专利名称：产5'－黄苷酸的微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产5’-黄苷酸的微生物。更特别地，本发明涉及产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)KCCM 10448的突变菌株，其被赋予了5-氟色氨酸(色氨酸的代谢类似物)抗性以增强嘌呤生物合成，这使得有可能增加参与嘌呤生物合成途径的N5，N10-四氢叶酸并在同一发酵期间在培养基中以高产量和高浓缩率蓄积5’-黄苷酸。
背景技术：
5’-黄苷酸是核酸生物合成过程中的一个中间体，其在动物和植物体中有重要的生理学意义，被用于食品、医疗用具和其他各领域。因此，本发明的发明人开发了一种具有5-氟色氨酸抗性的突变菌株，其来自同样是由本发明的发明人所开发的已知菌株产氨棒杆菌KCCM 10448，该突变菌株通过直接发酵的方法以高产量和高浓缩率生产5’-黄苷酸。
5’-黄苷酸是嘌呤核苷生物合成过程中的一个中间产物，并且是用于生产5’-鸟苷酸的重要原料。被广泛用于生产具有精度和高品质的5’-鸟苷酸的方法是微生物发酵方法，该发酵方法首先生产5’-黄苷酸，然后通过酶促将其转化成5’-鸟苷酸，因此，为了生产5’-鸟苷酸，相应量的5’-黄苷酸是必需的。生产5’-黄苷酸的传统方法是化能合成、核糖核酸在酵母中分解所产生的5’-鸟苷酸的脱氨基作用、向发酵培养基中添加黄嘌呤作为前体材料的发酵方法、使用微生物的突变菌株的发酵方法、添加抗生素材料的方法(JP 1477/42和JP20390/44)、添加表面活性剂的方法(JP 3825/42和JP 3838/42)等等。在这些方法中，通过微生物的突变菌株对5’-黄苷酸直接发酵的方法在工业应用方面十分有利。因此，通过将产氨棒杆菌KCCM10448的现有特性修饰成以大产率生产5’-黄苷酸的特性，本发明人开发了一种具有增强的5’-黄苷酸的生产力的突变菌株。
发明内容
技术问题生产XMP的生物合成途径非常复杂，且连续进行各种氨基酸和辅酶参与的反应。特别地，N5，N10-四氢叶酸参与了从PRPP(磷酸核糖焦磷酸)到XM的六步骤反应中的两个步骤，并在将甲酰基转移至各前体中发挥作用。同时，自分支酸合成的p-氨基苯甲酸酯是N5，N10-四氢叶酸的生物合成所必需的。分支酸是色氨酸生物合成过程中的一个中间产物，本发明人认为分支酸生产的增强使得N5，N10-四氢叶酸的生产增强。
因此，为了增强嘌呤的生物合成，本发明人检测了一个突变菌株，该菌株被赋予了5-氟色氨酸(色氨酸的代谢类似物)抗性，且其增强了分支酸的生物合成并增加了N5，N10-四氢叶酸，并且本发明人发现相对于现有技术，具有5-氟色氨酸抗性的突变菌株非常有效并能通过直接发酵方法以高产量和高浓缩率生产5’-黄苷酸。
技术方案以下详细阐述用于分离和获得本发明的微生物的方法。
本发明的微生物，产氨棒杆菌CJXFT 0301(KCCM-10530)是按照如下获得的根据常用程序用紫外线和突变衍生物如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理作为亲株的产氨棒杆菌KCCM10448，并选择其中可以在添加了不同浓度水平的氟色氨酸(10、20、50、70、100、200mg/L)的培养基(葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、尿素2g/L、硫酸铵3g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙100mg/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锰10mg/L、硫酸锌10mg/L、生物素30μg/L、盐酸硫胺0.1mg/L、硫酸铜0.8mg/L、腺嘌呤20mg/L、鸟嘌呤20mg/L，pH7.2)中生长的突变菌株。在该过程中，向该培养基中添加0～200mg/L氟色氨酸。亲株对高达20mg/L的氟色氨酸显示出抗性，但是在50mg/L以上的浓度水平没有观察到生长，因此，本发明人分离了可以在100mg/L氟色氨酸中生长的菌株，命名为CJXFT0301，该菌株根据布达佩斯条约于2003年11月25日保藏在韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM 10530。
本发明的新的突变菌株CJXFT 0301的生化特性被示于下表1中。根据表1，本发明的微生物可以生长在添加了100mg/L氟色氨酸的培养基中。
表1
将培养基于30℃发酵5天。
+生长，-不生长有益效果本发明采用产氨棒杆菌KCCM 10448作为亲株，并根据常用程序用紫外线或突变衍生物例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)对其进行处理以获得突变菌株。为了增强用于在嘌呤生物合成过程中转移两个甲酰基的N5，N10-四氢叶酸的生物合成，所述突变菌株被赋予了5-氟色氨酸抗性，且该菌株对于在相同发酵期间在培养基中以高产量和高浓缩率蓄积5’-黄苷酸有效。
具体实施例方式
实施例1所使用的菌株产氨棒杆菌KCCM 10448，产氨棒杆菌CJXFT0301(KCCM 10530)。
