专利名称：异种心血管移植物的脱细胞方法
技术领域：
本发明涉及一种异种心血管移植物的脱细胞方法。
背景技术：
目前，某些不可逆转的心血管疾病必须依靠外科手术的方法用外源性移植物替换病变的组织，目前常用的移植物包括人工材料制成的人工血管、人工心脏瓣膜和经不同方法处理过的同种或异种血管、瓣膜移植物两大类，前者主要存在血栓形成、凝血的问题；后者主要存在钙化和耐久性差的问题，并且两者都没有活性，不能生长，在青少年中还存在二次手术的问题，虽经多年努力仍未取得突破性进展。
近年来提出的组织工程学方法有望彻底解决这些问题，其原理是将病人的活细胞种植在可降解的高分子支架材料上，在体外培育成有活性的组织再植入到体内，活性细胞分泌的细胞外基质逐步替代降解的高分子材料，最终实现组织器官的再生。但高分子材料存在力学性能差、难以塑形、降解产物有局部毒性的缺点，因此具备与目标组织相同结构、力学性能、降解产物无毒副作用的异种生物组织引起了人们的注意，人们设想脱除组织中原来的细胞，所得到的细胞外基质成分应该是良好的组织工程支架来源。
发明内容
本发明的目的是提供一种脱细胞的方法，对异种生物心血管组织进行处理，彻底脱除存在于组织表面及内部的细胞及细胞碎片，以得到组织工程可用的支架材料。
为实现上述目标，本发明采取以下方案首先对异种生物心血管组织进行胰蛋白酶消化处理，使组织部分降解，提高组织的通透性以利于脱细胞试剂渗入细胞内部。接着通过低渗和等渗溶液的交替冲击破坏细胞膜结构，然后用中性表面活性剂提取细胞膜的脂质成分，再以核酸酶降解细胞中的各类DNA和/或RNA成分，最后以中性表面活性剂抽提残存的核膜等细胞膜成分，达到彻底清除细胞的目的。
本发明主要是用于异种生物心血管组织器官，如牛心包、猪心包、猪主动脉瓣、猪主动脉壁、猪肺动脉瓣、猪肺动脉壁、牛颈静脉等。一般说来，含有较多胶原纤维或弹力纤维的组织适宜用此方法脱除细胞成分。
胰蛋白酶消化用pH6.8～8.6的磷酸盐缓冲液(PBS)配制0.5％～1％胰蛋白酶溶液，加入移植物生物组织，使体积∶重量为100毫升∶10～50克，在37℃水浴中振荡处理30分钟～24小时。
低渗处理采用0.01M Tris-HCl缓冲液(pH6.8～8.6)，使体积∶重量为100毫升∶10～50克，在4℃～25℃水浴中振荡处理4～24小时。
等渗中性去污剂处理采用含有1％～5％曲拉通(Triton)X-100的0.05MTris-HCl缓冲液(pH6.8～8.6)，使体积∶重量为100毫升∶10～50克，在4℃～25℃水浴中振荡处理4～24小时。
核酸酶处理在含有15mM氯化钠的0.05M Tris-HCL缓冲液(pH6.8～8.6)中加入100～10000单位的脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)，使体积∶重量为100毫升∶10～50克，在37℃水浴中振荡处理2～24小时。
再一次等渗中性去污剂处理，同上述。
经脱细胞处理的异种生物心血管组织器官统称为脱细胞基质。
脱细胞基质的评价方法包括1.残留细胞脱细胞基质用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，切成0.4微米厚的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水，苏木素—伊红染色，观察细胞残留情况。
2.基质纤维结构脱细胞基质用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，切成0.4微米厚的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水，van Gieson弹力纤维染色，观察基质中胶原纤维和弹力纤维的结构。
