头孢菌素c酰基转移酶的制作方法

专利名称：头孢菌素c酰基转移酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有头孢菌素C酰基转移酶活性的酶、制备这些酶的重组DNA方法、编码所述酶的核苷酸序列、包含所述核苷酸序列的表达载体、用所述表达载体转化的细胞和利用所述酶制备7-氨基头孢烷酸的方法。
背景技术：
头孢菌素C酰基转移酶是一种将头孢菌素C转换为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的酶，7-ACA是制备大量半合成头孢菌素的中间体。
尽管通过化学合成法也能够从头孢菌素C获得7-ACA，但是酶学方法由于其具有更加环保和低成本的特性仍然是优选的。
将头孢菌素C转化成7-ACA的常规酶学方法需要两种不同的酶，D-氨基酸氧化酶(DAAO)和戊二酰酰基转移酶。DAAO将头孢菌素C转化成α-酮-己二酰-7ACA并伴随有过氧化氢产生。然后过氧化氢将α-酮-己二酰-7ACA氧化成戊二酰-7-ACA(通过氧化脱氨基作用产生并/或被加入到反应介质中)，然后戊二酰酰基转移酶将戊二酰-7-ACA水解成7-ACA。常规方法需要两个独立的酶反应器，并且存在或加入过氧化氢能够失活固定化酶，这会损坏机械设备并增加成本。
已经试图研发能够将头孢菌素C直接水解成7-ACA的酶。三种已知的从假单胞菌(Pseudomonas)菌株分离得到的酶，即SE83、N176和V22，具有这种能力(Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.72(4)，232-243，1991)，但是它们对于戊二酰-7-ACA的酰基转移酶活性高于对于头孢菌素C的酰基转移酶活性。
已经公开了用于它们的制备的突变体和重组DNA方法(US 5320948、EP 475652、EP 558241、US 5804429)以改善这些酶的特性，尤其是改善其特异性、稳定性和活性。
然而，从动力学、稳定性、活性和特异性，以及能被大量表达的观点看，仍然需要具有改善了的头孢菌素C酰基转移酶活性的酶。

发明内容
基于已知的来自假单胞菌的N176酰基转移酶的序列，已经设计了编码具有头孢菌素酰基转移酶活性的酶的基因(Aramori I.等(1991)，从假单胞菌菌株克隆新的戊二酰7-ACA和头孢菌素C酰基转移酶基因并对其核苷酸测序，Journal of Fermentation and Bioengineering；72(4)，232-243)。据报道这种酰基转移酶对于戊二酰-7ACA和对于头孢菌素C(尽管处于较低程度)都具有活性。
当设计起始基因(命名为野生型HisVAC)时，导入多种变化-在270位点导入苯丙氨酸；该突变(由文献得知)增加对于头孢菌素C的活性(Ishii Y.等(1995)，高水平产生、化学修饰及定点诱变来自假单胞菌菌株的头孢菌素C酰基转移酶N176，Eur.J.Biochem；230，773-778)。
-在C-末端导入额外的序列(由氨基酸LEHHHHHH组成)，但并不干扰活性区域(β亚基第一个氨基酸参与催化作用)。利用pET24质粒作为克隆和表达载体，将所述序列导入以便使随后的层析纯化更容易。该质粒具有卡那霉素抗性而且能够在蛋白质的C-末端插入“His-标签序列”并在N-末端插入“T7-标签序列”。借助于pET24的多接头在基因末端加入含有EcoRI、XhoI和NdeI限制性酶切位点的区域，以便易于克隆入载体。
-通过替换某些碱基去除基因中的某些限制性位点(BamHI和NheI)，以至于不在相应的氨基酸序列即利用大肠杆菌(E.coli)的密码子选择中导入所不希望的改变。
-优化大肠杆菌密码子选择的核苷酸序列，利用最易翻译的密码子(具体而言，明显改变了编码蛋白质N-末端部分的序列)，主要的突变为1.替换在大肠杆菌中几乎不使用的编码甘氨酸的GGA密码子；2.替换在大肠杆菌中几乎不使用的编码精氨酸的AGG和CGA密码子；
3.替换在大肠杆菌中几乎不使用的编码异亮氨酸的ATA密码子；4.替换在大肠杆菌中几乎不使用的编码脯氨酸的CCC密码子；5.按照其在大肠杆菌中的发生频率平衡编码谷氨酸的GAG和GAA密码子的使用；6.按照其在大肠杆菌中的发生频率平衡编码苯丙氨酸的TTT和TTC密码子的使用；7.按照其在大肠杆菌中的发生频率平衡编码谷氨酰胺的CAG和CAA密码子的使用；8.按照其在大肠杆菌中的发生频率平衡编码组氨酸的CAT和CAC密码子的使用；所得到的cDNA与天然N176基因具有63.7％的序列一致性。
然后通过化学合成法获得编码HisVAC的cDNA(Itakura K，Rossi JJ，Wallace RB，合成和使用合成的寡核苷酸，Annu Rev Biochem.1984；53323-56)。
目前已经发现一些特殊的突变能够显著地改善“野生型”酶(下文中是指HisVAC)的特性。
具体而言，本发明提供了具有