种子培养基葡萄糖30g/L、蛋白胨15g/L、酵母提取物15g/L、氯化钠2.5g/L、尿素3g/L、腺嘌呤150mg/L、鸟嘌呤150mg/L，pH7.2。
发酵培养基(1)A培养基葡萄糖60g/L、硫酸镁10g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锌10mg/L、硫酸锰10mg/L、腺嘌呤30mg/L、鸟嘌呤30mg/L、生物素100μg/L、硫酸铜1mg/L、盐酸硫胺5mg/L、氯化钙10mg/L，pH 7.2。
(2)B培养基磷酸二氢钾10g/L、磷酸氢二钾10g/L、尿素7g/L、硫酸铵5g/L。
发酵方法将5mL的种子培养基倾注到直径为18mm的试管中，并根据常用方法加压灭菌。灭菌后，将产氨棒杆菌KCCM 10448和产氨棒杆菌CJXFT 0301分别接种到其中，然后于30℃，以180rpm振荡培养18小时。将所得产物用作种子培养物。然后，根据常用方法分别对作为发酵培养基的A培养基和B培养基进行加压灭菌，将29mL的A培养基和10mL的B培养基分别倾注到灭菌的500mL-锥形瓶中用于振荡，将1mL的上述种子培养物接种到其中，然后于30℃，以200rpm发酵90小时。发酵完成后，5’-黄苷酸在培养基中所蓄积的量表明在KCCM 10448中的量为25.4g/L，在CJXFT 0301中的量为28.6g/L。(蓄积的5’-黄苷酸的浓度以5’-黄原酸钠·7H2O的形式给出。)实施例2所使用的菌株与实施例1相同。
一级种子培养基与实施例1的种子培养基相同。
二级种子培养基葡萄糖60g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁1g/L、硫酸亚铁22mg/L、硫酸锌15mg/L、硫酸锰10mg/L、硫酸铜1mg/L、氯化钙100mg/L、生物素150μg/L、腺嘌呤150mg/L、鸟嘌呤150mg/L、盐酸硫胺5mg/L、消泡剂0.6mL/L，pH7.2。
发酵培养基葡萄糖151g/L、磷酸32g/L、氢氧化钾25g/L、腺嘌呤198mg/L、鸟嘌呤119mg/L、硫酸亚铁60mg/L、硫酸锌42mg/L、硫酸锰15mg/L、硫酸铜2.4mg/L、alaniate 22mg/L、NCA 7.5mg/L、生物素0.4mg/L、硫酸镁15g/L、胱氨酸30mg/L、组氨酸盐30mg/L、氯化钙149mg/L、盐酸硫胺15mg/L、消泡剂0.7mL/L、CSL 27mL/L、金枪鱼提取物6g/L，pH 7.3。
一级种子培养将50mL的一级种子培养基倾注到500mL-锥形瓶中用于振荡，并于121℃加压灭菌20分钟。冷却后，将产氨棒杆菌KCCM 10448和产氨棒杆菌CJXFT 0301分别接种到其中，并于30℃，以180rpm振荡培养24小时。
二级种子培养将二级种子培养基倾注到5L的试验用发酵池中(各2L)，并于121℃加压灭菌20分钟。冷却后，接种50mL的上述一级种子培养液，并以0.5vvm的通气量，以900rpm，于31℃培养24小时。在该培养过程中，通过氨溶液的调节将培养基的pH水平保持在7.3。
发酵方法将发酵培养基倾注到30L的试验用发酵池中(各8L)，并于121℃加压灭菌20分钟。冷却后，将上述二级种子培养物接种到其中(各1.5L)，并以1vvm的通气量，以400rpm，于33℃进行培养。只要在该培养过程中剩余的糖水平下降至1％以下，则补充灭菌的葡萄糖并将发酵培养基中的总糖水平在保持在30％。在该培养过程中，通过以氨溶液进行调节将培养基的pH水平保持在7.3，该过程耗时80小时。发酵完成后，5’-黄苷酸在培养基中蓄积的量表明在KCCM 10448中的量为145.2g/L，在CJXFT 0301中的量为155.4g/L。(蓄积的5’-黄苷酸的浓度以5’-黄原酸钠·7H2O的形式给出。)
PCT/RO/134表关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二)
PCT/RO/134表(1998年7月)
权利要求
1.一种产5’-黄苷酸的微生物，其是产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)的突变菌株，其特征在于具有5-氟色氨酸抗性。
2.根据权利要求1的微生物，其中所述微生物是产氨棒杆菌CJXFT 0301(保藏号KCCM-10530)。
3.一种生产5’-黄苷酸的方法，其特征在于使用权利要求1或2的微生物。
全文摘要
本发明涉及一种通过用紫外线和突变衍生物例如N－甲基－N’－硝基－N－亚硝基胍(NTG)处理作为亲株的产5’－黄苷酸的产氨棒杆菌(Corynebacterium ammonia genes)KCCM 10448所获得的微生物，其具有5－氟色氨酸抗性，所述抗性增强了用以在嘌呤生物合成过程中转移两个甲酰基的N
文档编号C12R1/15GK1890364SQ200480036599
公开日2007年1月3日 申请日期2004年11月18日 优先权日2003年12月10日
发明者朴英薰, 张裁永, 李珍南, 吴奇勳, 金祯焕, 吴润锡, 沈载益 申请人:Cj株式会社