玉米植株mon88017和组合物以及检测它们的方法

专利名称：玉米植株mon88017和组合物以及检测它们的方法
专利说明玉米植株MON88017和组合物 以及检测它们的方法 本申请要求2003年12月15日提交的美国临时申请No.60/529,477的优先权。发明领域[Para3]本发明涉及植物分子生物学领域。更特别地，发明涉及草甘膦耐受的以及昆虫抗性的玉米植株MON88017，并涉及检测植株样品及其组合物中玉米植株MON88017DNA存在的分析和方法。相关现有技术的描述[Para5]玉米是重要的作物，在世界上很多地区都是主要的食物来源。生物技术方法已经被运用到玉米上来改进产品的农学性状和质量。一种这样的农学性状是耐受除草剂，特别是耐受草甘膦除草剂。玉米中的该性状已经通过在表达抗草甘膦的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(CP4 EPSPS，美国专利5,633,435)的玉米植株中的转基因表达而被赋予。另一个农学性状是昆虫抗性，例如遗传工程玉米植株对玉米钻孔螟和玉米根虫的抗性(美国专利6,489,542和美国专利6,620,988)。能够检测到特定植株的转基因/基因组DNA的存在以确定有性杂交的子代是否含有感兴趣的转基因/基因组DNA，这将是非常有利的。此外，当遵照源自重组作物植物的食物需要预先的市场批准和标记的规则时，检测特定植株的方法将是有用的。已知外来基因在植物中的表达受到它们的染色体位置的影响，或许是由于染色质结构(如异染色质)或靠近整合位点的转录调节元件(如增强子)的接近(Weising et al.，Ann.Rev.Genet 22421-477，1988)。因此之故，经常有必要筛选大量的植株以鉴别最佳表达所引入的感兴趣转基因为特征的植株。例如，已经观察到在植物和其它生物中，在植物中所引入转基因的表达水平可能广泛变化。表达的空间或时间模式也可能有差异，例如在各种植物组织中的转基因相对表达的差异，可能并不符合所引入基因构建体中存在的转录调节元件所预期的模式。因此之故，通常产生成百上千的不同转基因植株并筛选其中具有期望的转基因表达水平和表型的单个植株用于商业目的。具有期望的转基因表达水平或模式的植株在通过使用常规育种方法的有性杂交而将转基因基因渐渗到其它遗传背景方面是有用的。这种杂交的子代保留了原始转化体的转基因表达特征。该策略用于确保多种品种中的可靠基因表达，非常适合当地生长条件和市场需求。通过任何公知的核酸检测方法诸如聚合酶链式反应(PCR)或使用多核酸探针的DNA杂交来检测转基因的存在是可能的。这些检测方法一般使用遗传元件特异的DNA引物或探针分子，诸如启动子、前导序列、内含子、编码区、3′转录终止子、标志基因等等，它们是DNA构建体的转基因的成分。因此，这些方法用于区别不同转基因事件(event)时不很有用，特别是使用同样的转基因DNA构建体产生的那些，除非邻近插入的转基因DNA的基因组DNA序列是已知的。已经开发了事件特异性的DNA检测方法用于许多转基因作物植物的引进，例如甜菜(美国专利6,531,649)、小麦(美国专利公开20020062503)、抗昆虫的玉米(美国专利公开20020102582)以及草甘膦耐受的玉米事件nk603(美国专利公开20020013960)。本发明涉及草甘膦耐受的并有玉米根虫抗性的玉米植株MON88017，以及其中含有的组合物，并涉及检测玉米植株MON88017的转基因/基因组插入区的方法以及其含有这些组合物的子代。发明概述[Para10]本发明涉及命名为MON88017的转基因玉米植株，种子以保藏号PTA-5582保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。发明的另一方面包括植物的子代植株、或种子、或可再生部分以及植株MON88017的种子。发明也包括玉米植株MON88017的植物部分，包括但不限于花粉、胚珠、种子、根和叶。发明涉及具有草甘膦耐受表型和玉米根虫抗性表型的玉米植株MON88017，以及MON88017基因组中含有的新的遗传组合物。发明的一个方面提供了DNA组合物以及检测玉米植株MON88017的转基因/基因组的接合区存在的方法。提供了分离的DNA分子，其包括选自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的至少一种转基因/基因组接合DNA分子及其互补序列，其中接合分子跨越转基因插入位点，所述插入位点包括插入玉米基因组中的异源DNA和玉米植株MON88017中插入位点侧翼的玉米基因组DNA。含有这些DNA分子的任意一种的玉米种子及其植物材料是本发明的一方面。提供了分离的DNA分子，它是转基因/基因组区SEQ ID NO3或其互补序列，其中该DNA分子在玉米植株MON88017的基因组中是新的。在基因组中含有SEQ ID NO3的玉米植株和种子是本发明的一方面。根据本发明的另一方面，提供了分离的DNA分子，它是转基因/基因组区SEQ ID NO4或其互补序列，其中该DNA分子在玉米植株MON88017的基因组中是新的。在基因组中含有SEQ ID NO4的玉米植株和种子是本发明的一方面。提供了分离的DNA分子，它是MON88017的转基因/基因组区SEQ ID NO5或其互补序列，其中该DNA分子在玉米植株MON88017的基因组中是新的。在基因组中含有SEQ ID NO5的玉米植株和种子是本发明的一方面。根据本发明的另一方面，提供了用于DNA检测方法中的包括引物对的两种DNA分子，其中第一DNA分子含有SEQ ID NO3或其互补的DNA分子的转基因DNA区任何部分的至少11个或更多的连续多核苷酸，第二DNA分子含有SEQ ID NO3或其互补的玉米基因组DNA区任何部分的至少11个或更多的连续多核苷酸，其中当一起使用时，这些DNA分子在产生扩增子的DNA扩增方法中包括DNA引物组。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增子是包含SEQ ID NO1的扩增子时，可诊断玉米植株MON88017。由MON88017 DNA产生的任何长度的扩增子是发明的方面，其中扩增子含有SEQ ID NO1。熟练技术人员将认可的是，第一和第二DNA分子不必仅仅由DNA组成，也可包括RNA，DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，熟练技术人员将认可的是，如此处所述的探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19和20个连续核苷酸的长度，其选自如SEQ ID NO1(任意命名的5’接合区)、SEQ ID NO2(任意命名的3’接合区)、SEQ ID NO3(任意命名的5’侧翼序列的部分)、SEQ ID NO4(任意命名的3’侧翼序列的部分)和SEQ ID NO5(插入的核苷酸序列的全部或部分)中所述的核苷酸。当选自如SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的核苷酸时，长度为至少大约21个到大约50个或更多连续核苷酸的探针和引物是可能的。根据本发明的另一方面，提供了用于DNA检测方法中的包括引物对的两种DNA分子，其中第一DNA分子含有SEQ ID NO4或其互补的DNA分子的转基因DNA区任何部分的至少11个或更多的连续多核苷酸，第二DNA分子含有SEQ ID NO4或其互补的玉米基因组DNA区任何部分的至少11个或更多的连续多核苷酸，其中当一起使用时，这些DNA分子在产生扩增子的DNA扩增方法中包括DNA引物组。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增子是包含SEQ ID NO2的扩增子时，可诊断玉米植株MON88017。由MON88017 DNA产生的任何长度的扩增子是发明的方面，其中扩增子含有SEQ ID NO2。根据本发明的另一方面，提供了检测样品中特异性相应于玉米植株MON88017 DNA的DNA存在的方法。该方法包括(a)将包含MON88017基因组DNA的样品与DNA引物对接触；(b)进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；以及(c)检测扩增子，其中扩增子包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。根据本发明的另一方面，提供了检测样品中特异性相应于玉米植株MON88017 DNA的DNA存在的方法。该方法包括(a)将包含MON88017 DNA的样品与DNA探针接触，所述探针含有SEQ IDNO1或SEQ ID NO2，或者与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2基本上同源的DNA分子，其在严格杂交条件下与玉米植株MON88017的基因组DNA杂交并且在严格杂交条件下不与非MON88017玉米植株DNA杂交；(b)使样品和探针处于严格杂交条件下；以及(c)检测探针与玉米植株MON88017 DNA的杂交。根据本发明的另一方面，提供了产生耐受草甘膦施用以及抵抗玉米根虫的玉米植株的方法，包括步骤将第一亲本玉米植株MON88017与缺少草甘膦耐受性和玉米根虫抗性的第二亲本玉米植株有性杂交，从而产生草甘膦耐受的和玉米根虫抗性的杂种子代植物。本发明的另一方面是确定玉米事件MON88017的子代的接合性的方法，包括(a)将含有玉米DNA的样品与包括SEQ ID NO32、SEQ ID NO33和SEQ ID NO34的引物组接触，当用于与玉米事件MON88017的基因组DNA进行的核酸扩增反应时，所述引物组能产生诊断玉米事件MON88017的第一扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生第一扩增子；(c)检测第一扩增子；(d)将含有玉米DNA的样品与所述引物组接触，当用于与玉米植株基因组DNA进行的核酸扩增反应时，所述引物组能产生第二扩增子，所述第二扩增子含有与被鉴别为玉米事件MON88017的转基因插入片段的玉米基因组区同源的天然玉米基因组DNA；(e)进行核酸扩增反应，从而产生第二扩增子；(f)检测第二扩增子；(g)比较样品中的第一和第二扩增子，其中两种扩增子都存在，表明样品对于转基因插入是杂合的。控制种植玉米植株MON88017的大田中的杂草的方法，包括将含有有效量草甘膦的除草剂施加到种植MON88017玉米植株的大田中的步骤。杂种玉米种子，包含的其中至少一种亲本是MON88017。用含有MON88017的植物表达盒的植物DNA构建体转化的玉米植株。从下面的详细描述和附图来看，前述的以及发明的其它方面将变得更为显而易见。附图简述[Para26]