图1中所报道的氨基酸序列(SEQ.IDNO1)的具有头孢菌素C酰基转移酶活性的酶，其中已经插入了一个或多个下面的突变-用Tyr、Phe、Glu或Val替代丙氨酸215；-用Asn、Ser、Thr、Phe替代组氨酸296；-用任意其它氨基酸替代天冬氨酸416和组氨酸417；-用任意其它氨基酸替代261、271、294、297、307、308和309位上的氨基酸。
特别优选的是这些酶，其中-丙氨酸215由Tyr替代；-丙氨酸215由Phe替代；-丙氨酸215由Glu替代；
-丙氨酸215由Val替代；-组氨酸296由Asn替代；-组氨酸296由Ser替代；-组氨酸296由Thr替代；-组氨酸296由Phe替代；-丙氨酸215由Tyr替代并且组氨酸296由Ser替代。
不必替换“野生型”酶的精氨酸263。
本发明的酶能够通过这样一种方法制备，该方法包括-将通过对图2中报道的核苷酸序列(SEQ ID NO2)定点诱变、随机或彻底诱变得到的DNA序列插入用于细菌或真核细胞的表达载体；-用所述载体转化细菌或真核细胞；-培养转化的细胞，提取并回收表达产物。
然后通过常规方法将本发明的突变序列插入质粒表达载体中，该质粒表达载体能够用于转化能产生酶的大肠杆菌感受态细胞。
针对所设想的工业使用，这些酶能够连接到固相载体上，如在用于将头孢菌素C酶转化为7-氨基头孢烷酸的液体介质中的不溶性合成多聚物。用于固定化酰基转移酶的适当树脂为具有丙烯酸类结构、具有环氧官能团的树脂，如Sepabeads EC-EP(Resindion srl-Mitsubishi ChemicalCorporation)和Eupergit C(Rohm-Degussa)，或者具有伯氨基的树脂，如Sepabeads EC-has和EC-EA(Resindion srl-Mitsubishi ChemicalCorporation)。无论如何，将酶与树脂相接触并通过官能团(环氧化物)的高反应性或具双功能剂如戊二醛的树脂的活化作用固定化酶，从而将酶结合到基质上。其它适于酰基转移酶固定化的树脂是聚苯乙烯树脂、大网络树脂和具有碱性官能团的树脂，如Sepabeads EC-Q1A将酶吸附于树脂上并通过与双功能剂(戊二醛)交联使酶固定。
附图简述图1示出了已插入突变并具有头孢菌素C酰基转移酶活性的酶的氨基酸序列(SEQ.ID NO1)。
图2示出了用于诱变的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)。
图3示出了pET24Δ-AcyHis表达质粒中用作DNA模板的区域及设计的两条寡核苷酸引物RND-ACY-EXT和RND-ACY-UP。
实施例实施例1微生物培养和发酵持续培养从琼脂平板挑取的含有HisVAC表达质粒的大肠杆菌菌株单个克隆。所有菌株在不同的琼脂培养基中均显示良好的生长速率，特别是LB和LB Miller培养基(含有或不含有1％葡萄糖)，pH为7且成分如下LB＝胰蛋白胨(胰酪蛋白消化)10g/l；酵母提取物5g/l；NaCl5g/l；LB Miller＝胰蛋白胨(胰酪蛋白消化)10g/l；酵母提取物5g/l；NaCl10g/l。
将琼脂平板在37℃孵育1天，然后将细胞刮去。在4℃保存平板数周克隆仍保持活性。
将细胞悬浮于无菌溶液中并将悬浮液(生长至OD600＝4)转移至装有含34μg/ml氯霉素和30μg/ml卡那霉素的LB Miller培养基的烧瓶(或发酵罐，当在烧瓶中完成生长期之后)中。培养物在37℃，200转/分钟生长3小时至OD600＝0.8(指数生长期)。生产期之后，加入0.6mM IPTG进行诱导，然后将细胞在21或25℃生长3-5小时。
野生型HisVAC酰基转移酶的提取和纯化HisVAC是细胞内的酰基转移酶；发酵之后离心培养物肉汤并通过化学(加入去污剂或氢氧化钠几秒钟)或物理(挤压或玻璃珠研磨)处理完成细胞膜裂解。优选的方法是将细胞糊重悬于缓冲液中，如磷酸盐或焦磷酸盐缓冲液(pH 7.5-8)，然后用法式压滤器o Rannie匀浆器压力为600-800巴进行裂解。离心或微孔过滤(孔径0.45μm)使细胞裂解液澄清，任选地存在聚电解质。通过层析法纯化含有粗酶的澄清溶液。优选的方法是通过含有具结合金属离子(例如锌或镍)的亚氨基二乙酸基的螯合树脂的柱子，该柱子能够选择性吸附具组氨酸标签的蛋白质。适当的层析树脂为HiTrapChelating(Amersham Biosciences)和Sepabeads FP-IDA(Resindion srl-Mitsubishi Chemical Corporation)。通过渐增咪唑浓度或pH变化的洗脱能够得到高纯度的HisVAC酰基转移酶。
纯化后的HisVAC在pH为5-9的范围内孵育120分钟后仍然是稳定的。酶活性以反应溶液pH，范围为5-10，的函数形式增加，在40℃反应30分钟后达到最高值。
