专利名称：一种生产普鲁兰的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产普鲁兰的方法。
背景技术：
在化学工业、食品工业和医药工业中，长期以来渴望得到能被土壤微生物分解、燃烧后不产生高温或有毒气体的无公害塑料，对温度差几乎无物性变化、不易透过氧气的可食用薄膜，耐酸碱的高强度粘合剂以及对环境体有益、并可用以生产有价值工业品的天然原料，与这些要求相适应的是多糖普鲁兰。普鲁兰是一种新型的高分子生物材料，具有极好的成膜、成纤维、阻气、粘接、易加工、无毒性等特性，已广泛应用于食品、医药、轻工、化工和石油等领域。
目前大多数普鲁兰产生菌同时产生暗绿乃至黑色色素，这些色素即使在后提取工艺中采用各种提取脱色的特殊手段都无法祛除，生产的普鲁兰为黑色或色素很深；另外，部分菌株得率低、生产成本高，无法工业化生产。
发明内容
本发明针对现有生产普鲁兰的方法产生的普鲁兰为黑色或色素很深并且得率普遍不高的问题，提出一种生产普鲁兰的方法，通过培育高产率低色素的生产菌株、配制合适的培养基及选择合适的生产工艺，实现浅色普鲁兰的工业化生产。
本发明所提供的生产普鲁兰的方法包括以下步骤(1)菌种的选育以出芽短梗霉为出发菌株进行紫外线、亚硝基胍(NTG)诱变，从大量的诱变菌株中筛选分泌黑色素较少而且转化率较高的诱变菌株；(2)培养基的配制种子培养基各组分及其重量百分比为氨水0.018～0.022％，K2HPO40.2～0.45％，MgSO40.015～0.023％，NaCl0.09～0.11％，酵母膏0.13～0.15％，其余为DE值(DE值是指溶液中所含的糖相当葡萄糖的重量百分比，即相当葡萄糖值)48～55的玉米粉液化液、葡萄糖溶液或麦芽糖溶液，PH值为6.0～7.0；发酵培养基各组分及其重量百分比为氨水0.018～0.045％，K2HPO40.2～0.55％，MgSO40.015～0.045％，NaCl 0.09～0.12％，酵母膏0.12～0.16％，其余为DE值48～55的玉米粉液化液、葡萄糖溶液或麦芽糖溶液，PH值为6.0～7.0；(3)种子培养将步骤(1)得到的菌种于30～33℃下进行培养，然后接种于已灭菌冷却的种子培养基进行培养，得到种子液；(4)发酵将灭菌冷却后的发酵培养基与步骤(3)得到的种子液一同加入发酵罐中，接种量(接种量是种子液与发酵培养基的重量比)为1.5～5％，进行发酵，得到发酵液；(5)提取从发酵液中将普鲁兰提取出来，可采用传统的分离技术，比如先将发酵液稀释，再高速离心除去菌体，然后脱色、浓缩、干燥、粉碎，得到成品普鲁兰。
所述菌株的选育包括以下步骤(1)孢子悬浮液的制备将出发菌株在麦芽汁斜面上30℃培养3～4天，培养后用生理盐水将孢子洗下，接到营养较丰富的培养基中，振荡4～5 h使孢子活化萌芽；离心分离，用pH 60 tris缓冲液冲洗一次，再用同样的缓冲液从离心管中洗出，转到小三角瓶中，用玻璃珠振荡打散，然后通过一层宣纸或脱脂棉过滤，制成单孢子悬浮液，用血球计数板计数后，将孢子浓度调整到107/ml；(2)紫外线诱变诱变处理时取5ml孢子悬浮液放于直径6cm的培养皿中，放入无菌搅拌铁芯，液层厚度为2mm；处理前先开灯预热20～30分钟，稳定后启动电磁搅拌皿，使菌悬液接受紫外线照射均匀，启开培养皿盖，10分钟后立即盖上皿盖，取出处理箱，在红光下涂布培养皿平板，用黑布包裹平板，进行振荡培养；(3)亚硝基胍处理将上述紫外线诱变菌株孢子悬浮液与浓度为2mg/ml的亚硝基胍溶液按1∶4混合，在26～28℃下作用2～3h，处理后离心分离，并反复用生理盐水洗涤离心10次以上，最后用生理盐水恢复到原有体积之后稀释104倍，取0.1ml涂平板培养；(4)筛选亚硝基胍处理之后进行平板培养，反复分离筛选，即得所要求的菌株；(5)保藏将分离出的菌株接种在斜面培养基上生长完全后，置于4℃左右冰箱中保藏，保藏环境湿度在50～70％以下，每4～6个月移植一次。
