专利名称：Sip基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及SIP基因，该基因编码的SIP蛋白，以及所述基因和蛋白在医学中的应用。所述蛋白能够抑制肿瘤的生长和增殖，对cyclinD1启动子启动荧光素酶表达起抑制作用。
背景技术：
某些蛋白可抑制肿瘤细胞的生长和增殖，发现新的抑制肿瘤生长和增殖的蛋白和编码它们的基因可为肿瘤的治疗提供新的方法和手段。
发明内容
本发明发现了一种可抑制乳腺癌等的癌细胞的生长和增殖的蛋白，克隆了编码该蛋白的基因，构建了含有该基因的表达载体和含有该表达载体的宿主细胞，并且发现该蛋白可抑制乳腺癌等肿瘤细胞的生长和增殖，基于以上发现，完成了本发明。
因此，在一个方面，本发明提供了可抑制肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了编码上述蛋白的基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。
在另一个方面，本发明提供了含有上述基因或者编码上述蛋白的基因的表达载体。
在又一个方面，本发明提供了由上述表达载体转化的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了生产本发明的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤培养上述转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白；和从培养物中分离出重组蛋白。
在另一个方面，本发明提供了针对上述蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。它可以是单克隆或多克隆抗体。
在另一个方面，本发明提供了检测所述蛋白的试剂盒，它含有上述特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列2所示的蛋白。
此外，本发明提供了用于检测序列1所示的核苷酸序列的探针诊断试剂盒，它含有与核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。它可以是一个具有15-300个碱基的DNA片段。通过探针杂交的方法，用于检测含有所述核苷酸序列的mRNA的表达，该mRNA被翻译为含有序列2所示的氨基酸序列的蛋白。
此外，本发明提供了一个引物对，用于对进行PCR扩增，引物如下所示Primer15’-tgc tct aga gcc acc atg gac tac aaggac gac gat gac aag gaa ttc atg gcc cag gtc ctg cac-3’Primer25’-cgc gga tcc cta ctc ttc tgc cga gga-3’。
本发明还提供了上述基因、蛋白或抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
附图简述
图1是Northern Blot结果表明基因转录本与其全长大小相符。且在人类的8种组织中均有表达。与生物信息学预测相符。
图2为GST-SIP融合蛋白在大肠杆菌BL21中表达纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。90kDa为蛋白质的分子量。箭头所指为分离出的蛋白条带。
图3为SIP蛋白在真核细胞MCF-7中的表达图(Western blot)。一抗为小鼠抗人Flag单克隆抗体，二抗为本实验室保存的兔抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗。1为阴性对照，2为细胞裂解液。MCF-7细胞用flag标签的pcDNA3.1(-)-SIP转染。蛋白水平用抗flag抗体测试。1-2道分别表示阴性对照和MCF-7的细胞溶解产物。
图4为SIP蛋白的亚细胞定位。绿色为GFP，蓝色为DAPI染的胞核。SIP的亚细胞定位于细胞质。
图5为MTT法检测不同浓度的SIP对乳腺癌细胞增殖的影响。横坐标为转染时间，纵坐标为570nm吸光度值。在每组方柱中，从左至右依次是v-25ng，SIP-25ng，v-50ng，SIP-50ng，v-100ng，SIP-100ng。
图6为SIP对cyclinD1启动子启动荧光素酶表达的作用。横坐标为cyclinDl启动子不同的缺失体。纵坐标为Firefly/Renilla比值。
图7是SIP的结构示意图，其中的两个灰色方框为由Coils2<http:∥smart.embl-heidelberg.de/help/smart glossary.shtml>程序测定的卷曲螺旋区域和6个黑色方框是由SEG<http:∥smart.embl-heidelberg.de/help/smart glossary.shtml>测定的组成复杂性低的链段。