图1.pMON53616质粒图谱。图2.玉米植株MON88017中插入片段的基因组组构。图3.MON88017 5’转基因/基因组DNA区(SEQ ID NO3)。图4.MON88017 3’转基因/基因组DNA区(SEQ ID NO4)。图5.MON88017转基因/基因组DNA区(SEQ ID NO5)。优选实施方案的详细描述[Para32]这里所称为的“植株MON88017”或“MON88017”的转基因玉米植株是对鞘翅目害虫玉米根虫(Diabrotica spp.)的摄食损伤有抗性的，并且耐受含草甘膦的农业除草剂的植物毒性作用。该双重性状的玉米植株表达苏云金芽孢杆菌(Kumamotoensis亚种)的CRY3Bb1蛋白(美国专利6,501,009)的修饰变体，其提供了对玉米根虫幼虫摄食损伤的抗性，并表达农杆菌菌株CP4的草甘膦抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)蛋白(美国专利5,633,435)，其赋予植物对草甘膦的耐受性。双重性状玉米的使用将给玉米种植者提供主要好处a)免受由于玉米根虫幼虫造成的经济损失，该幼虫是美国的主要昆虫害虫，在世界上的许多玉米种植区越来越受关注；b)施加含草甘膦的农业除草剂给玉米作物用于广谱杂草控制的能力。此外，编码玉米根虫和草甘膦耐受性状的转基因连锁在同一DNA区段上，并且存在于MON88017基因组的单一基因座上，这一点提供了增强的育种效率并使得能够用分子标志来追踪繁殖群体及其子代中的转基因插入片段。通过用质粒构建体MON53616(图1)对近交玉米系的农杆菌介导的转化方法生产玉米植株MON88017。该质粒构建体包含与在玉米植物细胞中表达CRY3Bb1蛋白和CP4 EPSPS蛋白所必需的调节性遗传元件相连锁的植物表达盒。将玉米细胞再生为完整玉米植株，从植株群体中选择显示出植物表达盒完整性以及对草甘膦和玉米根虫幼虫摄食损伤的抗性的个体植株。在其基因组中含有连锁的pMON53616植物表达盒的玉米植株是本发明的一个方面。插入到玉米植株MON88017基因组中的质粒DNA通过详细的分子分析进行表征。这些分析包括插入数量(玉米基因组中的整合位点数)、拷贝数(一个基因座中的T-DNA拷贝数)以及插入的基因盒的完整性。使用了DNA分子探针，其包括完整的CP4 EPSPS和CRY3Bb1编码区和它们各自的调节元件、启动子、内含子和植物表达盒的聚腺苷化序列以及质粒pMON53616主链DNA区。数据显示MON88017含有单一的T-DNA插入和一个拷贝的CRY3Bb1和CP4EPSPS盒。在MON88017基因组中没有检测到来自连锁或不连锁到完整基因盒的转化载体pMON88017的额外元件。最后，进行了PCR和DNA序列分析来确定插入植物基因组的5′和3′接合区，确认插入片段中的元件组构(图2)，并确定玉米植株MON88017中插入片段的完整DNA序列(SEQ ID NO5)。草甘膦耐受的、玉米根虫抗性的玉米植株的培育可通过首先将由MON88017生长的玉米植株组成的第一亲本玉米植株与缺少草甘膦除草剂耐受性的第二亲本玉米植株有性杂交，从而产生许多杂种子代植株。近交玉米系可通过这样的方法产生，包括用回归亲本回交并用草甘膦处理进行选择。通常用于不同性状和作物的其它培育方法的描述可在现有技术已知的参考文献中找到，例如Fehr，in BreedingMethods for Cultivar Development，Wilcox J.ed.，American Society ofAgronomy，Madisob WI(1987)。除非另有说明，术语是根据相关现有技术中的普通技术人员的常规用法来理解的。分子生物学中普通术语的定义也可在Riegeret al.，Glossary of GeneticsClassical and Molecular，5th edition，Springer-VerlagNew York，1991；以及Lewin，Genes V，OxfordUniversity PressNew York，1994中找到。使用如37 CFR§1.822所述的DNA碱基命名。如这里使用的，术语“玉米”是指Zea mays，包括可用玉米植株MON88017培育的所有植物品种。如这里使用的，术语“包含”是指“包括但不限于”。“草甘膦”是指N-膦酰基甲基甘氨酸和它的盐。N-膦酰基甲基甘氨酸是公知的对广谱植物物种有活性的除草剂。草甘膦是在环境中具有期望的短半衰期的安全除草剂Roundup(Monsanto Co.)的活性成分。草甘膦是Roundup除草剂(Monsanto Co.)的活性成分。用“草甘膦除草剂”处理是指用Roundup、Roundup Ultra、Roundup Pro除草剂或者含草甘膦的任何其它除草剂制剂处理。草甘膦商品制剂的例子包括但不限于由Monsanto公司作为ROUNDUP、ROUNDUPULTRA、ROUNDUPULTRAMAX、ROUNDUPWEATHERMAX、ROUNDUPCT、ROUNDUPEXTRA、ROUNDUPBIACTIVE、ROUNDUPBIOFORCE、RODEO、POLARIS、SPARK和ACCORD除草剂出售的那些，全部都含有草甘膦的异丙基铵盐；由Monsanto公司作为ROUNDUPDRY和RIVAL除草剂出售的那些，其含有草甘膦的铵盐；由Monsanto公司作为ROUNDUPGEOFORCE出售的，其含有草甘膦的钠盐；以及由Syngenta Crop Protection作为TOUCHDOWN除草剂出售的，其含有草甘膦的三甲基锍盐。当施加到植物表面时，草甘膦系统性移动通过植物。草甘膦由于其对莽草酸途径的抑制而是植物毒性的，该途径提供芳香氨基酸合成的前体。草甘膦抑制植物中发现的酶，即5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)。草甘膦耐受性可通过表达细菌EPSPS变体和植物EPSPS变体而获得，所述变体具有更低的草甘膦亲和性，从而在草甘膦存在下维持其催化活性(美国专利Nos.5,633,435，5,094,945，4,535,060和6,040,497)。玉米根虫(CRW，Diabrotica spp)幼虫以发育中的玉米植株的根为食。投入了大量费用和时间来控制这种害虫引起的经济损失。每年为控制CRW，将包括有机磷酸酯、氨基甲酸酯和合成除虫菊酯类在内的化学杀虫剂引入到超过1600万英亩的玉米地土壤中。从土壤杀虫剂转变到转基因方法的好处是重大的，包括减少了潜在的人类健康和安全风险、减少了对非靶生物的直接影响、减少了地表和地下水供给的污染、减少了杀虫剂容器的处理问题、以及与其它害虫控制和农学程序的普遍相容性。本发明提供了用含有至少一种表达高水平CRY3Bb1δ-内毒素的表达盒和至少一种表达草甘膦耐受性酶的表达盒的DNA构建体转化的转基植物。根据这里公开的方法，用这里公开的DNA构建体转化的玉米植株是抗CRW的。同样的玉米植株也是抗草甘膦除草剂的。连锁的农学性状使得容易在繁殖群体中将这些性状维持在一起。转基因“植株”的生产是通过用异源DNA，即包括感兴趣的转基因的多核酸构建体转化植物细胞；再生由转基因插入到植物细胞基因组中而产生的植株群体，选择特征为插入到特定基因组位置的特定植株。术语“事件(event)”是指包括异源DNA的原始转化体植株以及转化体的子代。术语“事件”也包括由事件与另一种植株之间的有性远交而产生的子代，其中子代包括异源DNA。即使在重复回交于回归亲本之后，被转化的亲本事件的插入DNA和侧翼基因组DNA还存在于杂交子代的同一染色体位置。术语“事件”也指包括了插入DNA的原始转化体的DNA以及紧邻插入DNA的侧翼基因组序列，它们预期将被转移到接受了包括感兴趣的转基因的插入DNA的子代中，这是由于包括插入DNA的一种亲本系(例如原始转化体和自交产生的子代)与不含插入DNA的亲本系的有性杂交的结果。本发明涉及转基因事件、玉米植株MON88017、其子代以及其中含有的DNA组合物。“探针”是分离的核酸，其上连接了常规的可检测标志或报道分子，例如放射性同位素、配体、化学发光试剂或酶。这样的探针与靶核酸的链互补，在本发明的情况下，是与MON88017的基因组DNA的链互补，其来自MON88017植株或者来自包括MON88017DNA的样品。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，也包括特异性结合到靶DNA上并可用于检测靶DNA序列存在的聚酰胺和其它探针材料。