所述tris缓冲液的配置方法是取三羟甲基氨基甲烷(简称tris)6.1克，加苹果酸5.8克，溶于980ml水中，用1mol/l NaOH调节pH至6.0，再定容至1000ml。
所述玉米粉液化液的制备方法是，将玉米粉添加水和淀粉酶进行液化，将其中的糖类物质溶解于液化液中，分离出液化液中的固体成分，即得到玉米粉液化液。
所述发酵培养基的PH值优选为为7.0。
所述种子培养可在30～33℃罐压0.5kg/cm2下进行，搅拌并通入无菌空气，搅拌速度400～600r/min，通气量1.5～3L/min，培养36～42小时。
所述发酵可在温度29～33℃下进行，搅拌并通入无菌空气，搅拌速度400～600r/min，通气量3～6L/min，发酵时间为72～86小时。
本发明以出芽短梗霉为出发菌株进行紫外线、亚硝基胍(NTG)诱变并筛选出的低色素且转化率较高的诱变菌株，在含有玉米淀粉、葡萄糖或麦芽糖的发酵培养基上进行发酵生产普鲁兰，多糖转化率达60～70g/L，普鲁兰多糖收率可达60～70％，得到的普鲁兰为白色或淡黄色。
具体实施例方式
实施例1本生产普鲁兰的方法包括以下步骤(1)菌种的选育以出芽短梗霉为出发菌株进行紫外线、亚硝基胍(NTG)诱变，从大量的诱变菌株中筛选分泌黑色素较少而且转化率较高的诱变菌株并保存(具体的步骤如上文所述)；(2)培养基的配制将玉米粉添加水和淀粉酶进行液化，将其中的糖类物质溶解于液化液中，分离出液化液中的固体成分，得到的玉米粉液化液用于配制种子培养基和发酵培养基；每千克种子培养基中含有氨水0.21克，K2HPO44.0克，MgSO40.19克，NaCl 1.05克，酵母膏1.49克，其余为DE值50的玉米粉液化液，PH值为6.0，采用H2SO4、Ca(OH)2作为酸度调节剂；每千克发酵培养基中含有氨水0.41克，K2HPO45.05克，MgSO40.39克，NaCl 1.09克，酵母膏1.45克，其余为DE值50的玉米粉液化液，PH值为7.0，采用H2SO4、Ca(OH)2作为酸度调节剂；(3)种子培养将步骤(1)得到的菌种于30℃下培养72小时，然后接种于已灭菌冷却的种子培养基，在30℃罐压0.5kg/cm2下，搅拌并通入无菌空气，搅拌速度600r/min，通气量1.5L/min，培养36小时，得到种子液；(4)发酵将灭菌冷却后的发酵培养基与步骤(3)得到的种子液一同加入50吨发酵罐中，发酵灌装液量40吨，接种量为2％，温度30℃，搅拌并通入无菌空气，搅拌速度400r/min，通气量3L/min，发酵时间为86小时，得到发酵液；(5)提取从发酵液中将普鲁兰提取出来，可采用传统的分离技术，先将发酵液稀释，再高速离心除去菌体，然后脱色、浓缩、干燥、粉碎，得到成品普鲁兰。
实施例2本生产普鲁兰的方法包括以下步骤(1)菌种的选育以出芽短梗霉为出发菌株进行紫外线、亚硝基胍(NTG)诱变，从大量的诱变菌株中筛选分泌黑色素较少而且转化率较高的诱变菌株并保存(具体的步骤如上文所述)；(2)培养基的配制将葡萄糖制成溶液，用于配制种子培养基和发酵培养基；每千克种子培养基中含有氨水0.20克，K2HPO44.1克，MgSO40.21克，NaCl 1.01克，酵母膏1.49克，其余为DE值52的葡萄糖溶液，PH值为6.0，采用H2SO4、Ca(OH)2作为酸度调节剂；每千克发酵培养基中含有氨水0.41克，K2HPO44.05克，MgSO40.41克，NaCl 