被用作选择剂和用作有限的碳源，0.2％的L-阿拉伯糖是加入到生长培养基中的合适量。
本发明的选择系统适用于任何表达系统。它特别适用于意欲体内使用的重组治疗性产品，如DNA疫苗的表达，因为避免了与使用抗生素抗性基因相关联的问题。同样地本发明的选择系统适用于重组蛋白的生产。
源自制备过程的阿拉伯糖在最终产物中的可能污染是不重要的，因为阿拉伯糖是天然和作为添加剂存在于食物中的可食用糖并且因此对哺乳动物包括人类无毒。
此外，araD基因比常用的抗，例如，氨苄青霉素和四环素的抗生素抗性基因的大小更小，并且与卡那霉素和氯霉素抗性基因的大小相似。这提供了另外的好处，因为它允许构建小的质粒，其复制的能量消耗比大质粒更小。由此提高了细菌培养物的生长速率和质粒产量。
可以通过参照下列非限制性实施例更好地理解本发明，所述实施例作为本发明的示例而提供。给出下列实施例以便更加充分地阐释本发明的优选实施方案。不过，它们无论如何不应当被理解为限制本发明的广泛范围。
实施例1araD选择质粒的克隆为了克隆araD选择构建体，使用质粒S6wtd1 EGFP(图2)。它具有pMB1复制起点和卡那霉素抗性标志物作为质粒主链的功能元件。此质粒中的卡那霉素抗性是由源自大肠杆菌转座子Tn903的基因赋予的。
根据标准方法利用聚合酶链式反应(PCR)由大肠杆菌DH5α染色体扩增araD基因。将PCR产物用引物对s6araDL1+s6araDR1或s6araDL1+s6araDR1在两种不同的方向克隆入选定的质粒中，分别生成命名为araD1和araD2的产物s6araDL1CGCCATGGTTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTAGCACGAAGGAGTCAACATG(SEQ ID NO.2)；s6araDR1CGCCATGGACTAGTAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGTCAT
TACTGCCCGTAATATGC(SEQ ID NO.3)；s6araDL2CGCCATGGACTAGTTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTAGCACGAAGGAGTCAACATG(SEQ ID NO.4)；s6araDR2CGCCATGGAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGTCATTACTGCCCGTAATATGC(SEQ ID NO.5)；对引物进行这样的设计，从而使得来自质粒pBR322的P2启动子(用于在pBR322中驱动四环素抗性基因)和来自大肠杆菌trp操纵子的终止序列在PCR过程中分别加入到araD编码序列的上游和下游。
将814和815bp的PCR产物克隆入用HincII(Fermentas，Lithuania)线性化的pUC18载体中并通过利用通用测序引物M13F22GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA(SEQ ID NO.6)和M13R24GAGCGGATAACAATTTCACACAGG(SEQ ID NO.7)和araD特异性引物araDF311CCAACTCACCGGCTGCTCTATC(SEQ ID NO.8)，araD F614AATGCCGAAGATGCGGTGCATAAC(SEQ ID NO.9)，araD R700TAACTGCGGCGCTAACTGAC(SEQ ID NO.10)，和araD R421GGTTGCTGGAATCGACTGAC(SEQ ID NO.11)进行测序来验证正确的序列。
通过不同克隆的重组来修复扩增序列中的突变。
为了将araD克隆入S6wtd1EGFP中，通过用限制性酶PagI(位置4761)(Fermentas，Lithuania)部分消化将载体线性化并用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP；Fermentas，Lithuania)将DNA 5’-末端去磷酸化。用NcoI(Fermentas，Lithuania)将araD1和araD2片段从pUC18中切出并连接到S6wtd1EGFP/PagI上。
将两种连接混合物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中并接种到包含含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基的皿上并于37℃温育过夜。首先用菌落PCR分析菌落，其后分离DNA并用不同的限制性酶消化。
所述克隆得到质粒S6wtd1EGFPkana/araD1，S6wtd1 EGFPkana/araD2，其显示于图3和4中。
为了将卡那霉素抗性标记基因从质粒中除去，用限制性内切酶BcuI(Fermentas，Lithuania)消化S6wtd1EGFPkana/araD1和S6wtd1EGFPkana/araD2并将6473bp的载体片段进行自连接。
将连接混合物转化入大肠杆菌AG1ΔaraD菌株中(见实施例3)并接种到包含添加了2％L-阿拉伯糖的M9培养基的皿上并于37℃温育36小时。首先用菌落PCR分析菌落，其后分离DNA并用不同的限制性酶消化。所述克隆分别得到质粒S6wtd1EGFP/araD1，S6wtd1EGFP/araD2，显示于图5和图6中。
