专利名称：细胞培养容器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代而构成的塑料制细胞培养容器。
背景技术：
近年来，正在发展以对于陷入功能障碍或功能不全的生物体组织及脏器，积极利用细胞，实现再生其功能为目的的再生医疗领域。从哺乳动物中取出健康细胞，在生物体外培养该细胞后，再次放回到生物体的技术也属于其一环。
以往在生物体外进行哺乳动物的粘着细胞或悬浮细胞的培养是在聚苯乙烯制培养皿中进行。但是，这种容器因气体透过性低，所以为了充分进行细胞繁殖所必须的氧或二氧化碳的交换，把培养液的液体厚度定为3mm左右，在容器中若不设置空气层则无法实现充分的细胞繁殖。从而，当大量培养细胞时，因存在浪费的空间，所以需要很大空间。
为了解决所述问题，已报告有由离子键聚合物形成的细胞培养容器(专利文献1)、由聚乙烯薄片形成的细胞培养容器(专利文献2～4)、由聚4-甲基戊烯-1树脂和聚4-甲基戊烯-1树脂以外的聚烯烃树脂形成的细胞培养容器(专利文献5)、由含氟熔融树脂形成的培养容器(专利文献6、7)等。这些细胞培养容器气体透过性高，可以把培养液满满地填充到容器，进行培养。从而，与用聚苯乙烯制培养皿培养时相比，可以缩小培养空间，适用于大量培养。
但是，为了进一步使培养空间有效化，需要一种具有优异的细胞繁殖效果、适用于大量培养的细胞培养容器。
专利文献1特开昭60-160881号公报专利文献2实开平1-99200号公报专利文献3特开平2-255077号公报专利文献4特开平3-172169号公报专利文献5特开2001-190267号公报专利文献6特开昭63-198972号公报专利文献7实开昭62-68599号公报发明内容谋求开发一种比以往的细胞培养容器更能够抑制异物混入到培养基、细胞繁殖能力优异、适用于大量培养的细胞培养容器。
本发明涉及(1)一种细胞培养容器，其为由聚合物薄片成形的容器，其与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代。
(2)如上述(1)所述的细胞培养容器，其在由聚合物薄片成形的容器的表面，与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代。
(3)如上述(1)所述的细胞培养容器，其在由聚合物薄片成形的容器的内表面，与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代。
(4)如上述(1)所述的细胞培养容器，聚合物为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯、硅系聚合物或聚烯烃。
(5)如上述(1)所述的细胞培养容器，聚合物为聚乙烯。
(6)如上述(1)所述的细胞培养容器，氧透过系数为约100～5000cm3/m2·24hr·atm。
(7)如上述(1)所述的细胞培养容器，二氧化碳透过系数为约1000～20000cm3/m2·24hr·atm。
(8)一种由与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代的聚合物薄片成形而形成的细胞培养容器，通过使由聚合物薄片成形的容器和氟气在惰性气体存在下进行反应来获得。
(9)如上述(8)所述的细胞培养容器，氟气的含量相对于惰性气体为约0.1～20.0容量％。
(10)如上述(8)所述的细胞培养容器，使由聚合物薄片成形的容器的内表面和氟气在惰性气体存在下进行反应。
(11)一种由与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代的聚合物薄片成形的细胞培养容器的制造方法，使由聚合物薄片成形的容器和氟气在惰性气体存在下进行反应。
(12)如上述(11)所述的细胞培养容器的制造方法，使由聚合物薄片成形的容器的内表面和氟气在惰性气体存在下进行反应。
本发明的细胞培养容器，比以往细胞培养容器更能够抑制异物混入到培养基、细胞繁殖能力优异、适用于大量培养。
具体实施例方式
本发明的细胞培养容器是用于培养细胞的塑料容器，其特征为，与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代(以下叫做氟取代)。氟取代是指与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子置换，一部分是指设定氟原子取代前的与构成聚合物的碳原子结合的氢原子数的比例为100％时，被氟原子取代的数为约0.1～99.9％，优选约0.5～50％，进一步优选约1～10％，最优选约2～5％。
