专利名称：一个与小麦籽粒硬度相关的基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个与小麦籽粒硬度相关的基因及其编码蛋白与其在小麦品质改良中的应用。
背景技术：
籽粒硬度是小麦品质的重要性状之一，它影响小麦的出粉率、面粉颗粒大小、润麦加水量、破损淀粉粒数量和最终的食品加工品质等，是市场上对其进行分级、定价的重要依据。按胚乳质地可把普通小麦分为硬质麦、混合麦和软质麦。籽粒硬度主要由位于染色体5D短臂(5DS)上的主效基因Pina和Pinb(统称为puroindoline)控制。1986年，Greenwell和Schofield从小麦籽粒中提取出一组分子量约为15kD的蛋白多肽，命名为friabilin蛋白，大大推进了分子水平上籽粒硬度的研究进程。研究表明，Puroindoline蛋白是friabilin蛋白的主要成分，是决定小麦籽粒硬度的基础，主要由两种蛋白组分puroindoline a(PINA)和puroindoline b(PINB)组成，其编码基因分别命名为Pina和Pinb。PINA蛋白缺失或编码PINB蛋白的基因(Pinb)发生突变均可造成小麦胚乳质地变硬。Giroux等对两个硬麦品种进行研究，发现Pinb基因中有一位点发生了突变，导致相应氨基酸序列中第46位的Gly变为Ser，将此突变类型命名为Pinb-D1b。此后，相继有多种硬度突变类型被发现。Lillemo和Morris发现了Pinb基因两种新的突变类型，一个是第60位的Leu变为Pro，将此突变类型命名为Pinb-D1c，另一个是第44位氨基酸由Trp变为Arg，将此突变类型命名为Pinb-D1d。Morris等发现，在一种硬红春小麦的Pinb基因中第39位氨基酸Trp突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-D1e；在一种硬红冬小麦的Pinb基因中第44位氨基酸Trp突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-Dif；在另一种硬红冬小麦的Pinb基因中第56位氨基酸Cys突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-D1g。最近，Massa等在山羊草中新发现了六种Pina基因和四种Pinb基因的等位变异，但均表现为软质。Xia等经研究发现Pinb-D1b是我国小麦中最为常见的硬度变异类型，并在农大3213和农大3395等10个品种(系)中发现Pinb基因中相应于第42位氨基酸有一碱基A缺失的新变异类型，将其命名为Pinb-D1p。有关Pinb基因及其突变型的总结如表1所示表1 已知的Pinb基因的表现型、突变类型、分子变化及参考文献
发明内容本发明的目的是提供一个与小麦籽粒硬度相关的基因及其编码蛋白。
本发明所提供的与小麦籽粒硬度相关的基因，名称为Pinb-D1q，来源于小麦，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由447个碱基组成，其编码框为自5’端第1到第444位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质；与未发生突变的Pinb的编码基因相比，它的核苷酸序列自5’端第218位碱基由g变成了t，使Ser的密码子TGG突变成了Leu的密码子TTG。
本发明所提供的与小麦籽粒硬度相关基因的编码蛋白，名称为PinB-D1q，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与小麦籽粒硬度相关的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №1由148个氨基酸残基组成，与野生型Pinb-D1a相比，其氨基酸序列第44位由Ser突变为Leu，同时，突变后的Pinb基因不再表达friabilin蛋白，由此而导致小麦籽粒SKCS硬度提高。
含有上述与小麦籽粒硬度相关基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增小麦籽粒硬度相关基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。
不同硬度基因的变异类型对籽粒硬度影响不同，本发明的Pinb-D1q突变型小麦的籽粒硬度同Pinb未发生突变的同品种小麦相比有较大提高。因此，Pinb-D1q对小麦籽粒硬度的基因工程改良将起到重要作用，对优良小麦品种的培育也具有重大意义。利用该品种和其它品种小麦得到的不同专用类型的面粉，可以满足各种小麦制品的需要，同时也有助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生物工程公司合成。
实施例1、小麦Pinb-D1q的获得及Puroindoline基因型分析小麦材料选择由北京农林科学院培育、2002年审定的优质小麦品种京冬11，其亲本为长丰3号/041//京冬6号。该品种具有优良的面条特性。
一、籽粒硬度测定将京冬11小麦样品在同一条件下放置3d，使小麦籽粒的含水量控制在11-13％之间。用单粒谷物硬度仪(SKCS 4100，瑞典Perten公司)测定300粒小麦样品的硬度值，根据测定结果确定籽粒的硬度级别，同时记录千粒重和籽粒直径。籽粒硬度值小于40多为软质麦，大于60多为硬质麦，介于40和60之间者多为混合麦。