SIP(SRC-l interacting protein)是由p160家族成员之一的SRC-1通过酵母双杂交的方法筛选出来的新基因。我们从人乳腺cDNA文库中通过PCR的方法获取该基因的ORF。克隆到pcDNA3.1(-)真核表达载体中。为便于检测，在其N端接上Flag标签。SIP又叫KIAA1518，FLJ20004，DKFZp434N161。定位于染色体19p13.2。全长5358bp。表达蛋白～90kD。ORF2580bp。编码859个氨基酸。
对其进行生物信息学分析，发现其广谱表达。包含Ankyrin repeat结构域。
(1)SIP表达信息cDNA来源正常前列腺；睾丸；结肠；结肠肿瘤，RER+；Pooled-Skin；成神经细胞瘤COT 10 NORMALIZED；原发性肺囊性纤维化上皮细胞；脂肪；恶性黑色素瘤，淋巴结转移；白质；耳蜗；骨髓基质；恶性胶质瘤(pooled)；五种合并肉瘤，包括粘液样脂肉瘤，单发纤维瘤，恶性纤维组织细胞瘤，胃肠的基质肿瘤肿瘤，和间皮瘤；小细胞癌；胎盘；淋巴；三种合并脑膜瘤；全脑；中度分化子宫内膜腺癌，3种合并肿瘤；正常结肠；软骨肉瘤肺转移细胞系；成神经管细胞瘤；肿瘤；卵巢；B细胞，慢性淋巴细胞白血病；上皮癌；黑素瘤；乳房；浆液乳头状癌，高级，2种合并肿瘤；正常睾丸；整个胚胎，主要是躯体；卵巢肿瘤组织；前列腺；交感神经干；肝脏与脾；脑膜瘤；正常前列腺；肾肿瘤；虹膜；晶状体；嗅上皮；胎盘；颈；正常胎盘；正常子宫内膜，中分泌期，第23个周期日；黑素细胞；合并人黑素细胞，胎心，和妊娠子宫；肾；腺癌；具有印戒细胞特征的分化不良腺癌；合并；正常着色的视上皮；黑素瘤，高MDR(细胞系)；上皮癌细胞系；成神经细胞瘤；宫颈癌细胞系；海马；合并的脑，肺，睾丸；视神经；子宫肿瘤；胎儿胰腺(4 Pooled Donors，18-20星期，stratagene)；胎儿眼睛；衰老成纤维细胞；腹水；肺；初级肺上皮细胞；肺病灶纤维化；转移性软骨肉瘤；软骨肉瘤；不良分化子宫内膜腺癌，2种合并肿瘤；子宫；鳞状细胞癌；多发性硬化病变；胰岛瘤；脾；鳞状细胞癌，细胞系；成视网膜细胞瘤；混合(pool of 40 RNAs)；内生软骨瘤细胞系；软骨下骨；心脏；肺；良性肿瘤；十二指肠腺癌，细胞系；子宫内膜，腺癌细胞系；血；人肺上皮细胞；眼睛前段；脊神经后根神经节；畸胎癌，细胞系；RPE/脉络膜；细胞系；纯化郎格罕氏岛；平滑肌肉瘤；生发中心B细胞；中度分化腺癌；胰腺；滑膜；胸肌(在乳房切除术以后)；甲状腺；神经鞘瘤肿瘤；前列腺肿瘤。
(2)在氨基酸序列基础上通过ExPASy及interPro对其主要功能结构域预测，发现一个功能结构域Ankyrin。具体细节见下图及表图1是SIP的结构示意图，其中的两个灰色方框为由Coils2<http:∥smart.embl-heidelberg.de/help/smart glossary.shtml>程序测定的卷曲螺旋区域和6个黑色方框是由SEG<http:∥smart.embl-heidelberg.de/help/smart glossary.shtml>测定的组成复杂性低的链段。
通过使用本发明的蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗体，抗体用于所述蛋白的检测和纯化。可以利用本发明的蛋白或其部分氨基酸序列作为免疫原来产生抗体。可以通过将抗体接种给宿主动物并回收血清的常规方法产生多克隆抗体。还可以通过常规杂交瘤方法产生单克隆抗体。
利用MTT法检测不同浓度的SIP对MCF-7肿瘤细胞增殖的影响，结果发现，GIBC有抑制肿瘤细胞增殖的作用。
因此，本发明的蛋白可用于治疗肿瘤，尤其乳腺癌。
实施例实施例1用PCR方法从人乳腺癌cDNA文库克隆编码SIP蛋白的基因用乳腺癌cDNA文库为模板，在SIP基因N端接上Flag标签，用下列引物进行PCR扩增Primer15’-tgc tct aga gcc acc atg gac tac aag gacgac gat gac aag gaa ttc atg gcc cag gtcctg cac-3’Primer25’-cgc gga tcc cta ctc ttc tgc cga gga-3’扩增反应的条件在50μL的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(PH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，0.25U的pfu DNA聚合酶(Takara公司产品)。按下列条件反应30个周期94℃ 30sec；59℃ 30sec；72℃ 2min 30sec。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用XbaI及BamHI双酶切后，克隆到相同酶切的pcDNA3.1(-)真核表达载体中。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与预期相符。