对本发明的聚合物容器的形状没有特别限制，可举例袋子、瓶子等，但优选由容易批量生产的轻质可扰性薄片形成的袋状物。进一步，从操作性角度考虑优选各自设置导入、导出细胞悬浮液的端口。
并且，聚合物只要是与构成的碳原子结合的氢原子的一部分通过氟气被氟原子取代，则没有特别限制。具体讲，可列举聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯、硅系聚合物或聚烯烃等热塑性树脂，其中优选聚烯烃。作为聚烯烃的具体例子，可列举聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯及聚4-甲基戊烯等，其中优选聚乙烯。
此外，本发明的细胞培养容器中，氟取代可以是聚合物容器的内表面、外表面或双面的任意一种。优选聚合物容器的内表面进行氟取代。
本发明细胞培养容器，优选在培养细胞时具有充分的透气性。具体讲，氧透过系数为约100～5000cm3/m2·24hr·atm，优选约1100～3000cm3/m2·24hr·atm，进一步优选约1250～2750cm3/m2·24hr·atm；二氧化碳透过系数为约1000～20000cm3/m2·24hr·atm，优选约3000～11500cm3/m2·24hr·atm，进一步优选约5000～9000cm3/m2·24hr·atm。
本发明中的氟取代是通过使由聚合物薄片成形的容器的内表面和/或外表面与含氟气体在惰性气体条件下进行反应来实现的，但只要能够获得同样的效果，则并不限定于此。惰性气体可以是氮气、氩气等不妨碍氟取代反应的气体。氟气的含量相对于惰性气体为约0.1～20.0容量％，优选约0.1～10容量％。温度条件为约-20～150℃，优选约0～40℃。反应温度越高氟取代的反应速度也越快，但需要注意火灾等灾害。还有，压力条件为约0.01～10.0atm，优选约0.01～2.0atm，进一步优选常压附近。反应时间，如压力条件在常压(大气压)附近时为约30秒～200分钟，优选约1分钟～200分钟，更优选约1分钟～20分钟。
本发明的细胞培养容器可以由对成形的聚合物容器直接实施氟取代的方法、或者把预先进行氟取代的聚合物成形为容器的方法来制造。这里，制造聚合物容器时可使用塑料薄片由常规方法实施。塑料薄片的厚度通常适合使用约50～300μm。例如，聚合物容器为袋状时，可以由吹胀法、T模法等制成可扰性薄片，再由热封法成形。
作为对成形的聚合物容器直接实施氟取代的方法，将由吹胀法或T模法将聚合物制成薄片，设置细胞悬浮液的流入端口和流出端口来成形为袋状，从该流入端口和流出端口向袋子内部通入含有氟的惰性气体，以制造本发明的细胞培养容器。吹胀法因聚合物的种类而异，例如使用聚乙烯时，可以在约160～180℃的熔融温度、约10～30m/min的拉伸速度制成。氟取代反应可以使用含有氟气约0.1～20.0容量％、优选约0.1～10容量％的惰性气体，在约25℃、在大气压下约进行30秒～200分钟、优选约1分钟～200分钟，进一步优选约1分钟～20分钟。
作为把预先进行氟取代的聚合物成形为容器的方法，制成仅单面进行了氟取代的聚合物，在该聚合物薄片设置端口的状态下成形为袋子。例如，可以根据特开昭62-140821号公报中记载的方法或基于其的方法由仅单面进行了氟取代的聚合物的薄片制成袋子。具体讲，由吹胀法将聚合物成形为薄片状时，向内部通入含有氟气约0.1～20.0容量％、优选约0.1～10容量％的惰性气体来进行氟取代反应。吹胀法条件因聚合物的种类而不同，例如使用聚乙烯时，可以在约160～180℃的熔融温度、约10～30m/min的拉伸速度下制成。把如此获得的薄片由温度条件为约170～190℃的热封法成形为袋状来制造。
进一步，上述氟取代反应通过与等离子处理、电晕放电处理等处理混合使用而能够更有效地进行。例如，进行电晕放电时，电压为约10～30kV，优选约15～25kV，频率为约10～30kHz，优选约15～25kHz。再者，进一步优选在低于材料熔点约20～130℃的温度加热。加热方法可以举例红外线照射、热风吹等，但并没有特别限制。