3.基质表面细胞残留脱细胞基质用2.5％戊二醛溶液和1％锇酸双重固定，乙醇逐级脱水，二氧化碳临界点干燥，真空喷金，扫描电镜组织表面细胞残留情况。
4.可溶性蛋白含量测定脱细胞基质剪成碎末，加入pH7.4的磷酸盐缓冲液中匀浆，4℃下离心10分钟，取上清液测定可溶性蛋白含量。以牛血清白蛋白作标准曲线。
5.胶原蛋白含量测定以6mol/L盐酸水解脱细胞基质，130℃处理5小时，过滤后用水作1∶800稀释，取1毫升稀释液测定羟脯氨酸含量，并按胶原蛋白中羟脯氨酸约占12.7％的比例，推算出胶原蛋白含量。
6.弹性蛋白含量测定脱细胞基质以0.2mmol/L草酸100℃煮沸60分钟，离心，取上清液。如此反复抽提8次，合并上清液，取1ml对水透析24小时后离心，取100μl上清液用Lowry法测定蛋白含量。以弹性蛋白作标准曲线。
7.蛋白聚糖含量测定脱细胞基质剪碎后加入盐酸胍提取液，4℃冰浴30分钟，4℃低温下1000g离心30分钟，留取上清液；沉淀重复抽提一次，留取上清液。合并两次上清液加水透析24小时，4℃低温下1000g离心30分钟，取上清液用阿利新蓝显色法测定硫酸软骨素的含量，以硫酸软骨素的含量代表蛋白聚糖的含量。
8.脱细胞基质拉伸强度的测定将脱细胞基质裁成板材状，在拉力机上将其拉断，所测的最大拉力除以试材的截面积，为基质材料的拉伸强度，表示基质的抗抗能力。
9.脱细胞基质断裂伸长率将脱细胞基质裁成板材状，在拉力机上将其拉断，记录试样从被拉伸到被拉断的的长度，除以试样的长度所得的百分比，即为基质材料的断裂伸长率，表示材料的变形能力。
10.脱细胞基质大鼠皮下埋植实验观察基质材料在体内的炎性反应程度和钙化程度。将脱细胞基质裁成1平方厘米大小的片状，在含有100单位/毫升的磷酸盐缓冲液中浸泡过夜。取3周龄的大鼠麻醉，消毒，在其腹部皮下切四个小口，放入待测试片，缝合。3周后处死大鼠，取出试片，取一小块用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，做常规苏木素—伊红染色和von Kossa染色，观察炎性细胞浸润和钙化情况；其余试片在120℃下烘干2小时，水解，原子吸收分光光度法测定钙元素的含量。
本发明的优点是用胰蛋白酶消化作用部分降解组织材料，使后续试剂易于渗透到组织内部，促进反应快速、彻底。本发明可大大缩短反应时间，对较薄的生物组织如牛心包处理时间只需要24小时，远低于现有技术的4天；低渗液、表面活性剂、核酸酶的联合应用可以高效地去除组织中的细胞成分，即使是较厚的生物组织如猪主动脉壁中的细胞也可达到完全脱除的水平，克服了目前技术只能部分脱除厚组织中细胞的缺陷。脱细胞基质生物相容性好，利于细胞生长，体内钙化程度有显著降低。
图1为含有细胞的新鲜牛心包组织的显微镜照片；图2为经脱细胞处理后牛心包组织(以下简称为“脱细胞牛心包”)的显微镜照片。可以看出，经本发明的脱细胞方法处理后，牛心包组织中的细胞结构消失。
图3为新鲜牛心包的显微镜照片；图4为脱细胞牛心包的显微镜照片。可以看出，经本发明的脱细胞方法处理后，胶原纤维结构略变疏松，弹力纤维显露明显。
图5为新鲜牛心包的电子显微镜照片；图6为脱细胞牛心包的电子显微镜照片。可以看出，图5中，新鲜牛心包表面有细胞基底膜覆盖；经本发明的脱细胞方法处理后，图6中基底膜消失，显露出基质纤维结构。
图7为新鲜牛心包在大鼠皮下埋藏3周后的电子显微镜照片；图8为脱细胞牛心包在大鼠皮下埋藏3周后的电子显微镜照片。两者相比较，可以看出，新鲜牛心包片炎性细胞浸润数量较多，脱细胞组织浸润细胞数量少，但浸润的部位更深。