将含有S6wtd1 EGFP/araD1和S6wtd1 EGFP/araD2的细菌菌落于37℃培养在两种不同的培养基中添加了2.5％L-阿拉伯糖的LB和添加了0.2％L-阿拉伯糖的M9，伴随着剧烈摇动。收集细胞并利用QIAprep Spin小量制备试剂盒(QIAGEN)从细胞中抽提质粒DNA并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析(分别为图7A和7B)。
在用限制性内切酶PagI(Fermentas，Lithuania)消化之前和之后通过琼脂糖凝胶电泳分析来自LB和M9培养基中培养物的质粒DNA样品(图8)。在PagI消化物中获得的片段的预测大小对于S6wtd1EGFP/araD1是3954和2519bp而对于S6wtd1EGFP/araD2是4315和2157bp。使用以Eco91I消化的λDNA(图8C中的M15)和EcoRI/HindIII(Fermentas，Lithuania)消化的λDNA(图8C中的M3)作为分子量标志物。在限制性酶分析中所有分析的细菌克隆都含有正确的质粒，但是当质粒生长于LB培养基中时DNA产量非常低。当生长于添加了0.2％L-阿拉伯糖的M9培养基中时来自四个S6wtd1EGFP/araD2克隆中的两个被分析的细菌克隆(图8B中的#13和#14)具有较高的生长速率(图7和8)，这导致每个培养物更高的质粒产量。
对这些两个具有提高的生长的克隆实施进一步分析。如通过限制性分析所判定的，这两种质粒具有与其它质粒相同的结构。从细菌中抽提质粒并通过对araD基因座测序作进一步特征鉴定。克隆#13的araD基因座序列(SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19)显示araD基因编码序列在L-5-磷酸核酮糖4-差向异构酶的位置8中携带终止密码子而不是谷氨酰胺的密码子。这一突变产生自在L-5-磷酸核酮糖4-差向异构酶(araD编码序列)的密码子8(5′-CAG-3′)中胞嘧啶被胸腺嘧啶所替换，导致一个终止密码子(5′-TAG-3′)。在araD基因中携带这种突变的质粒有效地提供在L-阿拉伯糖存在时生长于选择性培养基中的能力，尽管所述编码序列包含终止密码子。已经证明当这种终止密码子在编码序列的起始处时，终止密码子UAG被大肠杆菌的核糖体有效地阅读通过[参见综述Murgola，E.J.，Annu.Rev.Genet.19(1985)57-80]。未被理论所束缚，我们假设高产量的质粒，其是细菌的快速、不受抑制的生长的指征，需要araD基因产物L-5-磷酸核酮糖4-差向异构酶的最佳浓度。
克隆#14araD基因座序列的分析显示araD编码序列与预期的完全一致。不过，观察到在araD启动子附近覆盖E2蛋白结合位点的序列重排(见图13，SEQ ID NO.18)。这些数据另外提示这些在启动子附近的重排可能会导致启动子活性的下调，因而导致araD产物水平的下调。
实施例2突变的araD选择质粒的克隆对于突变的araD选择构建体的克隆，用限制性核酸内切酶BcuI和HindIII来切割携带卡那霉素抗性(转座子Tn5衍生的卡那霉素抗性标记(neo)基因)的质粒p3hCG(图14)，使用Klenow片段(Fermentas，Lithuania)填充末端并且在琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中纯化4647bp大小的片段。用限制性核酸酶BcuI和Eco52I将pMB1复制起点和携带C到T突变的araD序列从质粒paraDMgB上切下来(图15)，所述C到T突变导致在araD基因编码序列的位点8的终止密码子，所述末端使用Klenow片段(Fermentas，Lithuania)进行填充，并且用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP；Fermentas，Lithuania)对DNA 5′-末端进行去磷酸化。在琼脂糖凝胶电泳后从凝胶中纯化1532bp大小的片段并且将其与上述获得的4647bp片段进行连接。用这种连接混合物转化大肠杆菌(Escherichia coli)AG1 araD缺陷型菌株并将其接种在包含选择性M9培养基的琼脂平板上，所述M9培养基具有0.5％的酵母提取物，2％的L-阿拉伯糖和25μg/ml的卡那霉素。在接种24小时后，检查所述菌落，并显示菌落的大小是均一的。从细菌中抽提质粒并且通过对araD基因座位进行测序来进一步鉴定。
克隆得到了质粒p3araD1hCG和p3araD2hCG，其分别显示在图16和17中。按照序列分析，细菌包含未重排的质粒，所述质粒在密码子8中具有突变C到T(p3araD1hCG；图16；p3araD2hCG，图17)。
当用野生型序列重复该实验并在转化24小时后检查转化的平板时，结果是不同的。观察到两种类型的菌落第一，大尺寸的菌落，和具有延迟生长的小菌落。这些质粒的序列分析显示araD基因编码序列携带终止密码子取代谷氨酰胺的密码子(质粒#3A，araD2)或突变已经发生在核糖体结合位点中的SD序列中(AGGAG被AGTAG所取代)(质粒#2A，araD2)。质粒#7(araD1)在所有的araD基因座位区域中具有正确的序列，然而，当被培养在液体培养基中时，细菌生长得非常缓慢并导致了低10倍的质粒产量。
实施例3构建阿拉伯糖敏感型的ΔaraD大肠杆菌菌株将三株大肠杆菌菌株，DH5αT1，AG1和JM109用于构建ΔaraD突变体。使用Datsenko和Wanner[PNAS 97(2000)6640-6645]描述的方法来断裂大肠杆菌基因组中的araD基因。这种方法使用噬菌体λRed重组系统。简而言之，该系统的策略是用可选择的抗生素抗性基因取代染色体序列，其通过使用具有同源延伸的引物以PCR产生。这可以在这些旁侧同系物中通过Red-介导的重组实现。