1克，酵母膏1.41克，其余为DE值52的葡萄糖溶液，PH值为7.0，采用H2SO4、Ca(OH)2作为酸度调节剂；(3)种子培养将步骤(1)得到的菌种于31℃下培养72小时，然后接种于已灭菌冷却的种子培养基，在31℃罐压0.5kg/cm2下，搅拌并通入无菌空气，搅拌速度500r/min，通气量2.5L/min，培养38小时，得到种子液；(4)发酵将灭菌冷却后的发酵培养基与步骤(3)得到的种子液一同加入50吨发酵罐中，发酵灌装液量40吨，接种量为3％，温度30℃，搅拌并通入无菌空气，搅拌速度400r/min，通气量3L/min，发酵时间为80小时，得到发酵液；(5)提取从发酵液中将普鲁兰提取出来，可采用传统的分离技术，先将发酵液稀释，再高速离心除去菌体，然后脱色、浓缩、干燥、粉碎，得到成品普鲁兰。
实施例3本生产普鲁兰的方法包括以下步骤(1)菌种的选育以出芽短梗霉为出发菌株进行紫外线、亚硝基胍(NTG)诱变，从大量的诱变菌株中筛选分泌黑色素较少而且转化率较高的诱变菌株并保存(具体的步骤如上文所述)；(2)培养基的配制将玉米粉添加水和淀粉酶进行液化，将其中的糖类物质溶解于液化液中，分离出液化液中的固体成分，得到的玉米粉液化液用于配制种子培养基和发酵培养基；每千克种子培养基中含有氨水0.19克，K2HPO42.5克，MgSO40.16克，NaCl 0.95克，酵母膏1.36克，其余为DE值49的玉米粉液化液，PH值为6.3，采用H2SO4、Ca(OH)2作为酸度调节剂；每千克发酵培养基中含有氨水0.25克，K2HPO43.20克，MgSO40.22克，NaCl 0.95克，酵母膏1.25克，其余为DE值49的玉米粉液化液，PH值为6.8，采用H2SO4、Ca(OH)2作为酸度调节剂；(3)种子培养将步骤(1)得到的菌种于30℃下培养75小时，然后接种于已灭菌冷却的种子培养基，在30℃罐压0.5kg/cm2下，搅拌并通入无菌空气，搅拌速度450r/min，通气量2L/min，培养40小时，得到种子液；(4)发酵将灭菌冷却后的发酵培养基与步骤(3)得到的种子液一同加入50吨发酵罐中，发酵灌装液量40吨，接种量为4％，温度30℃，搅拌并通入无菌空气，搅拌速度550r/min，通气量5L/min，发酵时间为76小时，得到发酵液；(5)提取从发酵液中将普鲁兰提取出来，可采用传统的分离技术，先将发酵液稀释，再高速离心除去菌体，然后脱色、浓缩、干燥、粉碎，得到成品普鲁兰。
权利要求
1.一种生产普鲁兰的方法，其特征是包括以下步骤(1)菌种的选育以出芽短梗霉为出发菌株进行紫外线、亚硝基胍诱变，从大量的诱变菌株中筛选分泌黑色素较少而且转化率较高的诱变菌株；(2)培养基的配制种子培养基各组分及其重量百分比为氨水0.018～0.022％，K2HPO40.2～0.45％，MgSO40.015～0.023％，NaCl 0.09～0.11％，酵母膏0.13～0.15％，其余为DE值48～55的玉米粉液化液、葡萄糖溶液或麦芽糖溶液， PH值为6.0～7.0；发酵培养基各组分及其重量百分比为氨水0.018～0.045％，K2HPO40.2～0.55％，MgSO40.015～0.045％，NaCl 0.09～0.12％，酵母膏0.12～0.16％，其余为DE值48～55的玉米粉液化液、葡萄糖溶液或麦芽糖溶液，PH值为6.0～7.0；(3)种子培养将步骤(1)得到的菌种于30～33℃下进行培养，然后接种于已灭菌冷却的种子培养基进行培养，得到种子液；(4)发酵将灭菌冷却后的发酵培养基与步骤(3)得到的种子液一同加入发酵罐中，接种量为1.5～5％，进行发酵，得到发酵液；(5)提取从发酵液中将普鲁兰提取出来。