DNA引物是分离的多核酸，其通过核酸杂交被退火到互补的靶DNA链上，在引物和靶DNA链之间形成杂交体，然后通过聚合酶如DNA聚合酶沿靶DNA链延伸。本发明的DNA引物对或DNA引物组是指用于扩增靶核酸序列的两种DNA引物，所述扩增例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的多核酸扩增方法。DNA探针和DNA引物通常的长度为11个多核苷酸或更多，经常是18个多核苷酸或更多、24个多核苷酸或更多、或者30个多核苷酸或更多。这样的探针和引物被选择为在高严格杂交条件下有足够的长度来特异性杂交到靶序列上。优选地，根据本发明的探针和引物具有与靶序列完全的序列相似性，尽管也可以通过常规方法设计保持杂交到靶序列能力的不同于靶序列的探针。制备和使用探针和引物的方法描述于例如MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，ed.Sambrook etal.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989(下文称为″Sambrook et al.，1989″)；Current Protocols inMolecular Biology，ed.Ausubel et al.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(定性更新)(下文称为″Ausubel et al，1992″)；以及Innis et al.，PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，Academic PressSan Diego，1990。PCR DNA引物对可源自已知序列，例如通过使用打算用于例如引物目的的计算机程序(Version 0.5，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。这里公开的基于侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可用于确认(如果必要的话，校正)由常规方法例如通过重新克隆并测序这些DNA分子而得到的公开DNA序列。本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA分子杂交。可使用任何常规的核酸杂交或扩增方法来鉴别样品中转基因植物DNA的存在。多核酸分子(也称为核酸区段)或其片段在某种情况下能够与其它核酸分子特异性杂交。如这里使用的，据认为如果两种多核酸分子能够形成反向平行的双链核酸结构，这两种多核酸分子就能够彼此特异性杂交。如果表现出完全的互补性，核酸分子就被认为是另一种核酸分子的“互补序列”。如这里使用的，当一种分子的每个核苷酸都与另一分子的核苷酸互补，则认为分子显示出“完全的互补性”。如果两种分子能够以足够的稳定性相互杂交以允许它们在至少常规的“低严格”条件下保持彼此退火，则认为它们是“最低程度互补的”。类似地，如果分子能够以足够的稳定性相互杂交以允许它们在常规的“高严格”条件下保持彼此退火，则认为它们是“互补的”。常规的严格条件描述于Sambrook et al，1989以及Haymes et alNucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)，因此偏离完全互补是可允许的，只要这些偏离不完全阻止分子形成双链结构的能力。为将核酸分子用作引物或探针，仅仅需要它在序列上足够互补以能够在所采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。如这里使用的，基本上同源的序列是在高严格条件下将特异性杂交于与其相比的核酸序列的互补序列的核酸序列。促进DNA杂交的合适严格条件是本领域技术人员所已知的或者能够在CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到，例如约45℃下，6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃用2.0xSSC漂洗。例如，漂洗步骤的盐浓度可选自50℃下大约2.0xSSC的低严格条件到50℃下大约0.2xSSC的高严格条件。此外，漂洗步骤的温度可由大约22℃的室温低严格条件增加到大约65℃的高严格条件。温度和盐两者都可变化，或者温度或盐浓度两者之一可保持恒定而改变另一变量。在优选的实施方案中，本发明的多核酸在中度严格条件下将与SEQ ID NOs1、2、3、4或5中所示的一种或多种核酸分子或其互补序列或其片段特异性杂交，例如大约2.0xSSC和大约65℃。在特别优选的实施方案中，本发明的核酸在高严格条件下将与SEQ ID NOs1、2、3、4或5中所示的一种或多种核酸分子或其互补序列或其片段特异性杂交。在本发明的一个方面，本发明的优选标志核酸分子具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所示核酸序列或其互补序列或其片段。在本发明的另一方面，本发明的优选标志核酸分子与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所示核酸序列或其互补序列或其片段共有80％-100％或者90％-100％的序列同一性。在本发明进一步的方面，本发明的优选标志核酸分子与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所示序列或其互补序列或其片段具有95％-100％的序列同一性。SEQ ID NO1或SEQ ID NO2可用作植物育种方法中的标志来鉴别遗传杂交的子代，类似于DNAmarkersProtocols，applications，and overviews(1997)173-185，Cregan，et al.，eds.，Wiley-Liss NY中描述的简单序列重复DNA标志分析方法。与靶DNA分子杂交的探针可通过本领域技术人员已知的许多方法检测，这些方法包括但不限于荧光标记、放射性标记、基于抗体的标记以及化学发光标记。关于使用特定的扩增引物对扩增靶核酸序列(例如通过PCR)，“严格条件”是允许引物对只杂交到靶核酸序列的条件，具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物将结合到该靶核酸序列上并且优选在DNA热扩增反应中产生独特扩增产物扩增子。术语“特异于(靶序列)”表明探针或引物在严格杂交条件下只与含有靶序列的样品中的靶序列杂交。如这里使用的，“扩增的DNA”或“扩增子”是指针对靶多核酸分子的多核酸扩增方法的产物，该靶多核酸分子是多核酸模板的一部分。例如，为确定由有性杂交产生的玉米植株是否含有本发明的玉米植株MON88017植株的转基因植物基因组DNA，可对提取自玉米植株组织样品的DNA进行多核酸扩增方法，使用的引物对包括源自与插入的异源DNA(转基因DNA)的插入位点邻接的MON88017植株基因组DNA序列的引物，第二引物源自插入的异源DNA，以产生诊断MON88017植株DNA存在的扩增子。诊断性扩增子的长度以及具有的DNA序列也可诊断植物基因组DNA，扩增子的DNA序列包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。扩增子的长度范围可为引物对长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上大约五十个核苷酸碱基对，更优选加上大约二百五十个核苷酸碱基对，甚至更优选加上大约四百五十个核苷酸碱基对或更多的合并长度。可替代地，引物对可源自插入的异源DNA两侧的基因组序列以便产生包括整个插入多聚核苷酸序列的扩增子(例如正向引物分离自SEQ ID NO3的基因组部分，反向引物分离自SEQ ID NO4的基因组部分，就扩增了包括插入MON88017基因组的两个MON53616 DNA片段表达盒的DNA分子，插入片段包括SEQ ID NO5的大约7125个核苷酸，图2和图5)。源自邻接转基因插入DNA的植物基因组序列的引物对成员位于插入DNA序列的一段距离之处，该距离可在一个核苷酸碱基对到大约两万核苷酸碱基对之间变化。术语“扩增子”的使用明确排除了可能在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。多核酸扩增可通过现有技术已知的各种多核酸扩增方法的任何一种来完成，包括聚合酶链式反应(PCR)。扩增方法是现有技术已知的，并且描述于美国专利Nos.4,683,195和4,683,202以及PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications，ed.Innis et al，Academic Press，San Diego，990。已经开发展了PCR扩增方法来扩增最多22kb(千碱基)的基因组DNA和最多42kb的噬菌体DNA(Cheng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915695-5699，1994)。这些方法以及现有技术已知的其它DNA扩增方法都可用于实施本发明。异源DNA插入序列或MON88017的侧翼基因组DNA序列的验证(如果必要的话，校正)可通过由MON88017种子扩增这些DNA分子，或者由保藏在ATCC的保藏号为PTA-5582的种子长成的植物扩增这些DNA分子，扩增中使用源自这里提供的序列的引物，接着通过对PCR扩增子或其克隆的DNA片段的标准DNA测序。