对于编码噬菌体λ重组系统的pKD46(Datsenko和Wanner，见上文)的转化，使用下列RF1和RF2溶液来用化学方法使大肠杆菌，细胞处于感受态RF1 100ml
RF2 100ml
将细胞培养在2ml的LB培养基中到OD6000.2-0.5。将培养物进行离心并将沉淀重悬于1ml的RF1中。将混合物置于冰上10分钟并进行离心。将沉淀悬浮在100μl的RF2中并将混悬液置于冰上达30-45分钟。加入约50ng的pKD43并将细胞保持在冰上另外30分钟，随后于37℃热休克5分钟。在冰上温育10分钟后，将900μl的SOB培养基加入转化的细胞并将混和物于37℃温育1小时。将细胞接种在包含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上。从转化的平板上选择菌落并将其培养在2ml的相同培养基中到OD600约为1并制备甘油贮存液(2ml培养物+0.6ml 50％甘油)。将所述贮存液贮存于-80℃。
对于araD基因的断裂，产生了包含卡那霉素抗性基因的线性PCR产物。将质粒pKD 13(Datsenko和Wanner，PNAS vol.97，no 12，June 2000)用作PCR模板。使用的引物是ara(pr1)和ara(pr4)ara(pr1)5′-CTCAAACGCCCAGGTATTAGAAGCCAACCTGGCGCTGCC-AAAACACGTGTAG GCTGGAGCTGCTTC 3′(SEQ ID NO.12)ara(pr4)5′-GGTTTGATCACAAAGACGCCGCGCTCGCGATCAACGGCGC-ATTCCGGGGAT CCGTCGACC 3′(SEQ ID NO.13)这些引物与pKD13具有互补序列以在PCR中进行退火，与araD基因具有互补序列以进行同源重组。
所述PCR反应混合物如下PFU天然缓冲液(5μl)，10mM dNTP(5μl)，引物ara(pr1)10μM(1μl)，引物ara(pr4)10μM(1μl)，pKD13 100ng(2μl)，DMSO(4μl)，PFU 2.5U(1μl)，和mQ水补到50μl。
PCR程序如下变性45s，96℃，退火45s，50℃，合成2min 30s，72℃，25个循环。获得的PCR产物是1.4kb。
同时进行5个反应；使用超纯纯化试剂盒(MoBio Laboratories Inc.)从2％的琼脂糖凝胶上纯化DNA并用60μl的水进行洗脱。用乙醇沉淀浓缩DNA并将其溶解在5μl水中。最终浓度是0.6μg/μl。将1.5μl的等份用在一次电穿孔中。
将PCR产物电穿孔到DH5α T1 pKD46，AG1 pKD46(Datsenko和Wanner，见上文)，和JM109pKD46大肠杆菌细胞中。首先，用DH5αT1pKD46，AG1 pKD46，和JM109 pKD46大肠杆菌细胞的过夜培养物接种包含用于诱导重组系统的10mM L-阿拉伯糖和100μg/ml的氨苄青霉素的200ml YENB培养基。将培养物培养在30℃直到OD600为0.8(DH5αT1和JM109)和0.6(AG1)。通过于4℃在4000g离心10分钟来收集细菌，用20ml无菌水来洗涤2次用包含10％甘油的20ml的无菌水来洗涤1次。将细胞悬浮在包含10％甘油的300μl中。将40μl感受态细胞用在一次电穿孔中。
使用0.2cm的比色杯和2.5kV以BioRad大肠杆菌脉冲发生器来进行电穿孔。将纯化的PCR产物(1.5μl)加入感受态细胞中，保持在冰上1分钟，在电穿孔后立即将2ml的温SOB培养基加入细胞并将混和物于37℃温育1小时。将细胞接种到包含卡那霉素(25μg/ml)的LB培养基上。将100pg的大卡那霉素抗性质粒(GTU-MultiHIV C-分化单位)用作阳性对照，不加入质粒作为阴性对照。对于阳性对照，转化效率对于AG1是106，对于JM109是107。在阴性对照板上没有菌落，在JM109+PCR产物板上获得215个菌落，在AG1+PCR产物板上获得70个菌落并且在DH5αT1+PCR产物板上获得50个菌落。
实施例4检验大肠杆菌DH5αT1ΔaraD，AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株通过使用引物araVlisF(5′CGGCACGAAGGAGTCAACAT3′；SEQ IDNO.14)和araVlisR(5′TGATAGAGCAGCCGGTGAGT3′；SEQ ID NO.15)进行菌落PCR来检验从如实施例2所述的电穿孔中获得的菌落的卡那霉素抗性基因的存在，所述引物在靠近插入位点包含araD基因上的退火位点。在没有插入araD的情况下，在大肠杆菌DH5αT1，AG1和JM109菌株中预期272bp的PCR产物，如果PCR产物已经被插入araD基因中，预期1545bp的产物。检查了DH5αT1ΔaraD的3个菌落和AG1ΔaraD的9个菌落和JM109ΔaraD的15个菌落中的14个菌落，并且每个都给出了1545bp的产物。因此得出结论这些菌株包含卡那霉素抗性基因的插入。
为了证实卡那霉素基因的插入，使用引物kanaSF(5′TCAGATCCTTGGCGGCAAGA3′；SEQ ID NO.16)和araVR(5′TGTAATCGACGCCGGAAGGT3′；SEQ ID NO.17)进行另一个菌落PCR。如果卡那霉素抗性基因已经被插入araD基因，这些引物产生435bp的产物。检验了来自AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株的6个菌落和来自DH5αT1ΔaraD菌株的3个菌落，并且都给出了正确的产物。
