专利名称：一种抑制土壤中真菌孢子萌发的化合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制土壤中真菌孢子萌发的化合物及其应用，属生物农药技术领域
背景技术：
土传类病害是造成农作物损失的重要原因之一。目前防治的主要方法仍为轮作、培育抗病品种及化学农药防治等。长期以来，化学农药在防治土传病害，保障农业可持续发展方面做出了突出贡献。但同时也发现，广泛和长期使用化学农药，会使真菌病害产生抗药性，破坏生态平衡，对环境造成污染。目前环境问题已成为全球共同关注的一个热点，亦是我国经济和社会可持续发展面临的主要问题之一。因此有必要寻找新的途径来控制植物病害，同时又能尽量减少对人类和环境造成负面影响。与化学防治形成对照，生物防治基于生态平衡的原理，可有效避免或减轻3R(抗性，残留，害虫再爆发)问题，越来越引起人们的重视。
100年前，人们注意到土壤中的微生物或其代谢产物对土传类病原真菌具有抑制作用。抑制机理主要是使菌丝异常膨大；溶解和完全降解菌丝的尖端；通过掠夺营养，抑制芽管的生长或寄生等。此外，1953年Dobs和Hinson发现绝大多数的自然土壤能够抑制真菌孢子的萌发和生长，这一现象称为土壤抑菌作用(Fungistasis)。土壤抑菌作用对于控制土传类病害来说是有益菌，但对于防治土传病害的生防菌来说，则是有害的。因为，孢子是真菌的繁殖体，生防真菌只有通过孢子扩散和生存，在土壤中快速萌发定殖，才能产生良好的防效。一般来说，植物病原真菌对土壤抑真菌作用有较强的敏感性。主要是通过在不利的条件下休眠不萌发，从而达到自我保护。因此，可以利用这种敏感性来防治土传类植物病害。即有目的增加土壤抑菌作用，通过限制病原真菌孢子繁殖而达到控制病害的目的。但对病害生防真菌而言，则是通过减少土壤抑菌作用而增强防效。最近的研究表明，土壤的微生物菌群是影响土壤抑真菌作用的重要因素。由这些微生物产生的非挥发性抗真菌化合物起了决定的作用，因此研究和开发具有土壤抑菌作用的化合物对于土传类病害控制具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是从具有强土壤抑菌作用的土壤中，分离出强抑制性细菌的代谢产物中，筛选出对病原真菌的孢子具有强抑制作用的化合物，用于开发土传类病害生防菌剂及生防菌剂增效剂。
本发明采用的生产菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C2，该菌株于2005年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.1318。
本发明采用常规技术制备，本发明是这样实现的1、从枯草芽孢杆菌C2中提取活性化合物伊枯草菌素A(Iturin A)选用从强抑真菌孢子萌发的土壤中分离筛选获得的枯草芽孢杆菌C2菌株，采用常规方法用营养肉汤培养基培养，培养基为牛肉膏3克、蛋白胨5克、7波美度的麦芽汁500ml、pH 7.5，在37℃下发酵培养36小时，将发酵液低压浓缩后，用甲醇提取。经反复凝胶柱层析，甲醇洗脱，得到本发明的化合物，该活性化合物命名为伊枯草菌素A(Iturin A)，结构鉴定为基质辅助激光解吸飞行质谱显示该化合物在1043，1057，1071处有[M+H]+峰。UV(乙醇)λmax(logε)203(ε37700)。
2、活性化合物伊枯草菌素A(Iturin A)对植物病原真菌孢子的药效试验(1)试验用药剂将化合物伊枯草菌素A用无菌蒸馏水分别配成浓度为15，10，8，5μg ml-1六个浓度。
将未接种的发酵液低压浓缩后，分别用正丁醇和乙酸乙酯萃取，浓缩后部位在硅胶G上用氯仿和甲醇(增加甲醇的比例)洗脱，所得馏分做活性，将活性部位合并。然后用SephadexLH-20分离，用甲醇做洗脱剂。洗脱液浓缩后用无菌蒸馏水分别配成浓度为15，10，8，5μg ml-1六个浓度作为对照。
(2)制备试验用病原真菌和生防真菌a.腐皮链孢(Fusarium solani f.sp.radicicola)，三七根腐病原菌将腐皮链孢接种于马铃薯培养基上，于28℃下培养6天。用无菌蒸馏水将孢子洗下后用离心机将蒸馏水除去，冻于4℃冰箱备用。
b.灰霉病菌(Botrytis cinerea)，灰霉病原菌将灰霉菌接种于马铃薯培养基上，于28℃下培养6天。用无菌蒸馏水将孢子洗下后用离心机将蒸馏水除去，冻于4℃冰箱备用。
