专利名称：一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法，特别是从中分离出一种为糖蛋白的蚯蚓3#纤溶酶组分，其分子量为24056道尔顿，与其它单组分的蚯蚓纤溶酶相比较，其体内溶栓作用最强，对凝血时间影响最小，可用于开发抗栓和溶栓药物。
背景技术：
蚯蚓纤溶酶是蚯蚓体内多组分蛋白水解酶，目前临床已经作为有效的口服溶栓药物用于治疗因血栓引起的各种心、脑血管疾病。市售蚯蚓纤溶酶基本上都是蚯蚓抽提液干粉，如江中博洛克和百奥蚓激酶。提高疗效的最有效方法就是将蚯蚓纤溶酶进行纯化，去掉那些无用甚至有害的杂质；此外，蚯蚓纤溶酶是由多个组分构成的，有的占主要部分，有的占次要部分。只有主要部分才真正具有开发价值。而主要部分中的不同组分之间在体内溶栓和毒副作用方面也有很大差别。开发蚯蚓纤溶酶主要部分的最佳组分是目前需要解决的问题。
中国专利CN1454994A公开了一种“分离纯化单组分纤溶酶的亲和层析法”，它是采用琼脂糖凝胶偶联p-氨基苯甲脒配基制备亲和层析柱，从蚯蚓的匀浆液中分离纯化出具有较强纤溶活力的单组分蛋白酶。通过该亲和层析柱，用含有脲基及胍基的化合物制备洗脱液进行梯度洗脱，经透析或分子筛等方法脱盐，得到其中的EFE-III纤溶蛋白酶，它具有很强的纤维蛋白溶解活力。上述亲和层析法是用昂贵的珠状琼脂糖为载体，这就限制了它的大规模工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简便实用、成本低廉，适合于大规模生产的一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案本发明以滤纸为载体，偶联大豆胰蛋白酶抑制剂，构成蚯蚓纤溶酶亲和层析系统，通过亲和层析和梯度洗脱从蚯蚓匀浆液分离出一种为糖蛋白的蚯蚓3#纤溶酶组分，其分子量为24056道尔顿；本方法的具体步骤如下(1)用常规方法制备蚯蚓匀浆液；(2)亲和层析系统的制备a、载体的预处理(预处理的目的是提高滤纸的孔径和强度)载体选用实验室用的定性滤纸，在两层滤纸之间夹一层尼龙窗纱后卷成滤纸卷、将滤纸卷放入烧杯中，将0.5～2.0mol/L的氢氧化钠溶液倒入烧杯中搅拌一小时，倒出溶液；再将同样浓度的氢氧化钠溶液并且其中含有1％～10％的环氧氯丙烷和1mg/ml的NaBH4倒入烧杯中、在50～70℃时搅拌10～60分钟，倒出溶液，用去离子水洗2～3次；b、载体的活化将上述预处理过的滤纸卷采用常规方法进行活化；c、载体与大豆胰蛋白酶抑制剂偶联将上述经活化处理后的滤纸卷用0.1mol/L的碳酸氢钠溶液洗一次，然后将其浸入含有大豆胰蛋白酶抑制剂的碳酸氢钠溶液中，碳酸氢钠溶液的浓度为0.1mol/L，其中大豆胰蛋白酶抑制剂的含量为5～50mg/ml，4～8℃时，搅拌18～22小时，再依次用PH9.0的碳酸氢钠、PH4.0的醋酸-醋酸钠溶液清洗；最后将偶联了大豆胰蛋白酶抑制剂的滤纸卷悬浮于PBS溶液中，该溶液PH7.4、内含1mg/ml的NaBH4，4～8℃时，搅拌一小时，再用PBS溶液洗2～3次；d、装柱将上述偶联了大豆胰蛋白酶抑制剂的滤纸卷除去水分后装入玻璃层析柱中；层析柱装好后用PBS溶液进行平衡；(3)亲和层析
将蚯蚓匀浆液连续泵入层析柱中，同时监测流出液的纤溶酶的含量，当流出液纤溶酶含量超过4～8μg/ml时，停止进样，然后用PBS溶液平衡；(4)梯度洗脱借助于梯度混合仪和输液泵进行连续洗脱，洗脱剂是由PBS溶液和0～6mol/L的尿素组成的混合洗脱剂，用分布收集器收集洗脱下来的样品，分别收集蚯蚓2#、3#、4#纤溶酶组分的洗脱峰，2#、3#、4#纤溶酶组分分别对应2、3、4号洗脱峰；最后将洗脱样品对水透析，冻干保存。