通过培养用pET24Δ-HisVAC质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS产生HisVAC酰基转移酶1)微生物制备用NdeI和BamHI限制性酶消化编码HisVAC的cDNA(野生型和突变体，2322bp)。将cDNA连接到相应的经NdeI-BamHI-消化的pET24Δ(BglII-Tth111I)-HisVAC表达质粒的3.6kb片段上。pET24Δ(BglII-Tth111I)-HisVAC表达质粒是通过用BglII和Tth111I限制性酶消化方法断裂7.6kb的pET24-HisVAC质粒(通过将XhoI/NdeI限制性酶处理的完整VAC cDNA(2.3kb)克隆入用XhoI/NdeI消化的pET24质粒的5.3kb片段中获得)、回收4984bp片段、用Klenow酶钝化粘性末端，并进行连接而获得的。将所得到的pETΔ-HisVAC用于转化BL21(DE3)pLysS大肠杆菌细胞。将转化的细胞转移至含有34μg/ml氯霉素和30μg/ml卡那霉素的LB-琼脂平板上，并在37℃孵育24小时。从平板上选择单克隆，并培养于750ml含有34μg/ml氯霉素和30μg/ml卡那霉素的液体LB Miller培养基中。通过对回收的质粒DNA进行限制性酶切分析检测细胞中pET24Δ-HisVAC质粒的存在。
2)发酵作用a)生产期将用pET24Δ-HisVAC质粒转化的BL21(DE3)pLysS大肠杆菌细胞在含有30μg/ml氯霉素和30μg/ml卡那霉素的固体LB-琼脂培养基中37℃发酵24小时。将细胞重悬于100ml无菌溶液中并取30μg/ml 15ml悬液(生长至OD600＝4)转移至含750ml含有30μg/ml氯霉素和卡那霉素的LB Miller培养基的2升烧瓶(或在烧瓶中完成生长期之后转移至发酵罐)中。培养物在37℃，200转/分钟生长3小时至OD600＝0.8(指数生长期)。
b)诱导期生产期之后，加入0.6mM IPTG进行诱导。诱导后细胞生长于21或25℃；3-5小时后达到最高酶产量。
实施例2野生型HisVAC乙酰转移酶的提取和纯化将从4.5升实施例1所述的肉汤中得到的细胞糊(13g，相应于90UHisVAC酰基转移酶)重悬于39ml 50mM的磷酸盐缓冲液，pH 7.5并含有0.7μg/ml胃蛋白酶抑制剂。将悬浮液冷却至4℃并使其通过法式压滤器。39000g离心60分钟使裂解液澄清。得到50ml具有1.8 U/ml HisVAC酰基转移酶活性，相当于90总单位，的澄清溶液。将粗提样本装到5mlHiTrap螯合柱上(Amersham Biosciences)，该柱子预先装载了镍离子并用含有1M NaCl和20mM咪唑缓冲液的50mM焦磷酸钠缓冲液，pH 7.2进行平衡。用6ml含500mM咪唑、10％甘油，pH7.2的50mM焦磷酸钠缓冲液洗脱HisVAC酰基转移酶。纯化后的酶活性为12U/ml(72总单位)，并且比活性为6.5U/mg蛋白质，以戊二酰-7ACA为底物。
实施例3HisVAC酰基转移酶固定化于EC-EP Sepabeads珠子将1g EC-EP Sepabead珠子加入到10ml 20℃的含100单位酰基转移酶的1M磷酸钾缓冲液中，pH 8.0。20℃时将混合物温和搅拌12小时，然后20℃使其另外静置12小时。通过过滤和用25mM磷酸钾缓冲液，pH 8.0，洗涤回收树脂。所得到的生物催化剂具有以戊二酰-7ACA为底物时35-40U/g的固定化活性。
实施例4在溶液中用HisVAC酰基转移酶转化头孢菌素C将0.053g头孢菌素C、二水合钠盐(纯度86％)溶解于20ml 100mM的磷酸钾缓冲液中，pH 8.0(2.27g/l，假定纯度100％)，并加入到6.4ml纯化的酰基转移酶中(167.2总单位)。将混合物在20℃搅拌孵育，加入稀释的氢氧化钠维持pH为8。150分钟后获得转化为7-ACA的最大转化(92.8％转化，HPLC)。
实施例5突变体制备1.定点诱变使用“QuikChange定点诱变试剂盒”(STRATAGENE)导入核苷酸突变，该试剂盒能够在双链DNA的特定位点导入突变。并且使用含有目的基因的双链pET24Δ-HisVAC和具有预期突变的两条引物。用PfuTurboDNA聚合酶延伸与各自相应的载体链互补的引物，该酶能够高度保真地复制质粒两条链。PCR之后，用Dpn I(一种用于消化亲本DNA的对甲基化DNA特异的核酸内切酶)处理混合物并将产物用于转化XL1-Blue超感受态细胞，从转化的XL1-Blue细胞中提取DNA，转化大肠杆菌表达株BL21(DE3)pLysS。
利用大约50ng模板DNA(pET24Δ-HisVAC)；每条引物各125ng；2.5U PfuTurboDNA聚合酶，进行以下PCR程序 如实施例2中所述纯化定点诱变获得的突变蛋白质。
2.饱和点诱变为了得到随机重组HisVAC突变体文库，使用了饱和(或彻底的)点诱变，因为这种诱变允许在蛋白质的相同位置插入20种氨基酸中的任意一种。该技术在于使用简并寡核苷酸在特定靶密码子处导入不同的突变。利用等摩尔核苷混合物(dA、dC、dG、dT)使相应的位置被“饱和”合成寡核苷酸。所得到的突变体基因群体由具有随机密码子的同一基因组成。在不同的克隆中，该密码子能够编码任意氨基酸，从而获得在一个特定靶残基处具有所有可能的氨基酸替换的突变体文库。将pET24Δ-AcyHis表达质粒用作DNA模板，并将编码特定残基(如215和296位上的氨基酸)的密码子的全部三个碱基均简并的寡核苷酸用作引物。