c.哈慈木霉(Trichodermaa harzianum)，真菌病害生防菌将哈慈木霉接种于马铃薯培养基上，于28℃下培养6天。用无菌蒸馏水将孢子洗下后用离心机将蒸馏水除去，冻于4℃冰箱备用。
(3)试验方法将本发明的活性化合物用马铃薯液体培养基配成浓度为15，10，8，5μg ml-1四个供试药液，将药液500μl放于1.5ml离心管中，加入病原孢子使孢子浓度为104，放置于28℃下培养，分别于16小时，24小时，36小时在显微镜下观察孢子萌发率。
鉴定孢子萌发的方法为当孢子芽管长度超过孢子直径2倍的认为萌发。
以对照药剂作对照，整个实验重复3次，取3次平均值计算出平均萌发率。
(4).试验结果表1抑制腐皮链孢(Fusarium solani f.sp.Radicicola)孢子萌发的作用
表2 抑制灰霉病菌Botrytis cinerea孢子萌发的作用
表3抑制哈慈木霉Trichodermaha harzianum孢子萌发的作用
结果表明本发明的活性化合物伊枯草菌素A(Iturin A)对两种病原真菌孢子的萌发有较好的抑制作用，在浓度为10μg ml-1时就能完全抑制住孢子的萌发和生长。而对于生防真菌，在浓度为8μg ml-1时就能完全抑制住孢子的萌发和生长。
本发明的活性化合物伊枯草菌素A可作为制备抑制土壤病原真菌孢子萌发的生物农药制剂的应用。
本发明与现有的杀真菌药相比，具有高效、低毒及低残留等优点。
具体实施例方式以下是本发明的实施例(方法为常规方法)，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一从具有强土壤抑菌作用的土壤中，分离出强抑制性细菌，从中筛选获得的枯草芽孢杆菌C2菌株，进行扩大培养。用营养肉汤培养基培养，培养基为牛肉膏3克、蛋白胨5克、7波美度的麦芽汁500ml、pH7.5，于37℃下发酵培养36小时后，将发酵液低压浓缩，用甲醇提取。经反复凝胶柱层析，甲醇洗脱，得到本发明的化合物，该活性化合物命名为伊枯草菌素A(Iturin A)。
结构鉴定为基质辅助激光解吸飞行质谱显示该化合物在1043，1057，1071处有[M+H]+峰。UV(乙醇)λmax(logε)203(ε37700)。
实施例二将本发明的活性化合物伊枯草菌素A用马铃薯液体培养基配成浓度为15，10，8，5μg ml-1四个供试药液，将药液500μl放于1.5ml离心管中，加入病原孢子使孢子浓度为104，放置于28℃下培养，分别于16小时，24小时，36小时在显微镜下观察孢子萌发率。
结果表明(表1-3)本发明化合物伊枯草菌素A(Iturin A)对两种病原真菌孢子的萌发有较好的抑制作用，在浓度为10μg ml-1时就能完全抑制住孢子的萌发和生长。而对于生防真菌，在浓度为8μg ml-1时就能完全抑制住孢子的萌发和生长。本发明的活性化合物伊枯草菌素A具有高效、低毒及低残留等优点。
权利要求
1.一种抑制土壤中真菌孢子萌发的化合物，由生产菌株经营养肉汤培养、低压浓缩、甲醇提取、反复凝胶柱层析及甲醇洗脱后得到，其特征在于a.生产菌株为从强抑真菌孢子萌发的土壤中分离筛选获得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)C2，该菌株于2005年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.1318；b.该活性化合物命名为伊枯草菌素A(Iturin A)，结构鉴定为基质辅助激光解吸飞行质谱显示该化合物在1043，1057，1071处有[M+H]+峰，UV(乙醇)λmax(logε)203(ε37700)。
2.权利要求1所说的化合物伊枯草菌素A，能够抑制三七根腐病的病原菌腐皮链孢、灰霉病菌和哈慈木霉生防菌孢子萌发，可应用于植病生防和生防剂菌增效。
全文摘要
本发明涉及一种抑制土壤中真菌孢子萌发的化合物及其应用，属生物农药技术领域。本发明的活性化合物伊枯草菌素A(IturinA)，选用从强抑真菌孢子萌发的土壤中分离筛选获得的枯草芽孢杆菌C2菌株，经营养肉汤培养、低压浓缩、甲醇提取、反复凝胶柱层析，甲醇洗脱后得到。枯草芽孢杆菌C2菌株的保藏号为CGMCC NO.1318。化合物伊枯草菌素A(IturinA)的结构鉴定为基质辅助激光解吸飞行质谱显示该化合物在1043，1057，1071处有[M+H]
文档编号C12N1/20GK1683519SQ20051001069
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者李蕾, 张克勤 申请人:云南大学