SKCS分析结果表明，京冬11的SKCS硬度指数(±标准差)和分布分别为51±12和07-22-45-26，级别分类为3级，属于混合麦，其中偏软和偏硬的籽粒均有较大分布。
二、小麦Pinb-D1q的获得对步骤一经SKCS分析的京冬11小麦样品中的puroindoline(包括PinA和PinB)进行分析，具体方法包括以下步骤
1、提取小麦籽粒基因组DNA选取一粒硬质有代表性的种子(将其切割后根据其角质率判断是否与SKCS分析结果吻合)，提取小麦籽粒基因组DNA，具体方法为1)用锤子砸碎后放入1.5mL离心管中，加入1mL样品提取液(含288mM NaCl，200mM Tris-HCl，25mM EDTA，0.5％SDS)，摇30分钟，使其充分混匀；2)在4℃、12,000rpm下离心15分钟，移上清至另一2mL离心管中，加入等体积的酚/氯仿(1∶1)；3)12,000rpm离心15分钟，移上清至另一2mL离心管中，加入0.5倍上清体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分摇匀；4)12,000rpm离心10分钟，移上清至另一新的2mL离心管中，加入1/10体积的3M NaAC(pH＝5.2)和0.6倍上清体积的异丙醇沉淀DNA，轻轻混匀；5)12,000rpm离心15分钟，弃上清，加入0.5mL 70％乙醇，静置5min；6)12,000离心5min，弃上清。真空干燥后加入100μL TE溶解沉淀，沉淀即为小麦籽粒基因组DNA。最后，用紫外分光光度计检测小麦籽粒基因组DNA的浓度，-20℃下保存备用。
2、用PCR方法鉴定京冬11的硬质小麦是否为Pinb-D1b突变型鉴定京冬11的硬质小麦是否为Pinb-D1b变异类型，即检测Pinb基因的第46位点是否由甘氨酸的密码子(GGC)变为丝氨酸的密码子(AGC)。所用的引物序列如下鉴定Pinb-D1b突变型的特异引物系列为引物1(上游)5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’引物2(下游)5’-CTCATGCTCACAGCCGCT-3’鉴定非Pinb-D1b类型，即检测Pinb基因46位点甘氨酸未发生变化的类型，所用的引物序列为引物1(上游)5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’引物3(下游)5’-CTCATGCTCACAGCCGCC-3’以步骤1获得的京冬11小麦的籽粒基因组DNA为模板，分别在Pinb-D1b特异引物(引物1和引物2)和Pinb-D1b非特异引物(引物1和引物3)的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系的组成均为1.5mmol/L MgCl2，0.3mmol/L dNTP，上、下游引物各10pmol，模板DNA 200ng，0.5U Taq酶，加1×PCR缓冲液(含10mmol/L Tris-HCl，pH 9.0，50mmol/L KCl，1.0％Triton X-100)定容至25μL。PCR反应程序为先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，58℃退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后，72℃延伸5min。PCR扩增结束后，取上述两种PCR扩增产物各10μL分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(采用1×TAE缓冲液；溴化乙锭(EB)染色，160V，1.5小时)，电泳结束后用凝胶成像系统(MultiGenius Gel Documentation and AnalysisSystem)扫描成像并用计算机进行分析，分析结果表明用Pinb-D1b非特异引物(引物1和引物3)扩增出了250bp的DNA片段，而用Pinb-D1b特异引物(引物1和引物2)未扩增出250bp的DNA片段，证明京冬11的硬质小麦不是Pinb-D1b突变型，对其用步骤3的方法作进一步鉴定。
3、用PCR及酶切的方法鉴定京冬11的硬质小麦是否为Pinb-D1c突变型鉴定京冬11的硬质小麦是否为Pinb-D1c变异类型，即检测Pinb基因的第60位点是否由亮氨酸的密码子(CTG)变为脯氨酸的密码子(CCG)。首先扩增Pinb全长序列，所用的引物序列如下引物1(上游)5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’引物4(下游)5-TCACCAGTAATAGCCACTAGGGAA-3’以步骤1获得的京冬11小麦的籽粒基因组DNA为模板，在Pinb全长序列引物(引物1和引物4)的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增程序与步骤2相同。然后，对PCR产物用PvuII限制性内切酶进行酶切，酶切体系为，3μL 10×NE缓冲液2(NEB公司)，0.2U PvuII内切酶(NEB公司)，20μL PCR产物，加ddH2O定容至30μL；酶切条件为37℃酶切2h。酶切后，取酶切产物10μL进行2.0％琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭(EB)染色，80-100V，1.5小时)，电泳结束后用凝胶成像系统(MultiGenius Gel Documentation and Analysis System)扫描成像并用计算机进行分析，分析结果表明，扩增产物能被PvuII切割成264bp和183bp两个片段，证明京冬11的硬质小麦不是Pinb-D1c突变型，对其用步骤4的方法作进一步鉴定。