利用同样用于专一位点定点诱变的“QuikChange定点诱变试剂盒”(STRATAGENE)导入突变。将突变的DNA用于转化表达菌株BL21(DE3)pLysS。然后，如实施例2所述将突变的克隆进行筛选和纯化。
3.随机诱变通过易错PCR扩增靶基因制备重组体HisVAC酶突变体的文库。在不同的诱变条件下进行扩增a.10％DMSO、1mM 2-巯基乙醇和高循环数；b.[Mn++]＝0.5mM，[Mg++]＝0.25mM，[dGTP]和[dATP]＝0.2mM，[dCTP]和[dTTP]＝1mM。
将pET24Δ-AcyHis表达质粒用作DNA模板并将两条设计的寡核苷酸RND-ACY-EXT(5’-CGAGATCTCGATCCCGCGAAA-3’)和RND-ACY-UP(5’-AACCAACCGTTTCATGATGCTTCGGC-3’)用作引物。这些引物退火至NdeI和BamHI限制性酶酶切位点两侧的载体区，如图3所示。
为了从DNA模板(7.6kb)中分离所扩增的条带(～1.6kb)，将PCR产物合并并在琼脂糖凝胶上分离。然后凝胶纯化扩增的DNA并用NdeI和BamHI限制性酶进行初步消化。将消化混合物加样至琼脂糖凝胶上并且回收和凝胶纯化靶片段(～1.4kb)。用NdeI和BamHI限制性酶对所提取的DNA进行O.N.消化；得到3.6kb和1.4kb的两个片段。回收并凝胶纯化靶片段(3.6kb)。将在诱变条件下扩增、酶消化并纯化的编码AcyHis酶的DNA连接到表达载体pET24Δ-(BglII-Tth111)-AcyHis上。连接混合物用于转化大肠杆菌菌株JM109。
为了将“突变体文库”转移进大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(表达株)，用含有全部所获得的突变体的质粒DNA混合物转化细胞。为了该目的，将用连接产物转化JM109细胞所获得的全部菌落重悬于选择培养基中，并提取总质粒DNA。该DNA用于转化BL21(DE3)pLysS表达株。
实施例6通过诱变得到的突变体的特性通过测定37℃时头孢菌素C或戊二酰7-ACA在0.1M磷酸盐缓冲溶液，pH 8.0，中的水解而测定突变体和HisVAC酰基转移酶的动力学参数(然后转换至25℃的单位)。使用改良的Bulasingham方法(Biochem.Biophys.Acta 276，250，1972)，分光光度法测定7-ACA的量，使用标准曲线，在415nm测定与对二甲基氨基苯甲醛反应所产生的黄色强度(希夫碱)。
1酰基转移酶单位是在测定条件下产生1微摩尔7-ACA/分钟所需的酶(溶液中或固定化)的量。
根据下面表格中报告的数据，与野生型HisVAC酰基转移酶相比，本发明的突变体对头孢菌素C的动力学特性优于对戊二酰-7-ACA的动力学特性。
Gl-7-ACACef C野生型 A215E A215F A215L A215V A215Y 野生型 A215E A215F A215L A215V A215YVmax24.22 3.3 6.2 12.516 0.23 0.160.210.750.78 1.8(U/mg)Km(mM) 1.6 1 0.85 1.7 1.2 1.7 8.2 3.2 7.7 9.5 8.3 6.9Vmax/Km 15.52.1 3.9 3.7 10.19.4 0.03 0.050.030.080.09 0.26抑制 12.5mM 25mM 50mM 12.5mM 12.5mM 12.5mM 50mM 无抑制 无抑制 12.5mM 50mM 25mM而且，突变体A215Y在温度高于25℃时更稳定。
Gl-7-ACA Cef C野生型 H296N H296S H296T H296F 野生型 H296N H296S H296T H296FVmax(U/mg) 24.2 4.3 2.00.67 1.7 0.23 0.27 0,63 0.20.05Km(mM) 1.62.8 0,72.01.9 8.25.27.74.84.1Vmax/Km15.5 1.5 2.80.33 0.9 0.03 0.05 0.08 0.04 0.0112.5 50 60抑制 25mM50mM 50mM50mM 50mM 25mM 60mMmMmMmMGl-7-ACACef C野生型 H417Y D416Y D416Y-H417Y 野生型 H417Y D416Y D41Y-H417YVmax(U/mg) 24.214.84.9 1.2 0.230.050.664.2Km(mM)1.6 4.3 1.759 8.2 12.37.2 13.1Vmax/Km 15.53.4 2.8 0.130.030.004 0.090.3抑制 12.5mM 无抑制 25mM12.5mM 50mM50mM无抑制 50mM