基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒含有DNA引物分子，它们在适当的反应条件下特异性杂交到靶DNA上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多方法。含有与SEQ ID NO3或SEQ IDNO4的玉米基因组区的任何部分同源或互补的、以及与SEQ ID NO5的转基因插入区的任何部分同源或互补的DNA引物的试剂盒是发明的一种目标。特别地鉴别为在DNA扩增方法中有用的引物对是SEQID NO6和SEQ ID NO7，其扩增与MON88017的5′转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括SEQ ID NO1。用作DNA引物的其它DNA分子可选自DNA扩增领域的技术人员所披露的MON88017转基因/基因组DNA序列(SEQ ID NO5)。由这些方法产生的诊断性扩增子可通过许多技术检测。一种这样的方法是遗传比特分析(Nikiforov，et al.Nucleic Acid Res.224167-4175，1994)，其中设计了与邻接的侧翼基因组DNA序列和插入DNA序列都重叠的DNA寡核苷酸。将寡核苷酸固定在微量滴定板的孔中。在PCR感兴趣的区域之后(使用的引物一种在插入序列中，一种在邻接的侧翼基因组序列中)，使用DNA聚合酶和特异于预期的下一个碱基的标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)，可将单链PCR产物杂交到固定的寡核苷酸上，用作单碱基延伸反应的模板。可基于荧光或ELISA来读出。由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而产生的信号表明转基因/基因组序列的存在。另一种方法是由Winge描述的Pyrosequencing技术(Innov.Pharma.Tech.0018-24，2000)。在该方法中，设计了与邻接的基因组DNA和插入DNA接合区都重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸杂交到来自感兴趣区域的单链PCR产物(一种引物在插入序列中，一种在侧翼基因组序列中)，在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷酰硫酸以及荧光素存在下温育。单独加入DNTPs，掺入引起了可测定的光信号。由于成功的扩增、杂交以及单碱基或多碱基延伸而产生的光信号表明转基因/基因组序列的存在。如Chen et al.所描述的荧光偏振是可用来检测本发明扩增子的方法。使用该方法，设计与基因组侧翼和插入DNA接合区都重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸杂交到来自感兴趣区域的单链PCR产物(一种引物在插入DNA中，一种在侧翼基因组DNA序列中)，在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP存在下温育。单碱基延伸产生了ddNTP的掺入。掺入的测定可使用荧光计测定偏振变化。由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而产生的偏振变化表明转基因/基因组序列的存在。Taq man(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)被描述为检测和定量DNA序列存在的方法，根据厂商提供的用法说明可充分理解。简要的说，设计与基因组侧翼和插入DNA接合区都重叠的FRET寡核苷酸探针。在耐热聚合酶和dNTPs存在下循环FRET探针和PCR引物(一种引物在插入DNA序列中，一种在侧翼基因组序列中)。FRET探针的杂交引起荧光部分从FRET探针上的淬灭部分裂解并释放。由于成功的扩增和杂交而产生的荧光信号表明转基因/基因组序列的存在。分子信标被描述用于序列检测，如Tyangi，et al.(NatureBiotech.14303-308，1996)所描述的。简要的说，设计与基因组侧翼和插入DNA接合区都重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致它包含将荧光和淬灭部分保持紧邻的二级结构。在耐热聚合酶和dNTPs存在下循环FRET探针和PCR引物(一种引物在插入DNA序列中，一种在侧翼基因组序列中)。在成功的PCR扩增后，FRET探针杂交到靶序列上引起了探针二级结构的去除以及荧光和淬灭部分的空间分离。导致荧光信号产生。由于成功的扩增和杂交而产生的荧光信号表明侧翼/转基因插入序列的存在。使用这里公开的组合物和DNA检测现有技术中公知的方法可开发DNA检测试剂盒。试剂盒用于鉴别样品中的玉米植株MON88017 DNA，可应用于培育含有MON88017 DNA的玉米植株的方法。试剂盒含有作为引物或探针有用的DNA分子，其与SEQ IDNO1、2、3、4或5的至少一部分同源或互补。DNA分子可用在DNA扩增方法(PCR)中或者作为多核酸杂交方法，即Southern分析、Northern分析中的探针。质粒载体MON53616用于生产含有两个表达盒的玉米事件MON88017表达盒一包括带有复制的增强子的CaMV 35S启动子，连接到小麦CAB 5′前导序列，再连接到水稻肌动蛋白1内含子，再连接到CRY3Bb1编码区，再连接到小麦Hsp17 3′聚腺苷化序列；连接到表达盒二，其包括水稻肌动蛋白1启动子，连接到水稻肌动蛋白内含子(其驱动融合到CP4 EPSPS编码区的叶绿体运输肽转录)，再连接到NOS 3′聚腺苷化区，所连接的表达盒的序列包含在SEQ ID NO5中。下面的实施例是用来例证发明的某些优选实施方案的实施例的。本领域技术人员应当理解，下面实施例中公开的技术代表发明人所发现的在发明的实施中起良好作用的方法，因此可以认为构成了用于其实施的优选方式的实施例。然而，根据目前的公开内容，本领域技术人员应当理解，在所公开的具体实施方案中可以进行许多改变而仍然获得不脱离发明精神和范围的相似的或类似的结果。实施例[Para63]实施例1[Para64]转基因玉米植株MON88017的产生是通过用源自MON53616(图1)的DNA片段进行农杆菌介导的玉米细胞转化。使用三亲本交配方法(Ditta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.777347-7351，1980)将植物转化构建体MON53616交配进农杆菌中。将包含两个转基因植物表达盒的MON53616的DNA片段插入玉米植株细胞基因组中，将玉米植株细胞再生为玉米植株MON88017。插入MON88017基因组中的插入片段的组构示于图2。MON88017和它的子代具有草甘膦耐受性以及对玉米根虫幼虫摄食损伤的抗性。基本上按这里的描述进行玉米转化。含有MON53616的农杆菌液体培养物起始于甘油储备液或者新鲜划线的平板，在含有50mg/l(毫克每升)卡那霉素、50mg/l链霉素或50mg/l壮观霉素、有200μM乙酰丁香酮(AS)的25mg/l氯霉素的液体LB培养基中，pH 7.0，于26℃-28℃振荡(大约150转每分钟，rpm)过夜生长到对数生长中期。将农杆菌细胞重悬浮在接种培养基(液态CM4C，如美国专利6,573,361表8中所述)中，将细胞密度调节到使重悬浮细胞在分光光度计中于660nm波长下测定时具有1的光密度(即OD660)。用农杆菌接种新鲜分离的II型未成熟的HillxLH198和Hill玉米胚，在23℃黑暗中共培养2-3天。然后将胚转移到补充了500mg/l羧苄青霉素(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)和20μM AgNO3)的延迟培养基(N61-100-12；如美国专利5,424,412表1所述)中，在28℃温育4到5天。所有随后的培养物都保持在这个温度。在接种一周后将玉米胚芽鞘去除。将胚转入第一选择培养基(N61-0-12，如美国专利5,424,412表1所述)，所述培养基补充了500mg/l羧苄青霉素和0.5mM草甘膦。两周后，将存活组织转移到第二选择培养基(N61-0-12)，所述培养基补充了500mg/l羧苄青霉素和1.0mM草甘膦。将存活的愈伤组织在1.0mM草甘膦上每两周传代培养，产生大约3个传代培养物。当鉴别到草甘膦耐受性组织时，将组织扩大进行再生。为再生，将愈伤组织转移到再生培养基(MSOD，如美国专利5,424,412表1所述)中，所述培养基补充了0.1μM脱落酸(ABA；Sigma-Aldrich，St Louis，MO)，温育两周。将再生的愈伤组织转移到高蔗糖培养基中温育两周。将小苗转移到MSOD培养基(不含ABA)培养皿中温育两周。然后将带根的植株转移到土壤中。玉米细胞转化方法领域的技术人员可以修改该方法以提供含有本发明DNA构建体的转基因玉米植株，或者使用其它方法诸如粒子枪，已知其提供转基因单子叶植物。MON88017植株和种子具有可再生部分。种子的可再生部分包括但不限于胚、子叶、以及芽或根的分裂组织。发明也包括玉米植株MON88017的植株部分，包括但不限于花粉、胚珠、枝条、根和叶。发明也包括MON88017种子的可提取成分，包括但不限于蛋白质、粗粉、玉米粉以及油。实施例2[Para69]玉米植株MON88017是从许多转基因玉米植株中选择出的，对草甘膦植物性和再现性损伤有耐受性。