将AG1ΔaraD和JM109ΔaraD的6个菌落，和DH5αT1ΔaraD的3个菌落接种在包含25μg/ml卡那霉素的LB培养基上并在37℃温育过夜以消除pKD46质粒，所述质粒具有温度敏感型的复制起点。通过重复接种在LB培养基上和包含氨苄青霉素的LB培养基上来检验细胞的氨苄青霉素灵敏性。没有菌落生长在包含氨苄青霉素的培养基上并且得出结论细菌不再包含pKD46质粒。
在产生的AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株上检验阿拉伯糖灵敏性。将AG1ΔaraD的一个菌落和JM109ΔaraD的一个菌落每个都接种在2mlLB中。将培养物培养8小时，以1∶100稀释到包含0.2％甘油，25μg/ml卡那霉素，0.01％维生素B1(对于JM109ΔaraD，0.05％脯氨酸)的M9培养基中，并将不同浓度的L-阿拉伯糖加入生长培养基中。将培养物在37℃于振荡恒温箱中过夜培养并测量OD600(表1)。
表1检验阿拉伯糖的灵敏性
如可在表1中所见，低到0.1％的L-阿拉伯糖的量足以抑制本发明的ΔaraD菌株的生长。
如上，进一步在AG1ΔaraD，DH5αT1ΔaraD和JM109ΔaraD上检验阿拉伯糖的灵敏性，但是使用更低浓度的L-阿拉伯糖。在图18中给出结果。如在图18中可见，低到0.0005％的L-阿拉伯糖的量足以抑制本发明的ΔaraD菌株的生长。
另外，在具有不同葡萄糖和阿拉伯糖浓度(0.2％葡萄糖，0.2％阿拉伯糖，2％阿拉伯糖)的M9和酵母提取物培养基中检验L-阿拉伯糖的灵敏性。将所述培养物在振荡恒温箱中于37℃进行温育过夜。接着，测量OD600从而对细胞密度进行定量。在图19中给出结果。
两种浓度的阿拉伯糖(0,2％和2％)都抑制了本发明的ΔaraD菌株的生长。然而，具有完整araD基因的菌株的生长没有受到抑制。
另外，检验了ΔaraD菌株的质粒DNA的产量。将在实施例1中制备的质粒S6wtd1EGFParaD2转化到AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株中。如实施例3所述用RF1和RF2溶液制备感受态细胞。
将来自转化平板的菌落接种到包含0.5％酵母提取物和25μg/ml卡那霉素+0.01％维生素B1+L-阿拉伯糖(2％和0.2％)的2ml的M9培养基中。
将所述培养物在37℃培养17小时。接着测量OD600来量化细胞密度并用Qiagen小量制备试剂盒来抽提质粒DNA。将系数2.8(OD600/ml)用于小量制备分离从而得到可比较的结果。将结果显示于表2。
将DNA浓度用分光光度计测量为在260nm处的OD。对于显微镜分析，将一滴细菌培养物施用在玻璃载玻片上并用盖玻片覆盖。用油浸物镜以100倍放大来肉眼检查培养物。
表2ΔaraD菌株的质粒DNA产量
按照这些结果，0.2％的L-阿拉伯糖足以获得与2％阿拉伯糖相同水平的质粒拷贝数。
对于该质粒AG1ΔaraD似乎更好，因为质粒产量稍微更高些，并且细胞密度也是如此。
实施例5具有在潜在地编码L-5-磷酸核酮糖4-差向异构酶的基因中的另外突变的大肠杆菌菌株的产生大肠杆菌染色体在不同的操纵子中包含两个另外的L-5-磷酸核酮糖4-差向异构酶的编码序列。来自L-维生素C降解途径的ulaF和sgbE基因编码具有差向异构酶活性的基因(Wen Shan Yew，Jhon A.Gerlt，J.Bacteriol.184(2002)302-306。为了增加选择的严谨性并且为了避免或敲除由于具有差向异构酶活性的其它基因的大肠杆菌菌株的可能适应机制，大肠杆菌基因组中的UlaF和SgbE基因的编码序列被打断。这些适应机制可以在适合条件下，在长期的质粒产生过程中发生。
使用如实施例3所描述的噬菌体λRed重组系统，在大肠杆菌菌株DH5αT1ΔaraD和AG1ΔaraD中打断UlaF和SgbE基因。
首先，消除在大肠杆菌AG1ΔaraD和DH5αT1ΔaraD菌株中的卡那霉素抗性基因。FLP重组酶表达质粒pKD20(Datsenko和Wanner，见上文)是氨苄青霉素抗性和温度敏感型的。用pCP20(卡那霉素抗性基因在FRT侧翼)转化卡那霉素-抗性突变体，并且在30℃选择氨苄青霉素抗性转化体(48小时)，其后在42℃非选择性地纯化相同的菌落(24小时两次)。接着，对它们测试卡那霉素和氨苄青霉素抗性的丢失。
使用引物ulaFylem和ulaFalumulaFylemCAGCAGGTATTTGAAGCCAACATGGAGCTGCCGCGCTACG-GGCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.21)ulaFalumAAACGGCTGCGGAATTAGACCAGTTATCTCCCGAGGAAGGAAATTAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.22)，来进行噬菌体λRed重组系统对染色体ula F基因(SEQ ID NO.20)的灭活。
在两种转化板上都观察到了许多菌落。使用引物ulaFvalisR和ulaFvalisFulaFvalisRAAACGGCTGCGGAATTAGACC(SEQ ID NO.23)ulaFvalisFGCCGTACCTGATTGAGATGTGGAG(SEQ ID NO.24)通过菌落PCR检验了通过电穿孔获得的15个菌落的卡那霉素抗性基因的存在。