实施例2Northern Blot探针的标记和杂交操作参照Clontech公司的SpotlightTMRandomPrimer Labeling Kit试剂盒说明书。过程如下(1)探针标记25ng-1μgDNA溶于20μL体积中，90-100℃ 2-3分钟，迅速冰浴5分钟，加5μL[α-32P]dCTP标记的RandomPrimers and Reaction Buffer Mix，补水至50μL，37℃孵育5-10min。
(2)杂交68℃预热杂交液，将吸附有核酸的尼龙膜放入含有杂交液的杂交瓶中，加入含有100μg/mL的鲑精DNA的杂交液0.1mL/cm2，68℃预杂交30min。20ng/mL探针混入杂交液，95℃ 2-5分钟，冰浴5分钟。加入杂交瓶，68℃杂交1小时。
(3)洗膜用Wash Buffer 1室温洗膜30-40分钟，用Wash Buffer 250℃洗膜40分钟。
(4)显色用镊子取出膜，洗干Wash Buffer 2，用保鲜膜覆盖，-70℃曝光1-3天后显影，定影。
实施例3SIP在原核细胞中的表达及纯化pGEX-4T-3-SIP可以在大肠杆菌BL21菌株中30℃诱导表达GST-SIP的融合蛋白，首先制备BL21的感受态细胞挑取单克隆到适量培养基中，37℃ 250rpm培养至A6000.4-0.5，2500g离心15分钟，备用。将1-50ng pGEX-4T-3-SIP转化到上述制备的感受态细胞中，用Glutathione Sepharose 4B进行纯化，纯化的步骤如下(1)取单克隆到2-3mL 2YTA培养基中培养4-5小时。转接到100mL的锥形瓶中生长过夜。
(2)转接到500mL的锥形瓶中培养3-5小时。
(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培养3-6小时。
(4)3000rpm 10分钟离心收集细胞。
(5)用25mL PBS重悬细胞。超声10分钟。
(6)加1.25mL 20％Triton X-100，混匀1小时。
(7)1000rpm 10分钟离心，加入0.5mL 50％slurry of GlutathioneSepharose 4B，室温30分钟。
(8)1000rpm 5分钟离心，PBS洗三遍。
(9)用0.5mL洗脱Buffer洗脱，短暂离心后收集上清。
实施例4SIP在真核细胞中的表达Western Blot是在蛋白质电泳和固相免疫测定的基础上发展起来的。其基本原理为抗原抗体反应。细胞蛋白提取物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到固相支持物上(本实验采用硝酸纤维素膜)。与特异的一抗反应(本实验用小鼠抗人Flag单克隆抗体，Sigma)，再与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(本实验室保存兔抗鼠二抗)孵育，显色，可以得到特异蛋白分子的免疫印迹图。该方法具有从混杂抗原中检测出特定的抗原的优点，因此本实验用于检测带有Flag标签的SIP基因转染MCF-7细胞后的表达情况。
1)瞬时转染实验于转染前一天将MCF-7细胞接种于10cm培养板中，接种密度为2×106个细胞/孔，每孔加入培养液10ml。24小时后，细胞长至覆盖培养孔底面积约50-60％时，可准备转染。在EP管中配制下述溶液溶液A24μg pcDNA3.1(-)-SIP表达质粒，溶于1.5mL无血清无双抗DMEM培养液。溶液B将48μL脂质体溶液(lipofectamine 2000reagent)加入到1.5m L无血清无双抗DMEM培养液中。室温静置5分钟。然后将溶液A、B混合，室温静置20分钟。用无血清和不含双抗的DMEM培养液洗涤细胞。将上述溶液A、B的混合液中加入12mL无血清无双抗的DMEM培养液，混匀后加至细胞表面。37℃，5％CO2条件下孵育4-6小时后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培养液取代前述培养液，继续培养细胞至48小时。
2)细胞总蛋白的提取培养的细胞经0.25％胰酶消化使之分散，4℃低速离心去上清，将沉淀置于冰上30min，再用预冷的PBS洗2次，每106细胞加入裂解液100μL，使细胞充分裂解30min，再于4℃，20000×g离心15min，收集上清。