目前商品品质转基因植物的成功生产需要产生大量转基因植株。在本发明中，MON88017是用包括pMON53616的不同DNA构建体转化的大约472个R0事件中的一种植株。MON88017事件是通过一系列分子分析、草甘膦耐受筛选、昆虫抗性筛选以及表达分析筛选而从许多事件中选择出来的。转基因玉米植株对玉米根虫摄食损伤抗性是通过温室和田间筛选来分析的。使用由lowa State University的Oleson和Tollefson开发的节损伤标准(NIS)来评定根损伤，这种等级划分法使用0-3的数值来评定对玉米根造成的损伤。0.00的数值描述无摄食损伤并且是最低评定，1.00描述了在大约两英寸的茎干之中一个节或相当于整个节被吃光，2.00描述了两个完整节被吃掉，3.00描述了三个或更多节被吃掉，并且是最高评定。在完整节之间被吃掉的损伤记录为节点损失的百分比，即1.50描述了1 1/2个节被吃掉、0.25描述了一个节的1/4被吃掉。通过在每直英尺的行施加1500-2000个卵而用玉米根虫幼虫人工侵染处于V3-V4生长阶段的大田区块。杀虫剂处理的行是用Tefluthrin杀虫剂(Force3G，Zeneca Ag Products)以每1000英尺行5盎司的比率处理的。MON88017在多次试验中显示出0.08到0.11之间的根损伤率(RDR)。无杀虫剂处理的等值线显示了1.28的平均RDR。杀虫剂处理不含杀虫蛋白的玉米植株显示了0.44的平均RDR。用草甘膦除草剂处理转基因玉米植株来确定对除草剂的耐受性水平。试验地块用草甘膦(RoundupWeatherMax，MonsantoCo，St Louis，MO)喷洒，在生长季节期间施加两次，一次在V4、一次在V8生长阶段，比率为每英亩1.125和2.25磅活性成分。在收获时测定玉米种子产量，作为相对于未喷洒(WeatherMax 0)的MON8801 7地块的百分比产量。表1中显示的结果证明MON88017对草甘膦高度耐受，并且没有降低产量，令人惊讶的是，经处理的地块比处理的地块平均产量更高。表1.用草甘膦处理的与未经处理的MON88017相比的百分比产率[Para73]处理 重复平均 表1图例在V4-V8叶阶段的每种WeatherMax处理的百分比产率与在0到V4叶阶段的WeatherMax处理的百分比产率相比较，用每种重复处理中0-V4处理的结果确定100％产率基线。实施例3[Para76]通过首先将谷粒加工成细粉而从玉米粒中提取出MON88017基因组DNA和对照物质。将大约6克加工过的谷粒转移到50ml(毫升)锥形管中，然后将约16ml CTAB提取缓冲液[1.5％(w/v)CTAB，75mM Tris-HCI pH 8.0，100mM EDTA pH 8.0，1.05M NaCI，和0.75％(w/v)PVP(MW 40,000)]以及8微升RNase(10mg/ml，Roche)加入到加工过的谷粒中。将样品在65℃间歇搅拌温育30-60分钟，然后使其冷却到室温。将大约15ml的氯仿∶异戊醇(24∶1(v/v))加入到样品中。将悬浮液混合5分钟，经约16,000x g室温离心5分钟分离两相。将水层(上层)转移到干净的50ml锥形管中。将大约1/10体积(约1.5ml)的10％CTAB缓冲液[10％(w/v)CTAB和0.7M NaCI]以及等体积的氯仿∶异戊醇[24∶1(v/v)]加入到水相，然后混合5分钟。将样品经约16,000xg离心5分钟分离各相。去除水层(上层)，与等体积(约15ml)的CTAB沉淀缓冲液[1％(w/v)CTAB，50mM Tris pH 8.0，和10mM EDTA pH 8.0]混合，使其在室温放置1-2小时。将样品经约10,000xg室温离心10分钟沉淀DNA。弃去上清液，将沉淀溶于大约2ml的高盐TE缓冲液(10mMTris-HCI pH 8.0，10mM EDTA pH 8.0，和1M NaCl)中。在37℃进行平缓旋转以帮助溶解沉淀。如果必要，将样品经约23,000xg室温离心2分钟以沉淀并去除碎片。加入大约1/10体积(约150μl)的3M NaOAc(pH 5.2)和2体积(约4ml，相对于上清液)的100％冰乙醇以沉淀DNA。将沉淀的DNA加入含有70％乙醇的微离心管中。DNA在微离心管中以最大速度(约14,000rpm)沉淀约5分钟，真空干燥，重新溶解在TE缓冲液(pH 8.0)中。然后将DNA贮于4℃冰箱中。用选择出的限制酶例如SspI、EcoRV、ScaI和SmaI在200μl的酶限制性缓冲液中于37℃消化10μg基因组DNA超过4小时，然后在70-80℃灭活酶15分钟。用苯酚和氯仿提取DNA，用EtOH沉淀，溶于200μl中。然后让DNA在1ml连接缓冲液和T4DNA连接酶中于4℃自身连接过夜。在70-80℃灭活连接反应15分钟，用EtOH沉淀，溶于200μl中。然后将DNA用作PCR模板，PCR采用CP4 EPSPS或CRY3Bb编码区内部的特异性引物，使用High Fidelity ExpandSystem(Roche)按照厂商提供的方案进行。用嵌套引物进行的第二轮PCR用于特异性扩增。然后克隆PCR产物用于序列分析。使用Universal GenomeWalker试剂盒(cat#K1807-1，Clonetech，PaloAlto，CA)分离5′和3′转基因/基因组区DNA，使用其中包括的衔接引物AP1和AP2以及厂商提供的方案。利用PCR从MON88017基因组DNA分离5′(SEQ ID NO3，图3)和3′(SEQ ID NO4，图4)转基因/基因组DNA。用限制酶消化总基因组DNA(约10μg)。37℃消化过夜后使用QIAquick PCR纯化柱纯化DNA。用50μl水将DNA从柱上洗脱然后稀释到1ml。将稀释的洗脱液(85μl)与10μl缓冲液(10X)和5μl T4连接酶混合以环化片段。16℃温育过夜后，将连接酶在70℃热灭活。用一系列嵌套引物PCR扩增样品。分离3′转基因/基因组区的引物组合包括SEQID NO8、SEQ ID NO9和AP1作为第一引物，SEQ ID NO10和AP2作为第二引物，SEQ ID NO11用作测序引物；5′转基因/基因组区的分离包括SEQ ID NO12、SEQ ID NO14和AP1作为第一引物，SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和AP2作为第二引物。PCR条件包括首次PCR＝7个循环的94℃2秒，72℃10分钟；37个循环的94℃2秒，67℃10分钟；1个循环的67℃10分钟；第二次和第三次PCR＝5个循环的94℃2秒，72℃10分钟；24个循环的94℃2秒，67℃10分钟；1个循环的67℃10分钟。可替代地，经PCR DNA扩增MON88017事件的5′和3′转基因/基因组插入区可以以这样的条件进行，包括7个循环的94℃25秒，72℃3分钟；37个循环的94℃25秒，67℃3分钟；1个循环的67℃7分钟。所有随后的扩增以下面的条件进行7个循环的94℃2秒，72℃4分钟；37个循环的94℃2秒，67℃4分钟；1个循环的67℃7分钟。所有扩增子在0.8％琼脂糖凝胶上用溴乙锭染色显现。用于测序的DNA的制备是通过直接用QlAquick PCR纯化试剂盒(cat#28104，Qiagen Inc.，Valencia，CA)纯化PCR样品，或者通过从凝胶上提取合适片段并使用QIAquick Gel Extraction试剂盒(cat#28704，Qiagen Inc.)。使用TOPO TA Cloning试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)亚克隆MON88017转基因/基因组插入片段的侧翼区域的DNA片段。5′转基因/基因组区域的DNA序列示于图3，3′转基因/基因组区域的DNA序列示于图4，完整的转基因插入片段和相连接的侧翼基因组DNA示于图5。通过重叠PCR产物从MON88017基因组DNA中分离全长转基因/基因组插入序列(SEQ ID NO5，图5)。设计系列DNA引物来产生扩增子，其含有来自MON88017基因组的转基因插入片段和邻接的侧翼基因组区的一部分的DNA片段。对DNA片段测序，将序列合并形成片段序列的毗连群(contig)，就是本发明的SEQ ID NO5。DNA引物对组合是SEQ ID NO16和SEQ ID NO17，SEQ IDNO18和SEQ ID NO17，SEQ ID NO19和SEQ ID NO20，SEQID NO21和SEQ ID NO22，SEQ ID NO23和SEQ ID NO24，SEQ ID NO25和SEQ ID NO26，SEQ ID NO25和SEQ ID NO27。所有PCR反应都使用总基因组DNA。所有扩增子在0.8％琼脂糖凝胶上用溴乙锭染色显现。用于测序的DNA的制备通过直接用QlAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR样品，或者通过从胶上提取合适片段并使用QIAquick Gel Extraction试剂盒。使用DNA序列分析设备(ABI PrismTM377，PE Biosystems，Foster City，CA)和DNASTAR序列分析软件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)生产DNA序列。实施例4[Para83]使用DNA事件引物对来产生诊断玉米事件MON88017的扩增子。诊断MON88017的扩增子包含至少一个接合序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。