Gl-7-ACA Cef C野生型A215Y-H296S野生型A215Y-H296SVmax(U/mg) 24.2 2.20.23 0.66Km(mM) 1.6 4 8.2 10Vmax/Km 15.5 0.55 0.03 0.07抑制后 12.5mM25mM 50mM 40mM下表中报告了产物抑制作用的数据。数据表明相对于野生型HisVAC，突变体酰基转移酶的产物抑制作用显著变化。
Ki(mM)Gl-7-ACA Cef C7-ACA戊二酸 α-氨基己二酸野生型0.1mM13.6mM 67.7mMA215Y 11.3mM 6.1mM无抑制作用A215F 4.7mM2.1mM85.2mM
序列表<110>安蒂比奥蒂科斯有限公司<120>头孢菌素C酰基转移酶<130>7186meur<160>2<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>782<212>PRT<213>假单胞菌种(Pseudomonas sp.)<400>1Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu1 5 10 15Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val20 25 30Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly35 40 45Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg50 55 60Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala65 70 75 80Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg85 90 95Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val
100 105 110Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe115 120 125Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala130 135 140Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg145 150 155 160Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu165 170 175Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp180 185 190Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp195 200 205Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu210 215 220Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser225 230 235 240Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile245 250 255Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Phe Tyr Ala260 265 270Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val
275 280 285Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala290 295 300Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu305 310 315 320Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu325 330 335Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp340 345 350Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly355 360 365Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala370 375 380Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser385 390 395 400Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp405 410 415His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val420 425 430Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val435 440445Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu
450 455 460Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala465 470 475 480Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp485 490 495Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala500 505 510Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr515 520 525Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly530 535 540Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala545 550 555 560Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn565 570 575Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu580 585 590Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser595 600 605Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp610 615 620Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu
625 630 635 640Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu645 650 655Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala660 665 670Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly675 680 685Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala690 695 700Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp705 710 715 720Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser725 730 735Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val740 745 750Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser755 760 765Gln Glu Leu Val Pro Ala Leu Glu His His His His His His770 775 780<210>2<211>2349<212>DNA<213>假单胞菌种
<400>2atgactatgg cagctaatac ggatcgtgcg gttttacaag cggcgctgcc tccgttgtct60ggttccctgc cgattccggg cctctcggca agcgtgcggg tgcggcgtga tgcttggggt120atccctcata tcaaagcaag tggtgaagcg gatgcatacc gcgctcttgg cttcgttcat180tctcaagatc ggttgttcca aatggaactt acccggcgca aagcgctggg tcgtgctgcg240gagtggcttg gggcggaggc cgctgaggcg gacatcctgg tccgccgtct gggtatggaa300aaagtctgtc gccgcgattt cgaggctctc ggcgttgaag cgaaagatat gttacgggcc360tacgttgccg gggtgaatgc cttcctggca tcgggggcac ctctgcctgt