由上述制造方法获得的细胞培养容器的细胞培养可以按照常规方法实施。例如进行培养的细胞可以举出例如脐带血细胞、造血干细胞、淋巴球细胞、融合瘤细胞等浮游细胞、肝细胞等形成脏器的实质细胞等。还有，使用的培养基可以是市场上销售的基础培养基，还可以举出例如イ一グルMEM培养基、DMEM培养基、RPMI1640、HamF10培养基、HamF12培养基等。播种的细胞浓度优选约1.0×104～5.0×105cells/ml，进一步优选约1.0×105～2.0×105cells/ml，因能够高密度地培养，所以可以大量培养细胞。
下面，示出实施例、实验例来说明本发明。
实施例1把直链形低密度聚乙烯(三井化学社制)由T模法制成薄片(厚度100μm)。T模法的条件为熔融温度170℃、拉伸速度25m/min。把该薄片切割成6×10厘米的四方形，在2片聚乙烯薄片之间设置细胞悬浮液的流入端口和流出端口的状态下进行重叠，把边缘部分通过热封法成形为袋状来制成聚乙烯袋的细胞培养容器。从该细胞培养容器的流入端口和流出端口向袋子内部，通过在大气压下、在30℃下通入1分钟含有10容量％氟气的氮气，制造出细胞培养容器。
实施例2把直链形低密度聚乙烯(三井化学社制)由T模法制成薄片(厚度100μm)。T模法的条件为熔融温度170℃、拉伸速度25m/min。把该薄片切割成6×10厘米的四方形，在2片聚乙烯薄片之间设置细胞悬浮液的流入端口和流出端口的状态下进行重叠，把边缘部分由热封法成形为袋状来制成聚乙烯袋的细胞培养容器。从该细胞培养容器的流入端口和流出端口向袋子内部，通过在大气压下、在30℃下通入1分钟或180分钟含有10容量％氟气的氮气，制造出细胞培养容器(2种)。
实施例3把直链形低密度聚乙烯(三井化学社制)由吹胀法制成薄片(厚度100μm)。吹胀法的条件为熔融温度170℃、拉伸速度25m/min。把该薄片切割成10厘米见方，在2片聚乙烯薄片之间设置细胞悬浮液的流入端口和流出端口的状态下进行重叠，把边缘部分由热封法成形为袋状来制成聚乙烯袋的细胞培养容器。从该细胞培养容器的流入端口和流出端口向袋子内部，通过在大气压下、在25℃通入1分钟含有15容量％氟气的氮气，制造出细胞培养容器。
实施例4把直链形低密度聚乙烯(三井化学社制)由吹胀法制成薄片(厚度100μm)。吹胀法的条件为熔融温度170℃、拉伸速度25m/min。把该薄片切割成10厘米见方，在2片聚乙烯薄片之间设置细胞悬浮液的流入端口和流出端口的状态下进行重叠，把边缘部分由热封法成形为袋状来制成聚乙烯袋的细胞培养容器。从该细胞培养容器的流入端口和流出端口向袋子内部，通过在大气压下、在25℃通入5分钟含有5容量％氟气的氮气，制造出细胞培养容器。
实施例5把直链形低密度聚乙烯(三井化学社制)由吹胀法制成薄片(厚度100μm)。吹胀法的条件为熔融温度170℃、拉伸速度25m/min。把该薄片切割成10厘米见方，在2片聚乙烯薄片之间设置细胞悬浮液的流入端口和流出端口的状态下进行重叠，把边缘部分由热封法成形为袋状来制成聚乙烯袋的细胞培养容器。从该细胞培养容器的流入端口和流出端口向袋子内部，通过在大气压下、在25℃通入10分钟含有10容量％氟气的氮气，制造出细胞培养容器。
实验例1氟气处理容器的内表面聚合物的元素分析值及气体透过性测定实施例1获得的细胞培养容器、作为比较对照的①实施例1所述的氟气处理之前的聚乙烯容器(PE)、②没有进行氟气处理的聚四氟乙烯(厚度100μm)容器(PTFE)及③没有进行氟气处理的四氟乙烯·六氟丙烯共聚物(厚度100μm)容器(FEP)的内表面的元素分析值及容器的氧气及二氧化碳(碳酸气)的透过性。
元素分析值是使用荧光X射线分析(岛津荧光X射线分析装置XRF-1700)测定。氧及二氧化碳的气体透过性是按照JIS K 7126法(ISO 2556记载的方法)，使用气体透过性测定装置(MT-C3，东洋精机制作所)测定。
将结果示于表1。
表1内表面聚合物的元素分析值及气体透过性
供试验样品(实施例1)显示出与比较对照①几乎同等的气体透过性。比较对照③的氧气透过性为供试验样品(实施例1)的约80％，但培养液的pH值维持所必须的二氧化碳透过性为供试验样品(实施例1)的约40％，显示出低值。
在供试验样品(实施例1)的袋状容器的外表面，氟原子在检测界限以下，表明袋状容器的通过氟气处理被氟原子取代的部分为袋状容器的内表面的极浅部分。
实验例2细胞繁殖试验在实施例1获得的细胞培养容器和作为比较对照的实施例1所述的氟气处理之前的直链形低密度聚乙烯容器内，各自加入含有悬浮了人类白血病细胞株的MOLT-4细胞的10％牛胎儿血清的RPMI1640培养基(MOLT-4细胞株的播种浓度1.0×104cells/ml)5ml，在37℃、5％二氧化碳、99％RH(相对湿度)条件下进行10天的培养。从培养的第5天起，从袋状容器采样一部分培养液，由血观测仪计算袋状容器内的细胞浓度。