将产生MON88017的诊断性扩增子的事件引物对如表2所示，其中的引物对包括但不限于用于5′扩增子序列的SEQ IDNO6和SEQ ID NO7。引物SEQ ID NO6在玉米基因组中的位置如图3所示，开始于核苷酸952位。引物SEQ ID NO7在转基因插入片段中的位置如图5所示，开始于核苷酸450位。在MON88017DNA的DNA扩增方法中使用SEQ ID NO6和SEQ ID NO7得到的期望扩增子大小是大约550bps。除了这些引物对，任何源自SEQ IDNO3或SEQ ID NO4的引物对是本发明的方面，其在DNA扩增反应中产生诊断MON88017或其子代的扩增子。包含SEQ ID NO3或其互补序列的至少11个连续核苷酸的任何单一的分离DNA多核苷酸引物分子是发明的一方面，其在产生诊断MON88017扩增子的DNA扩增方法中是有用的。包含SEQ ID NO4或其互补序列的至少11个连续核苷酸的任何单一的分离DNA多核苷酸引物分子是发明的一方面，其在产生诊断MON88017扩增子的DNA扩增方法中是有用的。用于这种分析的扩增条件的例子例举在表2和表3中，然而，这些方法的任何修正或者使用与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4同源或互补的DNA引物或者MON88017转基因插入片段(SEQ ID NO5)中含有的遗传元件的DNA序列都在现有技术之内，其产生诊断MON88017的扩增子。诊断性扩增子包含与至少一种转基因/基因组接合DNA (SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)或其实质性部分同源或互补的DNA分子。用于事件MON88017植物组织样品的分析应当包括来自事件MON88017的阳性组织对照、来自非事件MON88017的玉米植株的阴性对照以及不含玉米基因组DNA的阴性对照。将扩增内源玉米DNA分子的引物对将用作DNA扩增条件的内部对照，这些引物对的例子是SEQ ID NO28和SEQ ID NO29，其扩增大约239bp的DNA片段。另外的引物序列可由DNA扩增方法领域的技术人员从SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5中选择，由示于表2和表3的方法产生扩增子的条件可以不同，但是都产生诊断MON88017 DNA的扩增子。用表2和表3的方法修正来使用这些DNA引物在发明的范围中。由至少一种源自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ IDNO5的DNA引物序列产生的诊断MON88017的扩增子是发明的一方面。含有源自SEQ ID NO3或SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的DNA检测试剂盒是发明的一方面，当它用于DNA扩增方法时产生MON88017的诊断性扩增子。玉米植物或种子是发明的一方面，其中当在DNA扩增方法中测试时它的基因组产生诊断MON88017的扩增子。可使用如表3所示的Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700或者Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪或者通过本领域技术人员已知的方法和装置进行MON88017扩增子的分析。表2.用于鉴别MON88017的5′转基因插入片段/基因组接合区的PCR程序和反应混合物条件。 表3.用于各种商业供应的热循环仪的推荐PCR参数。
使用下面的循环参数在Stratagene Robocycler、MJEngine、Perkin-Elmer 9700或者Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪中进行DNA扩增。MJ Engine或Eppendorf MastercyclerGradient热循环仪应当以计算出的模式运行。以设置为最大的变速运行Perkin-Elmcr 9700热循环仪。实施例5[Para90]对分离自如实施例3所述的MON88017和对照玉米组织的基因组DNA进行Southern印迹分析。使用Hoefer DyNA Quant 200荧光计(Pharmacia，Uppsala，Sweden)以Roche分子大小标志IX作为DNA校准标准进行DNA样品定量。将大约20μg来自测试物质的基因组DNA和10μg来自对照物质的基因组DNA用于限制酶消化。对于插入稳定性分析，使用大约10μg来自测试物质的基因组DNA。使用1.00单位合适的限制酶于约500μl总体积中于37℃进行过夜消化。消化之后，样品的沉淀是通过加入1/10体积(50μl)的3M NaOAc(pH 5.2)和2体积(1ml，相对于原始消化体积)的100％乙醇，接着通过在-20℃冰箱中温育至少30分钟。消化的DNA在微型离心机中以最大速度沉淀，用70％乙醇漂洗，干燥，再溶解在TE缓冲液中。通过PCR扩增pMON53616模板DNA的植物表达盒部分来制备DNA探针。通过用随机引物方法(RadPrime DNA LabelingSystem，Life Technologies)用32P-dCTP(6000Ci/mmol)标记大约25ng的每种探针(除了NOS 3′和TaHspl 73′聚腺苷化序列)。通过PCR使用25ng的DNA探针模板按下面的方式标记NOS 3′和tahspl 7 3′聚腺苷化序列特异于模板的有义和反义引物(各0.25mM)；1.5mMMgCl2；dATP、dGTP和dTTP各3mM；约100mCi的32P-dCTP(6000Ci/mmol)；以及2.5单位的Taq DNA聚合酶，终体积20ml。循环条件如下1个循环的94℃3分钟；2个循环的94℃45秒，52℃30秒，72℃2分钟；1个循环的72℃10分钟。所有的放射性标记探针使用Sephadex G-50柱(Roche，Indianapolis，IN)纯化。用作进行标记辅助的育种方法或者检测样品中的MON88017 DNA的探针的合成DNA分子可以包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中所述的转基因/基因组接合DNA分子的DNA序列或其实质性部分。实施例6[Para95]用于鉴别来自含有事件MON88017的纯合子代杂合的方法描述在接合性分析中，用于该分析的条件的例子描述在表4和表5中。用于接合性分析的DNA引物是引物(SEQ ID NO30)、(SEQ IDN031)、(SEQ ID NO32)、6FAMTM标记的引物(SEQ ID NO33)和VICTM标记的引物(SEQ ID NO34)，6FAM和VIC是连接到DNA引物上的Applied Biosystems(Foster City，CA)的荧光染料产品。当用于这些反应方法中时，SEQ ID NO30、SEQ ID NO31和SEQID NO32产生非转基因玉米的DNA扩增子、含有事件MON88017 DNA的杂合玉米的两种DNA扩增子、以及不同于其它非MON88017玉米植株的纯合MON88017玉米的DNA扩增子。对于该分析的对照来说，应当包括来自含有事件MON88017 DNA的纯合和杂合玉米的阳性对照、来自非转基因玉米的阴性对照、以及不含模板DNA的阴性对照。优化该分析，以用于Stratagene Robocycler、MJEngine、Perkin-Elmer 9700或者Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪。其它本领域技术人员已知的方法和装置是本领域技术水平之内的，它们产生扩增子来对与MON88017植株杂交得到的子代的接合性进行诊断。表4.接合性分析反应溶液 表5.接合性分析热循环条件 使用下面的循环参数在Stratagene Robocycler、MJEngine、Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪中进行DNA扩增。当在Eppendorf Mastercycler Gradient或MJ Engine中运行PCR时，热循环仪应当以计算出的模式运行。当在Perkin-Elmer 9700中运行时，以设置为最大的变速运行热循环仪。上面公开的并在权利要求中叙述的玉米MON88017种子已经根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110。ATCC保藏号是PTA-5582。保藏将在保藏中心保持30年的时期、或者最后请求之后5年、或者专利的有效期内中最长的一段时间，在那个时期期间将根据必要性提供代替品。实施例7[Para102]可由玉米事件MON88017生产诸如食品和日用品这样的产品，如果在这些食品和日用品中以足够水平被检测到，这些食品和日用品预期含有能够诊断玉米事件MON88017材料在这些日用品和食品中存在的核苷酸序列。这些食品和日用品的例子包括但不限于玉米油、玉米粗粉、玉米面、玉米面筋、玉米饼、玉米淀粉、以及打算作为食物源供动物消费的任何其它食品、或者另外打算作为膨胀剂、或者打算作为化妆组合物中的成分用于化妆用途等。基于探针或引物对的核酸检测方法和/或试剂盒可以被开发来允许检测生物样品中诸如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2这样的MON88017核苷酸序列，其中探针序列或引物序列选自如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5中所示的序列，这样的检测能诊断这种样品中玉米事件MON88017。已经图解和详述了本发明的原理，对本领域技术人员来说应当显而易见的是，发明可以在不偏离这些原理下在排列和细节方面进行修改。我们要求所附权利要求书的精神和范围之内的所有改进的权利。本说明书中所引用的所有出版物和公布专利文件都引入这里作为参考，其程度等同于具体并分别指出各个出版物或专利申请被引用作为参考。
