专利名称：高亲和铵转运因子融合基因及其在转基因植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体地说是用拟南芥根系特异性表达基因AtPRP3的启动子与高亲和铵转运因子AtAMT1；1基因构建AtPRP3-AtAMT1；1融合基因及其在转基因植物中的应用。
背景技术：
现代农业生产需要向土壤中施用大量肥料，不但需要大的经济投资，还会造成对地质环境的污染和破坏，因此极大地限制了现代农业的发展。同时，世界人口的快速增长对农副产品的供应造成了极大的压力。改变现代农业生产模式造成的高成本、低效率及地质环境破坏已经成为世界范围内尤其是发展中国家亟待解决的重大课题。世界人口的快速发展要求更高的农业土壤利用率和更高品质和产量的农业生产。如何提高植物从土壤中吸收养分的能力以减少农业生产成本、保持水土环境就成为我们将要面对的重要课题。利用基因工程技术改造农作物对土壤中微养分的吸收能力和利用效率已经成为新世纪国际上农业科学研究的重要课题。
农作物从土壤中对氮素的吸收主要由根细胞质膜上相应的NO3-转运因子和NH4+转运因子负责。在两种氮素形式同时存在的情况下，NH4+被优先吸收利用。目前对植物根系从土壤中吸铵的生理学研究表明，这一过程呈现出明显的双相动力学特征，即同时具有高亲合铵转运系统(high-affinity ammonium transport system，HATS)和低亲合铵转运系统(low-affinityammonium transport system，LATS)。HATS在植物处于低铵浓度(低于1mmol/L)时发挥主要的跨膜转铵作用，并且显示出饱和动力学特征，而LATS功能则是在植物处于高铵浓度(高于1mmol/L)时启动，并且显示出非饱和动力学特征。无论是HATS还是LATS，其包含的转运蛋白成员多是组成型表达，但在一定条件下也可被诱导表达(Sohlenkamp C et al，Characterization of Arabidopsis AtAMT2，a novel ammonium transporter in plants.FEBS Letters，2000，467273-278)。
对模式植物拟南芥的研究表明铵转运因子主要由AtAMT1和AtAMT2两大基因族编码，其中AtAMT1家族中的ATAMT1；1基因所编码的铵转运因子在所有已发现的铵转运因子中对NH4+的亲和力最高(Gazzarrini S et al，Three functional transporters for constitutive，diurnallyregulated and starvation-induced uptake of ammonium into Arabidopsis roots.Plant Cell，1999，11937-948)，这意味着可以从贫瘠土地有效吸收氮肥，因此被选为本实验的目的基因。但是，在野生型拟南芥中AtAMT1；1只有在遭受低氮胁迫的条件下才有表达，在正常培养和种植条件下该基因不表达。在正常培养和种植条件下植物靠低亲合铵转运系统吸收铵肥，因此需要向土壤中施加大量化肥。
为获得在正常培养和种植条件下根部也能持续表达AtAMT1；1基因、因而能够持续高效吸收土壤氮肥的转基因植物，我们选取了拟南芥菜中一个与根毛形成和发育相关的基因—AtPRP3基因，该基因特异性表达于根毛部，编码根毛表皮细胞胞壁上一个富含脯氨酸的结构蛋白(Bernhardt C et al，Expression of AtPRP3，a proline-rich structural cell wall protein fromArabidopsis，is regulated by cell-type-specific developmental pathways involved in root hairformation.Plant Physiol，2000，122705-714)。该结构蛋白的功能是参与细胞壁的合成，但与根系对氮肥的吸收毫无关系。在我们的实验设计中，将目的基因AtAMT1；1与AtPRP3基因的启动子融合，所构成的融合基因转入受体植物，所得到的转基因植株将在整个根系生长发育过程中都能持续而特异性地过表达高亲和铵转运因子AtAMT1；1，在氮素供应相对贫瘠的土地上种植，也能持续有效地吸收充足的氮肥供植物生长发育所用，这种特性是野生型植株所无法获得的。同时，在天然野生型植物中，AtPRP3启动子只能驱动AtPRP3基因表达生成富含脯氨酸的结构蛋白进而参与植物细胞壁的合成，而无法驱动AtAMT1；1基因在根部表达生成高亲和铵转运因子。
种植能从土壤中高效吸收氮素营养的新品种作物可以大大降低氮肥施用量，降低生产成本和水土污染。而基因工程技术的发展为获得这种作物新品种提供了可能性。但是到目前为止，国内外还没有成功地过表达氮素吸收相关蛋白并获得土壤中高效吸收氮肥的转基因农作物的文献和专利报道。
发明内容
本发明克服了现有技术中的缺点，分别克隆植物根系特异性表达启动子和高亲和铵转运因子基因，并构建可以在植物根系特异表达的高亲和铵转运因子融合基因。将该融合基因转入植物基因组中，可获得根系过表达高亲和铵转运因子、从而能从贫瘠土地或者低氮肥施用条件下高效吸收氮肥的转基因农作物新品种，对于降低农业种植的生产成本和大量氮肥施用造成的水土污染具有重要意义。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的利用拟南芥根系特异性表达基因AtPRP3的启动子与高亲和铵转运因子AtAMT1；1基因构建AtPRP3-AtAMT1；1融合基因。