2.根据权利要求1所述的生产普鲁兰的方法，其特征是所述菌株的选育包括以下步骤(1)孢子悬浮液的制备将出发菌株在麦芽汁斜面上30℃培养3～4天，培养后用生理盐水将孢子洗下，接到营养较丰富的培养基中，振荡4～5h使孢子活化萌芽；离心分离，用pH 60 tris缓冲液冲洗一次，再用同样的缓冲液从离心管中洗出，转到小三角瓶中，用玻璃珠振荡打散，然后通过一层宣纸或脱脂棉过滤，制成单孢子悬浮液，用血球计数板计数后，将孢子浓度调整到107/ml；(2)紫外线诱变诱变处理时取5ml孢子悬浮液放于直径6cm的培养皿中，放入无菌搅拌铁芯，液层厚度为2mm；处理前先开灯预热20～30分钟，稳定后启动电磁搅拌皿，使菌悬液接受紫外线照射均匀，启开培养皿盖，10分钟后立即盖上皿盖，取出处理箱，在红光下涂布培养皿平板，用黑布包裹平板，进行振荡培养；(3)亚硝基胍处理将上述紫外线诱变菌株孢子悬浮液与浓度为2mg/ml的亚硝基胍溶液按1∶4混合，在26～28℃下作用2～3h，处理后离心分离，并反复用生理盐水洗涤离心10次以上，最后用生理盐水恢复到原有体积之后稀释104倍，取0.1ml涂平板培养；(4)筛选亚硝基胍处理之后进行平板培养，反复分离筛选，即得所要的菌株；(5)保藏将分离出的菌株接种在斜面培养基上生长完全后，置于4℃左右冰箱中保藏，保藏环境湿度在50～70％以下，每4～6个月移植一次。
3.根据权利要求2所述的生产普鲁兰的方法，其特征是所述tris缓冲液的配置方法是取三羟甲基氨基甲烷6.1克，加苹果酸5.8克，溶于980ml水中，用1mol/l NaOH调节pH至6.0，再定容至1000ml。
4.根据权利要求1所述的生产普鲁兰的方法，其特征是所述玉米粉液化液的制备方法是，将玉米粉添加水和淀粉酶进行液化，将其中的糖类物质溶解于液化液中，分离出液化液中的固体成分，即得到玉米粉液化液。
5.根据权利要求1所述的生产普鲁兰的方法，其特征是所述发酵培养基的PH值为7.0。
6.根据权利要求1所述的生产普鲁兰的方法，其特征是所述种子培养在30～33℃罐压0.5kg/cm2下进行，搅拌并通入无菌空气，搅拌速度400～600r/min，通气量1.5～3L/min，培养36～42小时。
7.根据权利要求1所述的生产普鲁兰的方法，其特征是所述发酵在温度29～33℃下进行，搅拌并通入无菌空气，搅拌速度400～600r/min，通气量3～6L/min，发酵时间为72～86小时。
全文摘要
一种生产普鲁兰的方法，包括以下步骤(1)菌种的选育以出芽短梗霉为出发菌株进行紫外线、亚硝基胍(NTG)诱变，从大量的诱变菌株中筛选分泌黑色素较少而且转化率较高的诱变菌株；(2)种子培养基和发酵培养基的配制；(3)种子培养将步骤(1)得到的菌种于30～33℃下进行培养，然后接种于已灭菌冷却的种子培养基进行培养，得到种子液；(4)发酵将灭菌冷却后的发酵培养基与步骤(3)得到的种子液一同加入发酵罐中，接种量为1.5～5％，进行发酵，得到发酵液；(5)从发酵液中将普鲁兰提取出来得到成品普鲁兰。本发明多糖转化率达60～70g/L，普鲁兰多糖收率可达60～70％，得到的普鲁兰为白色或淡黄色。
文档编号C12P19/00GK1654482SQ200510008439
公开日2005年8月17日 申请日期2005年2月21日 优先权日2005年2月21日
发明者余少华, 喻敏, 林玉惠, 杨汉彬, 刘谋泉, 郑华丰, 黄鹤, 杨志军, 周晓娜, 陈远志, 李慧 申请人:汕头市富味制果厂有限公司