这些引物在靠近插入位点包含UlaF基因上的退火位点。在没有插入UlaF的情况下，在大肠杆菌DH5αT1ΔaraD和AG1ΔaraD菌株中预期864bp的PCR产物，如果PCR产物已经被插入UlaF基因中，预期1527bp的产物。为了证实卡那霉素基因的插入，使用引物ulaFvalisR(SEQ ID NO23)和kanaSF(SEQ ID NO 16)进行了另一个菌落PCR。
如果卡那霉素抗性基因已经被插入UlaF基因中，这些引物产生428bp的产物。检验了来自AG1ΔaraDΔulaF和DH5αT1ΔaraDΔulaF菌株的四个菌落并且所有的都给出了正确的产物。来自每个菌株的一个菌落被进一步使用。
如上述进行在大肠杆菌AG1ΔaraDΔulaF和DH5αT1ΔaraDΔulaF菌株中的卡那霉素抗性基因的消除。如实施例3中所述进行通过噬菌体λRed重组系统对噬菌体sgbE基因(SEQ ID NO.25)的灭活。所用的引物是sgbEalum和sgbEylemsgbEalumCGTTACAGCAAGGAACATATCAATTCGTAGTGCCGGGGCGATGAAGAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.26)sgbEylemGCAGGAGGCTGGATTTATATGTTAGAGCAACTGAAAGCCG-ACGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.27)在两种转化板上都观察到了许多菌落。通过使用引物sgbEvalisR和sgbEvalisFsgbEvalisRCGGCGTTACAGCAAGGAACATATC(SEQ ID NO.28)SgbEvalisFATTGAAGCGCGTATGCAGGAGG(SEQ ID NO.29)进行菌落PCR来检验通过电穿孔获得的15个菌落的卡那霉素抗性基因的存在。
在没有插入sgbE的情况下，在大肠杆菌DH5αT1ΔaraDΔulaFΔsgbE和AG1ΔaraDΔulaFΔsgbE菌株中预期792bp的PCR产物，如果PCR产物已经被插入SgbE基因中，预期1413bp的产物。为了证实卡那霉素基因的插入，使用引物sgbEvalisR(SEQ ID NO.28)和kanaSF(SEQ ID NO.16)进行了另一个菌落PCR检验了两株菌株的15个菌落并且有4个给出了正确的产物。
在产生的大肠杆菌DH5αT1ΔaraDΔulaFΔsgbE和AG1ΔaraDΔulaFΔsgbE菌株上检验了阿拉伯糖的灵敏性并且将它们与大肠杆菌DH5αT1ΔaraD和AG1ΔaraD菌株的那些进行了比较。将每株菌株的一个菌落接种到2ml的M9培养基中，所述M9培养基分别包含0.5％酵母提取物，25μg/ml的卡那霉素，仅0.2％葡萄糖或0.2％或2％L-阿拉伯糖。结果显示与表3。
表3阿拉伯糖灵敏性的检验
如从表3中可见，在本发明菌株中的阿拉伯糖灵敏性中没有实质上的不同。相似地，当如实施例3所述检验ΔaraD和ΔaraDΔulaFΔsgbE菌株的质粒DNA产量时(结果没有显示)，在大肠杆菌AG1ΔaraD和AG1ΔaraDΔulaFΔsgbE或DH5αT1ΔaraD和DH5αT1ΔaraDΔulaFΔsgbE菌株间没有发现不同。
实施例6S6wtd1 EGFP/araD2的稳定性疫苗接种载体的一个重要特点是在细菌细胞增殖中的稳定性。为了检验细菌中S6wtd1EGFP/araD2的稳定性，将质粒转化到在实施例3中制备的大肠杆菌AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株中并且在四代过程中，通过质粒DNA分析载体仍保持完整性。
将质粒S6wtd1 EGFP/araD2与感受态大肠杆菌AG1ΔaraD和JM109ΔaraD细胞混合，并将其在冰上温育30分钟。随后，将细胞混悬液在于冰上迅速冷却后，在37℃热休克3分钟。将1毫升LB培养基加入样品并且将混合物于37℃温育45分钟，伴随剧烈振荡。最终，将细胞的一部分接种到M9培养基皿上，所述M9培养基包含0.5％的酵母提取物，2％L-阿拉伯糖和25μg/ml的卡那霉素。次日，将来自一个菌落的细胞转移到包含相同培养基的新皿上。重复该过程直到细菌已经传代4次。将来自两个细菌菌株的每代的两个菌落用于接种2ml的包含0.5％的酵母提取物，2％L-阿拉伯糖和25μg/ml的卡那霉素的M9培养基中，并于37℃过夜培养，伴随剧烈振荡。收集细胞并使用QIAprep Spin小量制备试剂盒(QIAGEN)从细菌中抽提质粒DNA。通过琼脂糖凝胶电泳，与用于转化的起始的S6wtd1 EGFP/araD2 DNA(如在图9和图10中的对照)比较分析，用限制性核酸酶HindIII(Fermentas，Lithuania)消化之前(图9)和之后(图10)的质粒DNA样品。将EcoRI/HindIII(Fermentas，Lithuania)消化的λDNA用作分子量标志物(在图10中的M3)。
对于大肠杆菌AG1ΔaraD用HindIII消化的样品显示于图10A中，对于JM109ΔaraD菌株用HindIII消化的样品显示于图10B中，观察到图谱与起始的S6wtd1EGFP/araD2质粒DNA的相似。由HindIII消化所得到的片段的预期大小是3274，1688和1510bp。可以得出结论当在大肠杆菌AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株中增殖时，接种疫苗的载体S6wtd1EGFP/araD2是稳定的。