3)Bradford法测定细胞裂解液蛋白的浓度首先配制考马斯亮蓝染色液；将标准牛血清白蛋白(BSA)配制成1mg/ml的蛋白标准液，分别将10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg蛋白标准液和5μL待测蛋白质样品加入3mL考马斯亮蓝染液中，室温孵育10min，在595nm波长处测定吸收值。BSA标准样品测定标准曲线，在一定范围内OD595与蛋白浓度成正比。样品蛋白质的浓度经标准曲线拟合方程来计算。
4)电泳及免疫反应流程如下A、制胶(5％浓缩胶，10％分离胶)；B、50μg蛋白样品加入上样缓冲液，煮沸，上样；C、电泳，浓缩胶80V电压，分离胶120V电压；D、转膜，100V，1.5h；E、封闭，1h；F、一抗反应，4℃，过夜；G、TBST洗膜，三次，每次10min；H、二抗反应，1.5h；I、TBST洗膜，三次，每次10min；J、显色、曝光。
实施例5SIP在细胞内的定位利用本实验室保存的pEGFP-C1 C末端蛋白融合载体构建了pEGFP-C1-SIP载体，它可以在真核细胞内表达GFP-SIP的融合蛋白，将该载体用LipofectinTM的方法转染进MCF-7细胞中，转染的细胞进行爬片，24小时后，用PBS洗三遍，用4％多聚甲醛/PBS进行固定，室温15分钟，然后用PBS洗三遍。用0.1％Triton X-100/PBS透化15分钟，然后用PBS洗三遍，加入200μL 2.5mg/mL的DAPI，室温作用30分钟，然后用PBS洗三遍，在荧光显微镜下分别用常规荧光波长和DAPI波长进行观察，并进行拍照。结果见图4，定位于细胞质。
实施例6MTT法检测不同浓度的SIP对乳腺癌细胞增殖的影响MTT(四甲基偶氮唑兰)可被细胞摄取，并被活细胞内线粒体脱氢酶还原成一种不溶于水的蓝紫色产物甲瓒，并沉淀于细胞中，而死细胞没有这种功能。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)，溶液在570nm处有最大吸收。故该波段处吸收值越大代表存活细胞量越多。MTT法广泛应用于细胞毒性实验、细胞生长测定等。本实验利用MTT法观察SIP对MCF-7生长的影响。具体操作方法如下将培养到对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔板中，每孔接种细胞数为1×104个。次日按照浓度梯度加入SIP(25、50、100ng)，每浓度作用6孔细胞，37℃，5％CO2进行培养。分别培养1d、2d、3d、4d后，在每个细胞培养孔内加入50μlL 1mg/mL的MTT溶液，同样培养条件下作用4小时后取出，小心吸出每孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150μL，轻微振荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚砜中。用自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。参看图5，MTT实验表明SIP对MCF-7细胞生长增殖起抑制作用，并且与剂量有关。
实施例7瞬时转染及荧光素酶(Luciferase)实验应用荧光素酶作为报告基因，为分析基因的调控元件和测量基因转录活性提供了便利的方法。本实验就是将cyclinD1基因启动子与荧光素酶读码框共同构建到真核表达载体中，将该融合表达质粒转染细胞，通过测定荧光素酶的活性，从而研究转录因子、调节蛋白对cyclinD1基因启动子的作用。实验采用萤火虫荧光素酶(Firefly)为报告基因，海三色堇(Renillar)荧光素酶为内参照。用Promega公司出产的双荧光报告基因分析系统试剂盒，在同一试管中测量两种酶的活性。并应用化学发光仪进行检测。
2)瞬时转染实验于转染前一天将MCF-7细胞接种于24孔培养板中，接种密度为1-2×105个细胞/孔，每孔加入培养液0.5mL。24小时后，细胞长至覆盖培养孔底面积约50-60％时，可准备转染。在EP管中配制下述溶液溶液A0.8μg DNA(cyclinD1报告基因质粒200ng；内参Renillar质粒10ng；SIP表达质粒600ng或pcDNA3.1(-)空载体质粒600ng)，溶于50μL无血清无双抗DMEM培养液。溶液B将2μL脂质体溶液(lipofectamine 2000reagent)加入到50μL无血清无双抗DMEM培养液中。室温静置5分钟。然后将溶液A、B混合，室温静置20分钟。用无血清和不含双抗的DMEM培养液洗涤细胞。将上述溶液A、B的混合液中加入400μL无血清无双抗的DMEM培养液，混匀后加至细胞表面。每个实验组重复3孔。37℃，5％CO2条件下孵育4-6小时后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培养液取代前述培养液，继续培养细胞至48小时。裂解细胞，测量荧光素酶的活性。