4、用SDS-PAGE鉴定京冬11的硬质小麦是否为Pina-D1b(PINA缺失)突变型包括以下步骤(1)提取籽粒蛋白选取一粒京冬11的硬质小麦，按下述步骤提取籽粒蛋白1)研磨后放入一个2mL离心管中，加入1mL预冷的TBS溶液(Tris-buffered saline，Tris缓冲盐溶液)和0.15mL 12％Triton-X114(Sigma公司)，混合后4℃放置12-24h；2)12000rpm离心3分钟，移上清至1.5mL离心管中，37℃温育半小时；3)12000rpm离心5min，弃上清，移下层至一新的离心管中，加入1mL预冷的TBS溶液，37℃温育30min；4)12000rpm离心3min，弃上清，加入900μL预冷的丙酮，涡旋后在-20℃冰箱中放置30min；5)12000rpm离心2min，弃上清，用丙酮再洗一遍后置于空气中进行干燥，得到小麦籽粒蛋白。
(2)SDS-PAGE电泳鉴定1)向步骤1提取的籽粒蛋白中加入150μL样品缓冲液(含7.57mg/mL Tris，10％甘油，0.02mg/mL SDS，0.0125mg/mL溴酚兰)；2)将加入样品缓冲液的籽粒蛋白在70℃下温育15min，取25μL进行SDS-PAGE电泳。电泳条件为用浓缩胶(浓度T为4％，胶联度C为2.67％)在40mA下电泳，待指示剂到达分离胶(浓度T为13.5％，胶联度C为2.6％)后将电压功率转换成12W，待指示剂到达分离胶底部后再电泳30min。为减少蛋白的扩散，用10％甘油代替水配制分离胶。凝胶配制时用PDA(Piperiazine diacrylamide)代替甲叉以使背景更为清晰，胶更加结实和富有弹性。按Morris等(Morris C F，Massa A N.Puroindoline genotype of the U.S.nationalinstitute of standards & technology reference material 8441，wheat hardness.CerealChemistry，2003，80674-678)的方法进行染色(用三氯乙酸和甲醇固定、银染显色，用柠檬酸停止显色)。SDS-PAGE电泳结果表明京冬11的硬质籽粒中表达有15kDa的PINA，证明京冬11的硬质小麦也不是Pina-D1b突变型，对其用测序的方法作进一步鉴定。
5、测序鉴定京冬11的硬质小麦的突变型扩增Pinb的全长引物序列为引物1(上游)5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’引物4(下游)5’-TCACCAGTAATAGCCACTAGGGAA-3’扩增Pina的全长引物序列为引物5(上游)5’-ATGAAGGCCCTCTTCCTCA-3’引物6(下游)5’-TCACCAGTAATAGCCAATAGTG-3’经上述步骤2-4鉴定，证明经SKCS检测的京冬11硬质小麦不是Pinb-D1b、Pinb-D1c和Pina-D1b(PINA缺失)突变型，为确证其硬度基因的变异类型，从京冬11小麦样品中分别选取3粒软粒种子和10粒硬粒种子，以其基因组DNA为模板，分别在Pinb全长引物(引物1和引物4)和Pina全长引物(引物5和引物6)的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件与步骤2相同，然后将PCR产物送至博亚和奥科公司测序。测序结果表明京冬11硬质小麦的Pinb具有序列表中的SEQ ID№2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由447个碱基组成，其编码框为自5’端第1到第444位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质。将测序结果与已知的野生型Pina和Pinb的序列进行比较，发现京冬11硬质小麦中的Pina为野生型，而Pinb的核苷酸序列中自5’端第218位碱基，由碱基G突变为T，从而导致Pinb编码的氨基酸残基序列(SEQ ID №1)中第44位氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸。该突变类型与先前所有报道的已知突变类型均不相同。根据McIntosh等在Genebank上公布的硬度基因排名，将该突变基因命名为Pinb-D1q。而且从京冬11中选出的10粒硬粒种子测序结果一致，均为Pinb-D1q突变类型，从而进一步证实了上述结果的可靠性。而京冬11的3粒软麦的测序结果表明，Pinb未发生任何位点的突变，与野生型Pinb的序列相同。上述测序结果也表明京冬11是两种puroindoline基因的混合体。