图9为新鲜牛心包的显微镜照片；图10为脱细胞牛心包的显微镜照片。新鲜牛心包仅见极少量的钙化点(箭头所示)，而经脱细胞处理的牛心包无可见的钙化发生。
具体实施例方式
(一)试剂配制1.磷酸盐缓冲液(PBS液)市售PBS粉末溶于1000ml蒸馏水中，p7.4。
2.胰蛋白酶消化液称取1g胰蛋白酶粉末，0.04g乙二胺四乙酸(EDTA)溶于200ml PBS溶液中。
3.苯甲基磺酰氟(PMSF)贮存液PMSF 5mg溶于50ml异丙醇液中，分装成1ml冷冻保存。
4.低渗处理液市售1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)取10ml，EDTA 0.2g，PMSF贮存液1ml，加水至1000ml。
5.等渗Triton X-100处理液市售1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)取50ml，EDTA 0.2g，Triton X-100 5ml，PMSF贮存液1ml，加水至1000ml。
6.核酸酶缓冲液市售0.05M Tris-HCl缓冲粉末1包，氯化钠0.59g，加水至1000ml(pH7.6)。
7.核酸酶液取DNase I(50K单位)5mg溶于50ml核酸酶缓冲液中，分装成1ml/管；取RNase A(50K单位)500mg溶于50ml核酸酶缓冲液中，分装成1ml/管；使用时分别取分装的DNase和RNase各一管即可。
(二)材料准备从屠宰现场摘取牛心包，去除脂肪块及粘附的组织，清水漂洗三遍，置于冰生理盐水中带回。裁取左前区约7×10cm2厚度大致相同的片备用。
(三)脱细胞过程1.胰蛋白酶消化取约80g左右的牛心包片于圆底烧瓶中，加入200ml胰蛋白酶液，37℃水浴中以100次/分钟的频率振荡30分钟。
2.低渗处理倾去瓶中溶液，PBS洗三遍。加入200ml低渗处理液，4℃水浴中以100次/分钟的频率振荡4小时。
3.等渗Triton X-100处理倾去瓶中溶液，PBS洗三遍。加入200ml等渗Triton X-100处理液，4℃水浴中以100次/分钟的频率振荡12小时。
4.核酸酶处理倾去瓶中溶液，PBS洗五遍。加入200ml核酸酶缓冲液和核酸酶液，37℃水浴中以100次/分钟的频率振荡2小时。
5.等渗Triton X-100处理倾去瓶中溶液，PBS洗三遍。加入200ml等渗Triton X-100处理液，4℃水浴中以100次/分钟的频率振荡4小时。
6.倾去瓶中溶液，PBS洗五遍，备用。
(四)结果评价1.残留细胞脱细胞牛心包经常规苏木素-伊红染色证实无细胞结构存在。(图2)2.基质纤维结构脱细胞牛心包经van Gieson弹力纤维染色，可见胶原纤维呈波浪状排列，无明显断裂、变性发生；弹力纤维非常少。(图4)3.基质表面细胞残留扫描电镜观察未脱细胞的牛心包表面有致密的细胞外基质存在，而经脱细胞处理后这些基质消失，只剩丝状纤维结构。(图6)4.可溶性蛋白含量测定Lowry法测得未脱细胞的牛心包中可溶性蛋白含量是1.44±0.34mg/g湿组织，经脱细胞处理后的含量为0.87±0.04mg/g湿组织，统计学处理无显著差异。
5.胶原蛋白含量测定由测得的羟脯氨酸换算得未脱细胞的牛心包胶原蛋白含量是85.66±9.21mg/g湿组织，经脱细胞处理后的含量为87.95±5.19mg/g湿组织，统计学处理无显著差异。
6.弹性蛋白含量测定经草酸抽提后用Lowry法测得新鲜牛心包弹性蛋白含量是0.061±0.008mg/g湿组织；脱细胞后含量是0.104±0.021mg/g湿组织，统计学分析有非常显著差异。