2)用双荧光报告基因试剂盒测量双荧光素酶的活性(1)裂解细胞用冷PBS清洗细胞，将1×细胞裂解液(PLB)100μL加入每个细胞培养孔，室温孵育15分钟，使细胞充分裂解。所得到的细胞裂解液可直接用于荧光测量。
(2)荧光素酶底物的配制将萤火虫荧光素酶底物冷冻干粉溶于10mL荧光素酶分析缓冲液中，所得溶液为LARII，分装，-70℃保存。
用Stop & Glo缓冲液将50×海三色堇荧光素酶底物稀释到1×，所得溶液为Stop & Glo，现用现配。
(3)测量过程将20μL细胞裂解液放入96孔荧光测量板，加入100μLLARII，测量萤火虫荧光素酶，测量条件为延迟2秒，测量10秒。再加入100μLStop & Glo，测量海三色堇荧光素酶，测量条件同上。
参看图6，SIP对cyclinD1启动子启动荧光素酶表达起抑制作用。
SIP序~1SEQUENCE LISTING<110>北京大学<120>SIP基因及其编码的蛋白和应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2580<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(2577)<223>
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SIP序~1Gln His Ile Pro Thr Ala Glu Gly Ala Ser Gly Ser Asn Thr Glu Glu580 585 590gag atc agg atg gag cta agc cct gac ctc atc tca gcc tgc ttg gcc 1824Glu Ile Arg Met Glu Leu Ser Pro Asp Leu Ile Ser Ala Cys Leu Ala595 600 605ctg gaa aag tac ctg gac aat ccc aac gcc ctc aca gag cgg gag ctg 1872Leu Glu Lys Tyr Leu Asp Asn Pro Asn Ala Leu Thr Glu Arg Glu Leu610 615 620aaa gtg gcc tac acc aca gtg ctg cag gag tgg ctg cgc ctg gcc tgc 1920Lys Val Ala Tyr Thr Thr Val Leu Gln Glu Trp Leu Arg Leu Ala Cys625 630 635 640cgc agc gac gca cac ccc gag ctg gtg cgg cgg cac ctg gtc acg ttc 1968Arg Ser Asp Ala His Pro Glu Leu Val Arg Arg His Leu Val Thr Phe645 650 655cgg gcc atg tct gcg cgg ctg ctg gac tac gtg gtc aac atc gcc gac 2016Arg Ala Met Ser Ala Arg Leu Leu Asp Tyr Val Val Asn Ile Ala Asp660 665 670agc aac ggc aac aca gcc ctg cac tac tcc gtg tct cat gcc aac ttc 2064Ser Asn Gly Asn Thr Ala Leu His Tyr Ser Val Ser His Ala Asn Phe675 680 685ccc gtg gtg cag cag ctg ctc gac agc ggt gtc tgc aag gtg gac aaa 2112Pro Val Val Gln Gln Leu Leu Asp Ser Gly Val Cys Lys Val Asp Lys690 695 700cag aac cgt gct ggc tac agc cct att atg ctc acc gcc ctg gcc acc 2160Gln Asn Arg Ala Gly Tyr Ser Pro Ile Met Leu Thr Ala Leu Ala Thr705 710 715 720ctg aag acc cag gac gac atc gag act gtc ctt cag ctc ttc cgg ctt 2208Leu Lys