关于保藏的微生物或其它生物材料的说明(PCT 13bis条) PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重新印刷)
序列表<110>Monsanto Technology LLCBeazley，KimCoombe，TimGroth，MarkHinchey，TerriPershing，JayVaughn，TyZhang，Bei<120>玉米植株MON88017和组合物以及检测它们的方法<130>38-15(53143)<150>60/529,477<151>2003-12-15<160>34<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>玉米基因组和非玉米转基因插入片段的嵌合DNA<400>1tgacggtgac gatatattca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>玉米基因组和非玉米转基因插入DNA的嵌合DNA<400>2cagttttaaac agagtcgggt 20<210>3<211>1461<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>玉米基因组和非玉米转基因插入DNA的嵌合DNA<400>3gaccagcgtc tcccgccgca cccgcagtct gcaccgtaga gatcggatgt acaggcatgt 60agcattaggc tattcagcgg ctctcgtatc ttattcccta ccatctattt tatctacact 120gtataatact ccctccgttt attgtttatt tgtcgttgaa tagttcaata tttgcactgt 180ccagcgacaa ctaaaatgaa acggagtgag gtagtgtttt gtacaaccat atatagaggt 240gcccaaacgg gcggcccggc ccgggcccgt caggcccgac ggttaatcgg gccgtgcccg 300gccggccccg tgccgtagcc gtggcccagg cacggcgtgc cgggccagcc gtttaactgg 360tcacgttctc ccgcctaact gaaggacact aaccaatata actcgtgagc atttgttgta 420aatagctaat ataaaatgta aatatatata ctatgtttta taaaataaaa aatatataat 480cgtgccggcc aggccggcac tgcgggccaa gacagcggcc caagcacgtc acggttctcg 540tgccgggccg gccccggcat cgtgtttcag gccggtccgt taggcacggc tcatttggcc 600ctctataacc atatatcata ttcatcgacg accttgggct aaggcagacc gacggccgcc 660ctaggcccca gatctataga ggcttaatgc taaatataaa ttcagtagtt agactatcaa 720
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<223>玉米基因组和非玉米转基因插入DNA的嵌合DNA<400>4caaactccac atgggcttct cgggcgacaa gaatgaactg atcattggtg ctgagtcctt 60cgtctccaac gagaagatct acatcgacaa gatcgagttc atccccgtcc agctgtgata 120ggaactctga ttgaattctg catgcgtttg gacgtatgct cattcaggtt ggagccaatt 180
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<223>玉米基因组和非玉米转基因插入DNA的嵌合DNA<400>5tacccgatca gagcgctaag cagcagaatc gtgtgacaac gctagcagct ctcctccaac 60acatcatcga caagcacctt ttttgccgga gtatgacggt gacgatatat tcaattgtaa 120atggcttcat gtccgggaaa tctacatgga tcagcaatga gtatgatggt caatatggag 180aaaaagaaag agtaattacc aatttttttt caattcaaaa atgtagatgt ccgcagcgtt 240attataaaat gaaagtacat tttgataaaa cgacaaatta cgatccgtcg tatttatagg 300
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<210>9<211>30<212>DNA<213>小麦<400>9tgtaatcggc taatcgccaa cagattcggc 30<210>10<211>32<212>DNA<213>小麦<400>10cggccgctcg agcaggacc gcagaagcta gc 32<210>11<211>33<212>DNA<213>小麦<400>11gatggggatc agattgtcgt ttcccgcctt cag 33<210>12<211>27<212>DNA<213>水稻<400>12cactttgggc caccttttat taccgat 27<210>13<211>29<212>DNA<213>水稻
<400>13ctgatgtttt cacttttgac caggtaatc29<210>14<211>28<212>DNA<213>水稻<400>14taattactct ttctttttct ccatattg 28<210>15<211>26<212>DNA<213>水稻<400>15catactcatt gctgatccat gtagat 26<210>16<211>24<212>DNA<213>玉米<400>16cctattttaa attttgtcct gaac 24<210>17<211>27<212>DNA<213>水稻<400>17gatcgtggat agcactttgg gctttag 27
<210>18<211>29<212>DNA<213>玉米<400>18accgccacct atcatatacat acatgatc29<210>19<211>27<212>DNA<213>水稻<400>19aggtggccca aagtgaaatt tactctt 27<210>20<211>28<212>DNA<213>拟南芥<400>20gcagatctac atccgagagc cccattcc 28<210>21<211>28<212>DNA<213>水稻<400>21tcgatctttg gccttggtag tttgggtg 28<210>22<211>28<212>DNA<213>根癌农杆菌
<400>22gctcatcagg cagccttcgt atcgggag 28<210>23<211>27<212>DNA<213>根癌农杆菌<400>23ctcgatcacc gcatcgccat gagcttc 27<210>24<211>28<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>24aagacctggg cgtccttcag caacagga 28<210>25<211>28<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>25cctggaaggc cttcatggcc caagtcga 28<210>26<211>27<212>DNA<213>玉米<400>26aacagaggcg tgaccggtca gcgactc 27
<210>27<211>28<212>DNA<213>玉米<400>27tccttcgcgt aggaagtagg cacacgag 28<210>28<211>20<212>DNA<213>玉米<400>28cgtggtgatc acaaacagta 20<210>29<211>21<212>DNA<213>玉米<400>29ctatatgaca gacccatcgt t21<210>30<211>20<212>DNA<213>玉米<400>30cacatcatcg acaagcacct 20<210>31<211>22<212>DNA<213>玉米