将结果示于表2。
表2 MOLT-4细胞浓度(×104cells/ml)
很明显，本发明实施例1的细胞培养容器显示出比对照比较的没有进行氟取代的聚乙烯容器优异的细胞繁殖能力。
实验例3细胞繁殖试验在实施例2获得的两种细胞培养容器(氟气处理时间为1分钟来制造的容器(本发明①)和氟气处理时间为180分钟来制造的容器(本发明②))和作为比较对照的市场上销售的聚苯乙烯制培养烧瓶(25cm2烧瓶，商品目录号430639，コ一ニング社制，美国)内，各自加入含有悬浮了人类白血病细胞株的MOLT-4细胞的10％牛胎儿血清的RPMI1640培养基(MOLT-4细胞株的播种浓度1.0×105cells/ml)5ml，在37℃、5％二氧化碳、99％RH(相对湿度)条件下进行6天的培养。从袋状容器采样一部分培养液，根据与实验例2所述的同样的方法计算袋状容器内的细胞浓度。
将结果示于表3。
表3 MOLT-4细胞浓度
本发明的细胞培养容器(氟气处理时间为1分钟)明显显示出优于比较对照容器的细胞繁殖倍率。
实验例4氟气处理容器的内表面聚合物的元素分析值及水接触角在表4表示了实施例2获得的两种细胞培养容器[氟气处理时间为1分钟来制造的容器(本发明①)和氟气处理时间为180分钟来制造的容器(本发明②)]，以及作为比较对照的市场上销售的聚苯乙烯制培养烧瓶(25cm2烧瓶，商品目录号430639，コ一ニング社制，美国)的内表面聚合物的元素分析值(碳原子和氟原子)及水接触角。
元素分析与实验例1所述的方法同样地进行，水接触角用JIS K 6768(ISO 8296)所述的方法测定。
表4元素分析值及水接触角
从水接触角度可以知道，本发明的细胞培养容器(氟气处理时间为1分钟)的内表面显示出些许亲水性。
本发明的细胞培养容器具有优异的细胞繁殖能力，能够抑制异物混入到培养基，能够更加有效地进行大量细胞培养。
权利要求
1.一种细胞培养容器，其为由聚合物薄片成形的容器，其特征为与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代。
2.如权利要求1所述的细胞培养容器，其特征为在由聚合物薄片成形的容器的表面，与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代。
3.如权利要求1所述的细胞培养容器，其特征为在由聚合物薄片成形的容器的内表面，与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代。
4.如权利要求1所述的细胞培养容器，其特征为聚合物为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯、硅系聚合物或聚烯烃。
5.如权利要求1所述的细胞培养容器，其特征为所述聚合物为聚乙烯。
6.如权利要求1所述的细胞培养容器，其特征为氧透过系数为约100～5000cm3/m2·24hr·atm。
7.如权利要求1所述的细胞培养容器，其特征为二氧化碳透过系数为约1000～20000cm3/m2·24hr·atm。
8.一种由与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代的聚合物薄片成形而形成的细胞培养容器，其特征为通过使由聚合物薄片成形的容器和氟气在惰性气体存在下进行反应来获得。
9.如权利要求8所述的细胞培养容器，其特征为氟气的含量相对于惰性气体为约0.1～20.0容量％。
10.如权利要求8所述的细胞培养容器，其特征为使由聚合物薄片成形的容器的内表面和氟气在惰性气体存在下进行反应。
11.一种由与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代的聚合物薄片成形的细胞培养容器的制造方法，其特征为使由聚合物薄片成形的容器和氟气在惰性气体存在下进行反应。
12.如权利要求11所述的细胞培养容器的制造方法，其特征为使由聚合物薄片成形的容器的内表面和氟气在惰性气体存在下进行反应。
全文摘要
本发明涉及一种细胞培养容器，其为由聚合物薄片成形的容器，其与构成聚合物的碳原子结合的氢原子的一部分被氟原子取代。
文档编号C12M3/00GK1661005SQ20051000056
公开日2005年8月31日 申请日期2005年1月7日 优先权日2004年1月9日
发明者白数昭雄, 吉川义洋, 和田诚一, 中谷奈穗美 申请人:尼普洛株式会社