实施例7抗生素选择系统与本发明的L-阿拉伯糖选择系统的比较在抗生素选择系统与本发明的L-阿拉伯糖选择系统的比较中，使用下列培养基对于携带质粒p2MG C#11的大肠杆菌AG1培养基1M9培养基加0.5％酵母提取物，0.2％葡萄糖和25μg/ml的卡那霉素(选择培养基)；培养基2M9培养基加0.5％酵母提取物和0.2％葡萄糖(非选择培养基)；培养基3M9培养基加0.5％酵母提取物，0.2％L-阿拉伯糖和25μg/ml的卡那霉素(选择培养基)；和培养基4M9培养基加0.5％酵母提取物和0.2％L-阿拉伯糖(非选择培养基)。
对于携带paraD MG C#145的大肠杆菌AG1ΔaraD
培养基5M9培养基加0.5％酵母提取物，0.2％L-阿拉伯糖和25μg/ml的卡那霉素(选择性培养基)；和培养基6M9培养基加0.5％酵母提取物，0.2％葡萄糖和25μg/ml的卡那霉素(非选择培养基)。
将质粒p2MG C#11(图20)和paraD MG C#145(图21)转化到大肠杆菌AG1和在密码子8位上具有突变C-T的大肠杆菌AG1ΔaraD中。将被转化的细菌菌落在恒温箱中于37℃过夜培养。次日早晨，如上所示，将菌落接种到选择性和非选择性液体培养基中。将接种的培养物于摇床中培养于2ml各自的培养基中直到它们达到稳定阶段，并且在OD600测量培养物的密度。将质粒抽提自培养物中并且通过在260nm测量质粒DNA来确定质粒DNA的产量。质粒的产量以50μg产量对应于在260nm处为1的光密度的基础进行计算。
接着，将来自稳定培养物的20μl等份接种到新鲜培养基中(稀释100倍)，并将培养物进行培养直到稳定阶段(8-12小时)。在OD600测量培养物的密度，抽提质粒并测定产量，并再次将等份接种到2μl的液体培养基中。将该过程重复7次(制品(preparation)1-7)。实验的结果在下面的表5中进行提供。
表5.抗生素选择系统与本发明的L-阿拉伯糖选择系统的比较
由这些数据可以推断携带卡那霉素抗性基因并在卡那霉素存在时赋予大肠杆菌抗性的质粒在非选择性以及在选择性条件下的培养物的连续稀释/生长步骤中丢失。在第七个稀释循环上来自1ml培养物的质粒产量在选择性条件下降低3倍而在非选择性条件下降低10倍(在表5中，分别为制品1/1对1/7和2/1对2/7)。当携带具有卡那霉素抗性的质粒的大肠杆菌的碳源是L-阿拉伯糖而不是葡萄糖时，获得相同的基本结果(在表5中，分别为制品3/1对3/7和4/1对4/7)。不过，当将本发明的araD选择系统用于质粒中时，质粒DNA产量在选择性(在表5中制品5/1对5/7)和非选择性(在表5中制品6/1对6/7)条件下都高。在7个世代上在选择性和非选择性条件下质粒DNA产量都降低大约20％。这清楚地显示携带本发明的araD选择系统的质粒在选择性以及非选择性条件下要稳定地多并且有效地生长。
实施例8AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2的补料分批(fed-batch)发酵为了生产含有质粒的细菌的目的，还在补料分批发酵中对基于araD基因的选择系统进行检验。从AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2平板上挑取单个菌落并接种入250ml含有0.5％酵母提取物，0.2％L-阿拉伯糖和25μg/ml卡那霉素的M9培养基中并于37℃以剧烈振荡温育过夜。18小时后接种物的OD600为6.4。将160ml的接种物加入到含有5L FermenterStarting培养基(8g/l KH2PO4；10h/l NaCl；5g/l NH4Cl；5g/l酵母提取物；2g/l L-阿拉伯糖；2g/l MgSO4，25mg/l卡那霉素和0.1g/l维生素B1；用NH4OH调节至pH 6.7)的发酵罐中。在生长5.5小时后用发酵罐进料培养基(300g/l L-阿拉伯糖；150h/l酵母提取物；50mg/l卡那霉素；0.2g/l维生素B1)以0.15h-1的给定生长速度(允许碳源有限的生长)起始生长自动进料。根据公式F(t)＝myS*Sin/Sf通过计算机控制进料速度，其中myS是理想的生长速率，Sin是加到时间点上的碳源量而Sf是进料培养基中的碳源浓度。生长后测量OD600并为了质粒DNA取样品。在发酵期间记录的数据在表11中给出。当消耗了1L的进料培养基时终止发酵。最后的OD600为45。通过离心收集细菌团块并用2L STE缓冲液洗涤一次。细菌生物量的产量为410g湿重。质粒DNA含量的数据显示在表6中。
表6在AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2发酵过程中的质粒DNA的产量
表6中的数据显示L-阿拉伯糖选择系统在高细胞密度时工作地非常好。可能是因为通过使细菌更快地使用糖，在L-阿拉伯糖限制条件下，存在于细菌中的更多的质粒拷贝给出的优势。
实施例9AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2的纯化如下进行AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2的纯化(图12)a)进料制备按照Qiagen′s质粒纯化手册来制备清亮的裂解物，除了没有使用核糖核酸酶。