7.蛋白聚糖含量测定由盐酸胍抽提结合阿利新蓝染色法测得新鲜牛心包中蛋白聚糖含量为0.031±0.003mg/g湿组织，脱细胞牛心包中含量为0.069±0.018mg/g湿组织，统计学分析差异不显著。
8.脱细胞基质拉伸强度的测定新鲜牛心包拉伸强度为11.25±5.49mPa，脱细胞后为11.30±4.27mPa，统计学无差异。
9.脱细胞基质断裂伸长率新鲜牛心包断裂伸长率为38.4±11.2％，脱细胞后为37.5±11.1％，统计学无差异。
10.脱细胞基质大鼠皮下埋植实验将新鲜和脱细胞两组牛心包片同时植入SD大鼠皮下，3周后取出进行苏木素-伊红染色和von Kossa钙染色，光镜下观察对比，其余组织片烘干后用原子吸收分光光度法测定钙含量。脱细胞牛心包中宿主炎性细胞浸润到组织中程度较新鲜牛心包深，但密度较稀(图8)；新鲜和脱细胞牛心包组织钙染色都无可见的钙盐沉积(图10)；定量分析显示新鲜牛心包钙含量为1.54±0.92，脱细胞牛心包钙含量为0.77±0.63，两组有显著差异。
(五)应用实例有脱细胞牛心包片上种植猪的血管混合细胞，并移植到同一猪的心脏右室流出道，三个月取出后未见血栓形成，组织学检查发现牛心包中又出现细胞结构，弹性纤维增多，胶原纤维排列向血管形式重塑，并有新的毛细血管生成。
权利要求
1.一种异种心血管移植物的脱细胞方法，其特征在于首先对异种生物心血管组织进行胰蛋白酶消化处理，然后通过低渗和等渗溶液的交替冲击破坏细胞膜结构，用中性表面活性剂提取细胞膜的脂质成分，再以核酸酶降解细胞中的各类DNA和/或RNA成分，最后以中性表面活性剂抽提残存的核膜等细胞膜成分。
2.根据权利要求1所述的异种心血管移植物的脱细胞方法，其特征在于所述的胰蛋白酶处理采用PBS液，胰蛋白酶重量体积比浓度在0.5％～1％之间，pH值在6.8～8.6之间，处理液体积∶移植物重量为100毫升∶10～50克，在37℃水浴中振荡处理30分钟～24小时。
3.根据权利要求1所述的异种心血管移植物的脱细胞方法，其特征在于所述的低渗处理采用浓度为0.01M且pH为6.8～8.0的Tris-HCl缓冲液，处理液体积∶移植物重量为100毫升∶10～50克，在4℃～25℃水浴中振荡处理4～24小时。
4.根据权利要求1所述的异种心血管移植物的脱细胞方法，其特征在于所述的等渗中性去污剂处理采用含有重量体积比为1％～5％且pH为6.8～8.6的TritonX-100的0.05M Tris-HCl缓冲液，处理液体积∶移植物重量为100毫升∶10～50克，在4℃～25℃水浴中振荡处理4～24小时。
5.根据权利要求1所述的异种心血管移植物的脱细胞方法，其特征在于所述的核酸酶处理在含有15mM氯化钠且pH为6.8～8.6的0.05M Tris-HCL缓冲液中加入100～10000单位的DNase和RNase，处理液体积∶移植物重量为100毫升∶10～50克，在37℃水浴中振荡处理2～24小时。
全文摘要
本发明公开了一种异种生物心血管移植物的组织脱细胞方法。该方法首先对异种生物心血管组织进行胰蛋白酶消化处理，然后通过低渗和等渗溶液的交替冲击破坏细胞膜结构，用中性表面活性剂提取细胞膜的脂质成分，再以核酸酶降解细胞中的各类DNA和/或RNA成分，最后以中性表面活性剂抽提残存的核膜等细胞膜成分。以该方法处理得到的脱细胞心血管基质，具有生物相容性好、免疫原性低、钙化程度低、并具备一定的生物强度的优点。
文档编号C12N5/071GK1644684SQ20051000246
公开日2005年7月27日 申请日期2005年1月21日 优先权日2005年1月21日
发明者周建业, 胡盛寿, 汪胜 申请人:周建业, 胡盛寿, 汪胜