所述的蚯蚓匀浆液的制备方法如下将新鲜蚯蚓或蚯蚓干粉用万能粉碎机粉碎成50～200目的细小颗粒，按1∶1～1∶5体积比加入生理盐水，然后加0.5～5％重量/体积的硼砂和1～10％重量/体积的硫酸铝钾，搅拌混匀，室温放置1～7天，滤纸自然过滤。
所述的蚯蚓选自赤子爱胜蚓、双胸蚓、异唇蚓、正蚓、锯齿蚓中的一种。
所述载体的活化方法如下将预处理过的滤纸卷浸入0.1mol/L的醋酸-醋酸钠中，该醋酸-醋酸钠中含10～60mmol/L的高碘酸钠，其PH值为4～6，室温避光搅拌10～60分钟，用去离子水洗2～3次。
本发明的有益效果是由于改进了亲和层析介质，用廉价的滤纸代替昂贵的珠状琼脂糖，使生产成本大大降低，从而适合于大规模生产，另外它还具有方法简便实用的特点。
图1为利用本发明方法分离出的蚯蚓纤溶酶各种组分的溶栓活性实验结果。
图2为利用本发明方法分离出的蚯蚓纤溶酶各种组分对出血时间影响的实验结果。
具体实施例方式
本实施例以滤纸为载体，偶联大豆胰蛋白酶抑制剂，构成蚯蚓纤溶酶亲和层析系统，通过吸附和洗脱从蚯蚓匀浆液分离出3#纤溶酶组分。
分离出来的3#组分是蚯蚓体内主要纤溶酶组分之一，利用PIERCE公司糖检测试剂盒进行测定，它是一种糖蛋白；根据中国科学院化学研究所质谱中心测定结果，分子量为24056道尔顿。与其它主要组分和纤溶酶全组分比较，3#组分的体内溶栓作用最强，对凝血时间影响最小，可用于开发抗栓和溶栓药物(包括口服和针剂)。
本实施例的具体步骤如下(1)蚯蚓匀浆液的制备将新鲜的赤子爱胜蚓或其干粉(所用的蚯蚓也可以选用双胸蚓、异唇蚓、正蚓或锯齿蚓中的任意一种或者用它们的干粉)用万能粉碎机粉碎成50～200目的细小颗粒，按1∶1～1∶5体积比加入生理盐水，然后加0.5～5％重量/体积的硼砂和1～10％重量/体积的硫酸铝钾，搅拌混匀，室温放置1～7天，滤纸自然过滤，滤液澄清透明，此匀蚯蚓浆液含纤溶酶50～300μg/ml。
(2)亲和层析系统的制备a、载体的预处理(预处理的目的是提高滤纸的孔径和强度)将实验室用的定性滤纸裁成10厘米宽和60厘米长的滤纸条，将这些滤纸条整齐的叠放在一起，每两层之间放一块同样大小的尼龙窗纱，然后从一端把它们卷成一个滤纸卷，中间捆一道细线，放入适宜大小的烧杯中，滤纸卷的一端距烧杯底部1～2厘米，以保证搅拌子的自由旋转。将0.5～2.0mol/L的氢氧化钠溶液倒入烧杯中，使溶液液面超过滤纸卷，然后把烧杯放在磁力搅拌器上搅拌一小时。将溶液倒出，加入同样浓度的氢氧化钠溶液，但其中含有1％～10％的环氧氯丙烷和1mg/ml的NaBH4，在50～70℃时搅拌10～60分钟，用去离子水洗2～3次。
b、载体的活化将预处理过的滤纸卷浸入0.1mol/L的醋酸-醋酸钠中，该醋酸-醋酸钠中含10～60m mol/L的高碘酸钠，其PH值为4～6，室温避光搅拌10～60分钟，用去离子水洗2～3次。