将200g的大肠杆菌细胞团重悬于2000ml的重悬缓冲液中，然后使用用于裂解和中和的等体积的P2和P3。通过于4℃在6000g离心30分钟来去除细胞碎片。通过纸巾，清亮的裂解物流出，加入1/10的10％TritonX-114(Sigma)，并将溶液置于冰上1小时(TritonX-114已经显示有效减少蛋白质中的内毒素的水平，Liu et al.，Clinical Biochemistry，1997)。一小时后，用0,6体积的冷异丙醇来沉淀核酸。将上清液倾去，并将沉淀过夜贮存于-20℃。
b)质粒DNA纯化按照Amersham Pharmacia的三步超螺旋质粒纯化方法来进行质粒DNA的纯化，其中采取了少部分的修改。
步骤1.将沉淀物再溶解于1500ml TE中(10mM Tris-Cl，1mM EDTA；pH 8.0)并加载于Sepharose 6FF(Amersham Pharmacia)上进行RNA去除和缓冲液交换，所述Sepharose 6FF之前用缓冲液A-2M(NH4)2SO4，100mMTris Cl，10mM EDTA，pH 7.5进行平衡。
步骤2.空体积被定向于质粒选择(Amersham Pharmacia)柱(用缓冲液A平衡)并且在用缓冲液B2(1,6M NaCl，2M (NH4)2SO4，100mM Tris Cl，10mM EDTA，pH 7.5)洗涤和洗脱后，捕获了超螺旋质粒DNA。
步骤3.用5体积的蒸馏的去离子水稀释被洗脱的质粒并将其加载于用缓冲液C1(0,4M NaCl，100mM Tris Cl，10mM EDTA，pH 7.5)平衡过的SOURCE 30Q(Amersham Pharmacia)。洗涤后，用缓冲液C2(1M NaCl，100mM Tris Cl，10mM EDTA，pH 7.5)洗脱纯化的质粒并收集洗脱峰。级分大小是150ml并且其包含100mg的无内毒素(＜10EU/mg)的S6wtd1EGFP/araD2质粒。
序列表<110>非特生物技术有限责任公司<120>新选择系统<130>2031002<160>29<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>780<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>1gtttcgtttg attggctgtg gttttataca gtcattactg cccgtaatat gccttcgcgc60catgcttacg cagatagtgt ttatccagca gcgtttgctg catatccggt aactgcggcg120ctaactgacg gcagaatatc cccatataag cgacctcttc cagcacgatg gcgttatgca180ccgcatcttc ggcatttttg ccccatgcaa acgggccgtg ggaatggacc agaacgccgg240gcatttgcgc tgcatcgata ccctgttttt caaaggtttc tacgatgacg ttaccggttt300cccactcata ttcgccgttg atttctgcgt cggtcatttt gcgggtgcag ggaatggtgc360cgtagaaata gtcggcgtgg gtggtgccgg ttgctggaat cgactgaccc gcctgcgccc420agatggtggc gtggcgcgag tgcgtatgca caatgccgcc aatggagggg aatgcctgat480agagcagccg gtgagttggc gtgtcggagg agggcttttt cgtaccttca accacttcac540cggtttcgat gctaaccacg accatatcgt cagcggtcat gacgctgtaa tcgacgccgg600aaggtttgat cacaaagacg ccgcgctcgc gatcaacggc gctgacgttg ccccatgtga660gcgtgaccag gttgtgtttt ggcagcgcca ggttggcttc taatacctgg cgtttgagat720cttctaacat gttgactcct tcgtgccgga tgcgctttgc ttatccggcc tacaaaatcg780<210>2
<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>引物<223>
<400>2cgccatggtt ctcatgtttg acagcttatc atcgataagc tttaatgcgg tagtttagca60cgaaggagtc aacatg76<210>3<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3cgccatggac tagtaaaaaa aagcccgctc attaggcggg ctgtcattac tgcccgtaat60atgc 64<210>4<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4cgccatggac tagttctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt60tagcacgaag gagtcaacat g 81<210>5<211>58<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5cgccatggaa aaaaaagccc gctcattagg cgggctgtca ttactgcccg taatatgc58<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6gccagggttt tcccagtcac ga 22<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gagcggataa caatttcaca cagg24<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8ccaactcacc ggctgctcta tc 22