Thr Gln Asp Asp Ile Glu Thr Val Leu Gln Leu Phe Arg Leu725 730 735ggc aac atc aat gcc aaa gcc agc cag gca gga cag acg gcc ctg atg 2256Gly Asn Ile Asn Ala Lys Ala Ser Gln Ala Gly Gln Thr Ala Leu Met740 745 750ctg gcc gtc agc cac ggg cgg gtg gac gtt gtc aaa gcc ctg ctg gcc 2304Leu Ala Val Ser His Gly Arg Val Asp Val Val Lys Ala Leu Leu Ala755 760 765tgt gag gca gat gtc aac gtg caa gat gat gac ggc tcc acg gcc ctc 2352Cys Glu Ala Asp Val Asn Val Gln Asp Asp Asp Gly Ser Thr Ala Leu770 775 780atg tgc gcc tgt gag cac ggc cac aag gag atc gcg ggg ctg ctg ctg 2400Met Cys Ala Cys Glu His Gly His Lys Glu Ile Ala Gly Leu Leu Leu785 790 795 800gcc gtg ccc agc tgt gac atc tca ctc aca gat cgc gat ggg agc aca 2448
SIP序~1Ala Val Pro Ser Cys Asp Ile Ser Leu Thr Asp Arg Asp Gly Ser Thr805 810 815gct ctg atg gtg gcc ttg gac gca ggg cag agt gag att gcg tcc atg 2496Ala Leu Met Val Ala Leu Asp Ala Gly Gln Ser Glu Ile Ala Ser Met820 825 830ctg tat tcc cgc atg aac atc aag tgc tcg ttt gcc cca atg tca gat 2544Leu Tyr Ser Arg Met Asn Ile Lys Cys Ser Phe Ala Pro Met Ser Asp835 840 845gac gag agc cct aca tca tcc tcg gca gaa gag tag 2580Asp Glu Ser Pro Thr Ser Ser Ser Ala Glu Glu850 855<210>2<211>859<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Gln Val Leu His Val Pro Ala Pro Phe Pro Gly Thr Pro Gly1 5 10 15Pro Ala Ser Pro Pro Ala Phe Pro Ala Lys Asp Pro Asp Pro Pro Tyr20 25 30Ser Val Glu Thr Pro Tyr Gly Tyr Arg Leu Asp Leu Asp Phe Leu Lys35 40 45Tyr Val Asp Asp Ile Glu Lys Gly His Thr Leu Arg Arg Val Ala Val50 55 60Gln Arg Arg Pro Arg Leu Ser Ser Leu Pro Arg Gly Pro Gly Ser Trp65 70 75 80Trp Thr Ser Thr Glu Ser Leu Cys Ser Asn Ala Ser Gly Asp Ser Arg85 90 95His Ser Ala Tyr Ser Tyr Cys Gly Arg Gly Phe Tyr Pro Gln Tyr Gly100 105 110Ala Leu Glu Thr Arg Gly Gly Phe Asn Pro Arg Val Glu Arg Thr Leu115 120 125Leu Asp Ala Arg Arg Arg Leu Glu Asp Gln Ala Ala Thr Pro Thr Gly