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<223>用于接合性分析的标记的引物<400>33tgacggtgac gatat 15<210>34<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于接合性分析的标记的引物<400>34agaaggccgg agtcg 1权利要求
1.用作DNA探针分子或DNA引物分子的分离的DNA分子或其片段，其中所述DNA分子或其片段与选自SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的DNA分子同源或互补。
2.权利要求1的分离的DNA引物分子，包含SEQ ID NO3的至少11个连续核苷酸或其互补序列，用于DNA扩增方法中产生包含SEQ ID NO1的扩增子，其中所述扩增子诊断玉米事件MON88017DNA。
3.权利要求1的分离的DNA引物分子，包含SEQ ID NO4的至少11个连续核苷酸或其互补序列，用于DNA扩增方法中产生包含SEQ ID NO2的扩增子，其中所述扩增子诊断玉米事件MON88017DNA。
4.检测样品中相应于玉米事件MON88017的DNA存在的方法，该方法包括(a)将含有DNA的样品与DNA引物对接触，其中所述DNA引物对包括至少一种权利要求1的DNA引物分子；(b)进行多核酸扩增反应，从而产生扩增子；以及(c)检测所述扩增子，其中所述扩增子含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。
5.稳定转化的玉米植株，当通过权利要求4的方法分析时，它的DNA产生含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的DNA扩增子。
6.权利要求4的方法中，其中所述DNA引物对是SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
7.检测样品中相应于玉米事件MON88017的DNA存在的方法，该方法包括(a)将含有DNA的样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与玉米事件MON88017的基因组DNA杂交并且在严格条件下不与对照玉米植株基因组DNA杂交，其中所述探针与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2同源或互补；以及(b)使样品和探针经受严格杂交条件；以及检测探针与DNA的杂交。
8.草甘膦耐受的并且有玉米根虫抗性的玉米植株，其中草甘膦耐受性状与玉米根虫抗性性状发生在同一基因座，并且遗传连锁到标志多核酸的互补序列上，其中所述标志多核酸分子与选自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的DNA分子同源或互补。
9.确定玉米事件MON88017子代的接合性的方法，包括(a)将含有玉米DNA的样品与包括SEQ ID NO30、SEQ ID NO31和SEQ ID NO32的引物组接触，当用于与玉米事件MON88017基因组DNA进行核酸扩增反应时，所述引物组能产生诊断玉米事件MON88017的第一扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生第一扩增子；(c)检测第一扩增子；(d)将含有玉米DNA的样品与所述引物组接触，当用于与玉米植株基因组DNA进行核酸扩增反应时，所述引物组能产生第二扩增子，其含有与被鉴别为玉米事件MON88017的转基因插入片段的玉米基因组区同源的天然玉米基因组DNA；(e)进行核酸扩增反应，从而产生第二扩增子；(f)检测第二扩增子；(g)比较样品中的第一和第二扩增子，其中两种扩增子的存在表明样品对于转基因插入片段是杂合的。
10.产生对玉米根虫幼虫造成的根摄食损伤有抗性的并且耐受草甘膦除草剂施用的玉米植株的方法，包括(a)将第一草甘膦耐受/玉米根虫抗性的玉米植株MON88017亲本植株与缺少草甘膦耐受性和玉米根虫摄食损伤的第二亲本玉米植株有性杂交，从而产生许多子代植株；(b)用草甘膦处理所述子代植株；(c)选择耐受草甘膦的所述子代植株，其中所述子代植株也对玉米根虫摄食损伤有抗性。
11.由权利要求10的方法产生的杂种玉米种子，其中至少一个亲本是玉米事件MON88017。
12.控制种植玉米事件MON88017的大田的杂草的方法，包括将含有有效剂量草甘膦的除草剂施加到种植所述玉米事件MON88017的大田的步骤。
13.命名为MON88017的玉米植株的种子，是具有已被保藏为ATCC保藏号PTA-5582的所述玉米植株的典型种子。
14.通过生长权利要求1的种子而产生的玉米植株MON88017或其部分。
15.权利要求2的玉米植株MON88017或其部分，包括花粉、胚珠、种子、根或叶。
16.权利要求2的玉米植株MON88017，进一步包括其子代。
17.权利要求4的玉米植株MON88017，其中所述玉米植株或其子代的基因组包含选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的DNA分子。
18.权利要求4的玉米植株MON88017或其部分，当在包含由SEQID NO6和SEQ ID NO7组成的DNA引物对的DNA扩增方法中测试时，其基因组产生诊断玉米植株MON88017的扩增子。
19.权利要求5的玉米植株MON88017，其中所述玉米植株是对玉米根虫和草甘膦耐受的。
20.权利要求的玉米植株MON88017，在其基因组中包含连锁的MON53616的植株表达盒。
21.包含选自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的至少大约11个到大约20个连续核苷酸的分离的核酸区段。
22.权利要求21所述的分离的核酸区段，用于核酸扩增方法中检测生物样品中玉米事件MON88017核酸的存在。
23.由获自玉米事件MON88017的基因组DNA纯化或生产的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的序列或与该序列互补的核苷酸序列。
24.检测生物样品中相应于玉米事件MON88017的核苷酸存在的方法，该方法包括(a)将所述样品与第一和第二引物接触，其中所述第一引物是选自SEQ ID NO3和SEQ ID NO1的至少11个连续核苷酸的核苷酸序列，所述第二引物是选自SEQ ID NO1和SEQID NO5的反向互补序列的至少11个连续核苷酸的核苷酸序列；(b)进行核酸扩增反应，从而产生复制子；(c)检测所述复制子，其中所述复制子包含SEQ ID NO1；或者(d)将所述样品与第一和第二引物接触，其中所述第一引物是选自SEQ ID NO4和SEQ IDNO2的反向互补序列的至少11个连续核苷酸的核苷酸序列，所述第二引物是选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO5的至少11个连续核苷酸的核苷酸序列；(b)进行核酸扩增反应，从而产生复制子；和(c)检测所述复制子，其中所述复制子包含SEQ ID NO2。
25.检测生物样品中一种或多种玉米事件MON88017多核苷酸的存在的方法，该方法包括(a)将样品与探针在严格杂交条件下接触，其中所述探针包含选自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的序列的连续核苷酸序列或与该序列互补的连续核苷酸序列；(b)检测所述探针与所述样品的杂交，其中所述探针与所述样品的所述杂交诊断所述样品中所述一种或多种玉米事件MON88017多核苷酸的存在。
26.包含选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO5的核苷酸序列的组合物，其中所述组合物是选自玉米粗粉、玉米面、玉米油、玉米须、玉米淀粉以及加工食品的日用品。
27.用于检测生物样品中玉米事件MON88017的存在的至少大约11个到大约20个连续核苷酸的探针或引物，其中所述连续核苷酸选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5。
28.如权利要求27中所述的探针或引物，其中所述探针或引物包括选自脱氧核糖核酸、核糖核酸和核苷酸类似物的核苷酸。
29.如权利要求28中所述的探针或引物，其中所述探针或引物用至少一种荧光团标记。
30.用于检测生物样品中玉米事件MON88017核苷酸的存在的长度为至少大约21个到大约50个或更多的连续核苷酸的探针或引物，选自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5中所示的连续核苷酸。
31.包含玉米事件MON88017核苷酸序列的商品或日用品，其中所述序列选自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
32.权利要求31的商品或日用品，选自玉米油、玉米淀粉、玉米粗粉、玉米面、化妆品和膨胀剂。
全文摘要
本发明提供了命名为MON88017的玉米植株以及其所含的DNA组合物。也提供了基于DNA序列检测玉米植株MON88017存在的分析方法，以及该DNA序列作为分子标志在DNA检测方法中的用途。
文档编号C12Q1/68GK1933723SQ200480041699
公开日2007年3月21日 申请日期2004年12月14日 优先权日2003年12月15日
发明者K·A·比兹利, T·R·库姆, M·E·格罗思, T·B·欣基, J·C·佩尔兴, T·T·沃恩, 张蓓 申请人:孟山都技术有限公司