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<223>引物<400>9aatgccgaag atgcggtgca taac 24<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10taactgcggc gctaactgac 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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1.一种选择系统，其包括araD基因缺陷的细菌细胞，将携带araD基因、其互补序列或其催化活性片段的载体添加到所述细胞中作为选择标志物。
2.按照权利要求1的选择系统，其中所述araD基因是L-5-磷酸核酮糖4差向异构酶基因(EC 5.1.3.4.)。
3.按照权利要求1的选择系统，其中所述araD基因是突变的。
4.按照权利要求3的选择系统，其中所述突变将终止密码子引入所述araD基因的位点8中。
5.按照权利要求1的选择系统，其中所述细菌细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
6.按照权利要求5的选择系统，其中所述大肠杆菌是大肠杆菌菌株JM109。
7.按照权利要求5的选择系统，其中所述大肠杆菌是大肠杆菌菌株DH5α。
8.一种载体，其包含作为选择标志物的araD基因，其互补序列或其催化活性片段。
9.按照权利要求8的载体，其中所述载体是表达载体，其包括(a)与异源启动子操作性连接的编码核锚定蛋白的DNA序列，所述核锚定蛋白包含(i)结合特异性DNA序列的DNA结合结构域，和(ii)结合核组分的功能性结构域，或它们的功能等同物；和(b)形成所述核锚定蛋白结合位点的多聚的DNA序列，其中所述载体缺失乳头状瘤病毒复制起点，和(c)作为选择标志物的araD基因、其互补序列或其催化活性片段。
10.按照权利要求9的载体，其中所述载体是表达载体，其包括(a)与异源启动子操作性连接的编码核锚定蛋白的DNA序列，其中所述核锚定蛋白是1型牛乳头状瘤病毒(BPV)的E2蛋白，和(b)形成所述核锚定蛋白结合位点的多聚的DNA序列，是作为簇结合入载体中的BPV E2蛋白的多个结合位点，其中所述位点可以是头-尾结构或者可以通过间隔定位包括入载体中，其中所述载体缺失乳头状瘤病毒复制起点，和(c)作为选择标志物的araD基因、araD基因的突变形式、其互补序列或其催化活性片段。
11.权利要求10的载体，其另外包含在多聚的DNA序列中的缺失。
12.权利要求10的载体，其另外包含在SD序列中的突变。
13.araD基因缺陷型的大肠杆菌菌株AG1。
14.araD基因缺陷型的大肠杆菌菌株JM 109。
15.araD基因缺陷型的大肠杆菌菌株DH5α-T1。
16.araD基因和ulaF基因缺陷型的大肠杆菌菌株DH5α-T1。
17.araD基因和sgbE基因缺陷型的大肠杆菌菌株DH5α-T1。
18.araD基因，ulaF基因和sgbE基因缺陷型的大肠杆菌菌株DH5α-T1。
19.araD基因和ulaF基因缺陷型的大肠杆菌菌株AG1。
20.araD基因和sgbE基因缺陷型的大肠杆菌菌株AG1。
21.araD基因，ulaF基因和sgbE基因缺陷型的大肠杆菌菌株AG1。
22.一种选择用质粒转化的细胞的方法，所述质粒包含作为选择标志物的araD基因、其互补序列或其催化活性片段和目标基因，所述方法包括将所述质粒插入到araD缺陷的宿主细胞中并且在含有阿拉伯糖的生长培养基中培养细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述araD基因是L-5-磷酸核酮糖4差向异构酶基因(EC 5.1.3.4.)。
24.权利要求22的方法，其中所述araD基因是突变的。
全文摘要
一种不含抗生素抗性基因的选择系统，其基于在载体上携带的作为选择标志物的araD基因的使用，所述载体被插入araD基因缺陷型的细菌菌株中。来自大肠杆菌的araD基因编码L－5－磷酸核酮糖－4－差向异构酶。一种选择被质粒转化过的细胞的方法，所述质粒包含araD基因。非抗生素选择标志物使所述系统适合于产生治疗剂。所述araD基因对于宿主的生长不是必需的，但是对其的处理在某些选择性条件下影响生长。araD的缺失导致对于宿主具有毒性而对于人没有毒性的物质的积累。所述araD基因是相对小的并且因此可以构建小质粒，其需要更少的能量进行复制，并导致生长率和产量的增加。
文档编号C12N15/61GK1882692SQ200480033694
公开日2006年12月20日 申请日期2004年9月15日 优先权日2003年9月15日
发明者T·滕森, S·拉特, M·阿多亚恩, A·门尼克, U·托茨, M·乌斯塔夫 申请人:非特生物技术有限责任公司