SIP序~1130 135 140Leu Gly Ser Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gly Ser Thr Ala Ser Leu Val145 150 155 160Gly Val Gly Leu Pro Pro Pro Thr Pro Arg Ser Ser Gly Leu Ser Thr165 170 175Pro Val Pro Pro Ser Ala Gly His Leu Ala His Val Arg Glu Gln Met180 185 190Ala Gly Ala Leu Arg Lys Leu Arg Gln Leu Glu Glu Gln Val Lys Leu195 200 205Ile Pro Val Leu Gln Val Lys Leu Ser Val Leu Gln Glu Glu Lys Arg210 215 220Gln Leu Thr Val Gln Leu Lys Ser Gln Lys Phe Leu Gly His Pro Thr225 230 235 240Ala Gly Arg Gly Arg Ser Glu Leu Cys Leu Asp Leu Pro Asp Pro Pro245 250 255Glu Asp Pro Val Ala Leu Glu Thr Arg Ser Val Gly Thr Trp Val Arg260 265 270Glu Arg Asp Leu Gly Met Pro Asp Gly Glu Ala Ala Leu Ala Ala Lys275 280 285Val Ala Val Leu Glu Thr Gln Leu Lys Lys Ala Leu Gln Glu Leu Gln290 295 300Ala Ala Gln Ala Arg Gln Ala Asp Pro Gln Pro Gln Ala Trp Pro Pro305 310 315 320Pro Asp Ser Pro Val Arg Val Asp Thr Val Arg Val Val Glu Gly Pro325 330 335Arg Glu Val Glu Val Val Ala Ser Thr Ala Ala Gly Ala Pro Ala Gln340 345 350Arg Ala Gln Ser Leu Glu Pro Tyr Gly Thr Gly Leu Arg Ala Leu Ala
SIP序~1355 360 365Met Pro Gly Arg Pro Glu Ser Pro Pro Val Phe Arg Ser Gln Glu Val370 375 380Val Glu Thr Met Cys Pro Val Pro Ala Ala Ala Thr Ser Asn Val His385 390 395 400Met Val Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Arg Ser Cys Asp Gly Ala Ala405 410 415Gly Leu Pro Glu Val Pro Ala Glu Ser Ser Ser Ser Pro Pro Gly Ser420 425 430Glu Val Ala Ser Leu Thr Gln Pro Glu Lys Ser Thr Gly Arg Val Pro435 440 445Thr Gln Glu Pro Thr His Arg Glu Pro Thr Arg Gln Ala Ala Ser Gln450 455 460Glu Ser Glu Glu Ala Gly Gly Thr Ala Pro Pro Leu Ser Ser Pro Pro465 470 475 480Gly Gly Pro Pro Ala Gly Val Arg Ser Ile Met Lys Arg Lys Glu Glu485 490 495Val Ala Asp Pro Thr Ala His Arg Arg Ser Leu Gln Phe Val Gly Val500 505 510Asn Gly Gly Tyr Glu Ser Ser Ser Glu Asp Ser Ser Thr Ala Glu Asn515 520 525Ile Ser Asp Asn Asp Ser Thr Glu Asn Glu Ala Pro Glu Pro Arg Glu530 535 540Arg Val Pro Ser Val Ala Glu Ala Pro Gln Leu Arg Pro Ala Gly Thr545 550 555 560Ala Ala Ala Lys Thr Ser Arg Gln Glu Cys Gln Leu Ser Arg Glu Ser565 570 575Gln His Ile Pro Thr Ala Glu Gly Ala Ser Gly Ser Asn Thr Glu Glu