c、载体与大豆胰蛋白酶抑制剂偶联将上述经活化处理后的滤纸卷用0.1mol/L的碳酸氢钠溶液洗一次，然后将其浸入含有大豆胰蛋白酶抑制剂的碳酸氢钠溶液中，碳酸氢钠溶液的浓度为0.1mol/L，其中大豆胰蛋白酶抑制剂的含量为5～50mg/ml，4～8℃时，搅拌18～22小时，再依次用PH9.0的碳酸氢钠、PH4.0的醋酸-醋酸钠溶液清洗；最后将偶联了大豆胰蛋白酶抑制剂的滤纸卷悬浮于PBS溶液中，该溶液pH7.4、内含1mg/ml的NaBH4，4～8℃时，搅拌一小时，再用PBS溶液洗2～3次；d、装柱取出滤纸卷，解开细线，用手掌将纸卷压在玻璃板上并沿着最初的卷动方向滚动滤纸卷，以便除去部分水分。小心将滤纸卷塞入玻璃层析柱的底部，层析柱内径应稍大于滤纸卷的外径，这样便于操作和使液体经过载体时能保持一定流速；但又不能太大，否则引起液体流动不均匀，影响层析效果。层析柱装好后，用输泵液从上部将PBS溶液打入柱内进行平衡，流出液先经过紫外检测仪，然后进入分布收集器进行样品收集。当指针到达基线时停止平衡。
(3)亲和层析将蚯蚓匀浆液连续泵入层析柱中，同时监测流出液的纤溶酶的含量，当流出液纤溶酶含量超过4～8μg/ml时，停止进样，然后用PBS溶液平衡，当检测仪指针达到或接近基线时，停止平衡。
(4)梯度洗脱借助于梯度混合仪和输液泵进行连续洗脱，洗脱剂是由PBS溶液和0～6mol/L的尿素组成的混合洗脱剂，用分布收集器收集洗脱下来的样品，分别收集蚯蚓2#、3#、4#纤溶酶组分的洗脱峰，2#、3#、4#纤溶酶组分分别对应2、3、4号洗脱峰；如果直接用6mol/L尿素洗脱，则得纤溶酶全组分样品；最后将洗脱样品对水透析，冻干保存。
利用本实施例分离出的蚯蚓纤溶酶各种组分的溶栓实验如下(一)实验血栓溶栓实验取健康雄性Wistar大鼠80只，体重240±8(330～350)g，按体重均匀分组，每组10只，戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)，气管插管，分离左、右颈总动脉。取内径1.5mm、长25cm三段套连的弧形聚乙烯管，中间内置一根6cm长的4号手术线，用肝素生理盐水(25U/ml)充满聚乙烯管。将管的一端插入左颈外静脉，另一端插入右静总动脉，开放血流并记录时间。血液从动脉流经聚乙烯管返回静脉。15min后血栓形成开始给药。从股静脉按1.5ml/kg的体积推注给药量的三分之一，约1分钟推完，其余三分之二的药量按15ml/kg的体积推注，约30min推完。停药后1小时阻断血流，迅速取出手术线，称血栓湿重。图1为溶栓组分的体内溶栓实验结果，其中3#组分的溶栓活性最高。
(二)出血时间延长实验取体重18～22g昆明小鼠，雌雄各半，按体重随机分成7组，每组10只。给药组分别尾静脉推注纤溶酶溶液，空白对照组静注生理盐水，阳性药物对照组静注尿激酶2000U/kg。体积均为0.1ml/10g，20min后将小鼠装入固定鼠筒内，每筒一只，使尾巴露在筒外，用胶布固定于台面，距远端0.5cm处剪断鼠尾，待血液自行溢出开始记时，每隔30秒钟用滤纸吸去血滴一次，直至血液自然停止溢出为止(用滤纸沾时无血)，记录出血时间。图2为全组分、2#、3#和4#组分对出血时间影响的实验结果，其中3#组分对出血时间影响最小。
权利要求
1.一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法，其特征在于以滤纸为载体，偶联大豆胰蛋白酶抑制剂，构成蚯蚓纤溶酶亲和层析系统，通过亲和层析和梯度洗脱从蚯蚓匀浆液分离出一种为糖蛋白的蚯蚓3#纤溶酶组分，其分子量为24056道尔顿；本方法的具体步骤如下(1)用常规方法制备蚯蚓匀浆液；(2)亲和层析系统的制备a、载体的预处理载体选用实验室用的定性滤纸，在两层滤纸之间夹一层尼龙窗纱后卷成滤纸卷、将滤纸卷放入烧杯中，将0.5～2.0mol/L的氢氧化钠溶液倒入烧杯中搅拌