序列表<160>2<210>1<211>148<212>PRT<213>小麦属(Triticum aestivum L.)<400>1Met Lys Thr Leu Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Val Ala Ser Thr1 5 10 15Thr Phe Ala Gln Tyr Ser Glu Val Gly Gly Trp Tyr Asn Glu Val Gly20 25 30Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gln Cys Pro Gln Glu Arg Pro Lys Leu Ser35 40 45Ser Cys Lys Asp Tyr Val Met Glu Arg Cys Phe Thr Met Lys Asp Phe50 55 60Pro Val Thr Trp Pro Thr Lys Trp Trp Lys Gly Gly Cys Glu His Glu65 70 75 80Val Arg Glu Lys Cys Cys Lys Gln Leu Ser Gln Ile Ala Pro Gln Cys85 90 95Arg Cys Asp Ser Ile Arg Arg Val Ile Gln Gly Arg Leu Gly Gly Phe100 105 110Leu Gly Ile Trp Arg Gly Glu Val Phe Lys Gln Leu Gln Arg Ala Gln115 120 125Ser Leu Pro Ser Lys Cys Asn Met Gly Ala Asp Cys Lys Phe Pro Ser130 135 140Gly Tyr Tyr Trp145
<210>2<211>447<212>DNA<213>小麦属(Triticum aestivum L.)<400>2atgaagacct tattcctcct agctctcctt gctcttgtag cgagcacaac cttcgcgcaa 60tactcagaag ttggcggctg gtacaatgaa gttggcggag gaggtggttc tcaacaatgt120ccgcaggagc ggccgaagct aagctcttgc aaggattacg tgatggagcg atgtttcaca180atgaaggatt ttccagtcac ctggcccaca aaatggttga agggcggctg tgagcatgag240gttcgggaga agtgctgcaa gcagctgagc cagatagcac cacaatgtcg ctgtgattct300atccggcgag tgatccaagg caggctcggt ggcttcttgg gcatttggcg aggtgaggta360ttcaaacaac ttcagagggc ccagagcctc ccctcaaagt gcaacatggg cgccgactgc420aagttcccta gtggctatta ctggtga44权利要求
1.小麦籽粒硬度相关基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №1多肽序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的小麦籽粒硬度相关基因的编码蛋白。
3.根据权利要求2所述的编码蛋白，其特征在于所述编码蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与小麦籽粒硬度相关的多肽。
4.含有权利要求1所述的小麦籽粒硬度相关基因的表达载体。
5.含有权利要求1所述的小麦籽粒硬度相关基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求1所述的小麦籽粒硬度相关基因的宿主菌。
7.扩增权利要求1所述的小麦籽粒硬度相关基因中任一片段的引物。
8.权利要求1所述的小麦籽粒硬度相关基因在小麦品质改良中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个与小麦籽粒硬度相关的基因及其编码蛋白与应用，其目的是提供一个与小麦籽粒硬度相关的基因及其编码蛋白与其在小麦籽粒品质改良中的应用。该小麦籽粒硬度相关基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №1多肽序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的Pinb－Dlq突变型小麦的籽粒硬度同Pinb未发生突变的同品种小麦相比有较大提高，对小麦籽粒硬度的基因工程改良将起到重要作用，同时也有助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究，对优良小麦品种的培育也具有重大意义。
文档编号C12N15/11GK1800395SQ200510000038
公开日2006年7月12日 申请日期2005年1月5日 优先权日2005年1月5日
发明者何中虎, 陈锋, 夏先春 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所