SIP序~1580 585 590Glu Ile Arg Met Glu Leu Ser Pro Asp Leu Ile Ser Ala Cys Leu Ala595 600 605Leu Glu Lys Tyr Leu Asp Asn Pro Asn Ala Leu Thr Glu Arg Glu Leu610 615 620Lys Val Ala Tyr Thr Thr Val Leu Gln Glu Trp Leu Arg Leu Ala Cys625 630 635 640Arg Ser Asp Ala His Pro Glu Leu Val Arg Arg His Leu Val Thr Phe645 650 655Arg Ala Met Ser Ala Arg Leu Leu Asp Tyr Val Val Asn Ile Ala Asp660 665 670Ser Asn Gly Asn Thr Ala Leu His Tyr Ser Val Ser His Ala Asn Phe675 680 685Pro Val Val Gln Gln Leu Leu Asp Ser Gly Val Cys Lys Val Asp Lys690 695 700Gln Asn Arg Ala Gly Tyr Ser Pro Ile Met Leu Thr Ala Leu Ala Thr705 710 715 720Leu Lys Thr Gln Asp Asp Ile Glu Thr Val Leu Gln Leu Phe Arg Leu725 730 735Gly Asn Ile Asn Ala Lys Ala Ser Gln Ala Gly Gln Thr Ala Leu Met740 745 750Leu Ala Val Ser His Gly Arg Val Asp Val Val Lys Ala Leu Leu Ala755 760 765Cys Glu Ala Asp Val Asn Val Gln Asp Asp Asp Gly Ser Thr Ala Leu770 775 780Met Cys Ala Cys Glu His Gly His Lys Glu Ile Ala Gly Leu Leu Leu785 790 795 800Ala Val Pro Ser Cys Asp Ile Ser Leu Thr Asp Arg Asp Gly Ser Thr
SIP序~1805 810 815Ala Leu Met Val Ala Leu Asp Ala Gly Gln Ser Glu Ile Ala Ser Met820 825 830Leu Tyr Ser Arg Met Asn Ile Lys Cys Ser Phe Ala Pro Met Ser Asp835 840 845Asp Glu Ser Pro Thr Ser Ser Ser Ala Glu Glu850 85权利要求
1.可抑制肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
2.编码权利要求1的蛋白的基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。
3.含有权利要求2的基因或者编码权利要求1的蛋白的基因的表达载体。
4.由权利要求3的表达载体转化的宿主细胞。
5.生产权利要求1的蛋白的方法，该方法包括下列步骤培养权利要求4的转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白；和从培养物中分离出重组蛋白。
6.针对权利要求1的蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。
7.检测所述蛋白的试剂盒，它含有权利要求6的特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列2所示的蛋白。
8.用于检测序列1所示的核苷酸序列的探针诊断试剂盒，它含有与核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
9.权利要求1的蛋白或权利要求2的基因在制备治疗肿瘤，尤其乳腺癌的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及SIP基因，该基因编码的SIP蛋白，以及所述基因和蛋白在医学中的应用。所述蛋白能够抑制肿瘤的生长和增殖，对cyclinD1启动子启动荧光素酶表达起抑制作用。
文档编号C12N15/12GK1807450SQ20051001119
公开日2006年7月26日 申请日期2005年1月18日 优先权日2005年1月18日
发明者尚永丰, 张映, 张华 申请人:北京大学