一小时，倒出溶液；再将同样浓度的氢氧化钠溶液并且其中含有1％～10％的环氧氯丙烷和1mg/ml的NaBH4倒入烧杯中、在50～70℃时搅拌10～60分钟，倒出溶液，用去离子水洗2～3次；b、载体的活化将上述预处理过的滤纸卷采用常规方法进行活化；c、载体与大豆胰蛋白酶抑制剂偶联将上述经活化处理后的滤纸卷用0.1mol/L的碳酸氢钠溶液洗一次，然后将其浸入含有大豆胰蛋白酶抑制剂的碳酸氢钠溶液中，碳酸氢钠溶液的浓度为0.1mol/L，其中大豆胰蛋白酶抑制剂的含量为5～50mg/ml，4～8℃时，搅拌18～22小时，再依次用PH9.0的碳酸氢钠、PH4.0的醋酸-醋酸钠溶液清洗；最后将偶联了大豆胰蛋白酶抑制剂的滤纸卷悬浮于PBS溶液中，该溶液PH7.4、内含1mg/ml的NaBH4，4～8℃时，搅拌一小时，再用PBS溶液洗2～3次；d、装柱将上述偶联了大豆胰蛋白酶抑制剂的滤纸卷除去水分后装入玻璃层析柱中；层析柱装好后用PBS溶液进行平衡；(3)亲和层析将蚯蚓匀浆液连续泵入层析柱中，同时监测流出液的纤溶酶的含量，当流出液纤溶酶含量超过4～8μg/ml时，停止进样，然后用PBS溶液平衡；(4)梯度洗脱借助于梯度混合仪和输液泵进行连续洗脱，洗脱剂是由PBS溶液和0～6mol/L的尿素组成的混合洗脱剂，用分布收集器收集洗脱下来的样品，分别收集蚯蚓2#、3#、4#纤溶酶组分的洗脱峰，2#、3#、4#纤溶酶组分分别对应2、3、4号洗脱峰；最后将洗脱样品对水透析，冻干保存。
2.根据权利要求1所述的一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法，其特征在于蚯蚓匀浆液的制备方法如下将新鲜蚯蚓或蚯蚓干粉用万能粉碎机粉碎成50～200目的细小颗粒，按1∶1～1∶5体积比加入生理盐水，然后加0.5～5％重量/体积的硼砂和1～10％重量/体积的硫酸铝钾，搅拌混匀，室温放置1～7天，滤纸自然过滤。
3.根据权利要求2所述的一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法，其特征在于所述载体的活化方法如下将预处理过的滤纸卷浸入0.1mol/L的醋酸-醋酸钠中，该醋酸-醋酸钠中含10～60mmol/L的高碘酸钠，其PH值为4～6，室温避光搅拌10～60分钟，用去离子水洗2～3次。
4.根据权利要求2所述的一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法，其特征在于所述的蚯蚓选自赤子爱胜蚓、双胸蚓、异唇蚓、正蚓、锯齿蚓中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法，特别是从中分离出一种为糖蛋白的蚯蚓3#纤溶酶组分，其分子量为24056道尔顿，与其它单组分蚯蚓纤溶酶相比较其体内溶栓作用最强，对凝血时间影响最小，可用于开发抗栓和溶栓药物。本发明以滤纸为载体，偶联大豆胰蛋白酶抑制剂，构成蚯蚓纤溶酶亲和层析系统，通过亲和层析和梯度洗脱从蚯蚓匀浆液分离出蚯蚓3#纤溶酶组分。本发明的有益效果是由于改进了亲和层析介质，用廉价的滤纸代替昂贵的珠状琼脂糖，使生产成本大大降低，从而适合于大规模生产，另外它还具有方法简便实用的特点。
文档编号C12N9/68GK1673367SQ20051001241
公开日2005年9月28日 申请日期2005年3月23日 优先权日2005年3月23日
发明者赵晓瑜, 静天玉, 武金霞 申请人:河北大学