ggaatacggc420ctgcttggtg cggaaccgga accatgggaa ccatggcaca gtatcgcggt tatgcgccgc480ttgggcctgc tgatggggtc tgtgtggttt aaattatggc ggatgcttgc actgccggtc540gtgggggctg ctaacgcgtt aaaactgcgc tatgacgacg gcgggcggga tctcttgtgc600attccgccgg gcgccgaggc tgatcggctt gaggcggacc tcgcgacgct ccgcccagcg660gtcgatgcgc tgctgaaagc catgggtggg gatgctagcg acgccgctgg cgggggcagc720aataactggg ccgtcgctcc gggccgcacc gcaaccggtc gtccgatcct ggccggtgat780ccgcatcggg tttttgagat tccgggtttt tatgctcaac atcacttagc atgtgaccgt840tttgatatga ttggtctgac cgtgcctggc gtcccgggct tcccacattt tgcccataac900ggtaaggtcg catattgtgt gacccacgca tttatggata tccacgatct ttatctggaa960cagttcgcag gcgaaggtcg gacggcgcgc ttcggtaacg acttcgaacc ggtggcctgg 1020tcccgcgacc gtattgcggt tcgtggcggg gccgaccgtg aatttgatat tgtcgagacg 1080cgtcacgggc cggttatcgc aggtgaccca cgggatggtg cagcgctgac gctgcggagc 1140gttcagtttg cggaaacgga cctctcgttt gactgcctca ctcgcatgcc gggggccagc 1200accgttgcgc agctgtatga tgctacccgt ggctgggggt tgattgatca caacctcgtc 1260gccggggatg tcgcaggctc gatcgggcac cttgtgcgtg cacgggtgcc gagtcgtcca 1320
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权利要求
1.具有氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)的具有头孢菌素C酰基转移酶活性的酶，其中已导入了一个或多个下列突变-用Tyr、Phe、Glu或Val替代丙氨酸215；-用Asn、Ser、Thr、Phe替代组氨酸296；-用任意其它氨基酸替代天冬氨酸416和组氨酸417；-用任意其它氨基酸替代氨基酸261、271、294、297、307、308和309。
2.如权利要求1所述的酶，其中丙氨酸215由Tyr替代。
3.如权利要求1所述的酶，其中丙氨酸215由Phe替代。
4.如权利要求1所述的酶，其中丙氨酸215由Glu替代。
5.如权利要求1所述的酶，其中丙氨酸215由Val替代。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的酶，其中组氨酸296由Asn替代。
7.如权利要求1-5中任意一项所述的酶，其中组氨酸296由Ser替代。
8.如权利要求1-5中任意一项所述的酶，其中组氨酸296由Thr替代。
9.如权利要求1-5中任意一项所述的酶，其中组氨酸296由Phe替代。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的酶，其中丙氨酸215由Tyr替代且组氨酸296由Ser替代。
11.制备权利要求1-10中的酶的方法，该方法包括-将通过对核苷酸序列SEQ ID NO.2进行定点、随机或彻底诱变得到的DNA序列插入用于细菌或真核细胞的表达载体；-用所述载体转化细菌或真核细胞；-培养转化的细胞，提取并回收表达产物。
12.制备头孢菌素的方法，该方法包括当存在适当的酰化剂时用权利要求1-10中的酶对头孢菌素C进行水解作用和酰化作用。
13.编码权利要求1-10中的酶的核苷酸序列。
14.包含权利要求13的序列的表达载体。
15.用权利要求14的载体转化的细胞。
全文摘要
通过对天然序列进行定点、随机或“点饱和”诱变获得具有头孢菌素C酰基转移酶活性的酶，优化在大肠杆菌中的表达。
文档编号C12P35/06GK1641019SQ20051000046
公开日2005年7月20日 申请日期2005年1月11日 优先权日2004年1月12日
发明者L·波莱焦尼, M·皮洛内, G·莫拉, E·库凯蒂, R·韦尔加, W·卡布里 申请人:安蒂比奥蒂科斯有限公司