所设计的拟南芥根系特异性表达基因AtPRP3的启动子的PCR扩增引物如下，其中下游引物引入BglII切点上游引物5’-TAGAAGAGTTGTAACGCAAGCTGTG-3’下游引物5’-AGATCTACCATTGCTGAGCGCTTGGC-3’所设计的拟南芥高亲和铵转运因子AtAMT1；1基因的PCR扩增引物如下，上游引物引入BglII切点，下游引物引入BstEII切点上游引物5’-4GATCTCAACATGTCTTGCTCGGCCA-3’下游引物5’-GGTCACCAAATCAAACCGGAGTAGGT-3’AtPRP3-AtAMT1；1融合基因的构建步骤如下(1)以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增AtPRP3基因的启动子，回收扩增产物并进行TA克隆；(2)以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增AtAMT1；1基因，回收扩增产物并进行TA克隆；(3)分别用BglII/EcoRI、BglII/BstEII双酶切含有AtPRP3基因启动子的TA克隆质粒和含有AtAMT1；1基因的TA克隆质粒，回收AtPRP3基因启动子片段和AtAMT1；1基因片段；(4)用EcoRI/BstEII双酶切pCAMBIA1301质粒，回收大的载体片段；(5)混合上述AtPRP3基因启动子片段、AtAMT1；1基因片段和pCAMBIA1301载体片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA1301载体上的AtPRP3-AtAMT1；1融合基因的构建。
该融合基因的序列如下tagaagagtt gtaacgcaag ctgtggttgt gggtgacgat cttccttatt tcgatattggctatccattc aagtttaggt tgttgctttg ttctactatt aatatagctc ggccttgtgattatctagtt acgtttattg ctgtgtcttt tgttcatgca tattatttca ttgctttataatgatacata atatcatact ttggtaatta cttagggatg tctttttgaa attattaatcagtcatagaa catatatatt catccaactc taatagatgg tatatgatat gaatgtttaccataccacac aacatacgat ggaaaaatga tgagttgatg acaggtcata tattattatgtatcttggca tgccatatgt tttgggctca caattatatt tcaattctta accaaattgggcttcttaaa cattcaccag gcccattgac ataatcattt cgattcagtt ttcagaagggtttttgactc taggatccct ttctctaaag ctcattgcca ttaacgttaa acaaaaacactagaaatcaa caaaaactat ttacctaaac caaaacaatc acagtttata cagagtacaaaatagtgtca taaaacccaa gtaaattaga gaattgatta gggaatatat atgtaagcag
agttactaat aaaacacctt ctgggataaa agagaagaag gtattatcag cgaaactcgcagctttagtt taggcctcac atgaatcaga taagtacttc atcaaactta gctgggattaagaaaggccc ttccatctct ctaatttctc ttctctattt gaaaacaact tttaaactatgaatcaaact gcgagcctta aacattctct aagcatatga gaaaacaaag acgaagaaccctaattctaa gatccaacat aagaaaataa acaaaaaccg aagagaaaaa tatatcgccgaatatatata acaaatctcc gatcattagt caatcgccgc ttgagcttgg atttgaggcaaagacaaata tataggattt gcttttttca tcattagggt ttccagtttt caatgttttgggcttatatt atcgggcctt taggtttaat tggcccatta gttgaaacta tacacggatggttttcttac tttctaattg ctacaaacaa cagactaatc tgtttttaca tatttaatggttcagatgtc atcaaagatt atctgtccaa atatttatat tataagatac attttaatatttaattatga tttagtagag cggccgatcc gttttgatat gtttagaact aaaaattgaaatatactaaa atcaaaattg gcaaacattt gaacgagtct catttatatg tcctctgaccatattattta atgggcctat cacatttccc gagcccagat aacgtctttt cagttctcctatccttttgg tcagcttgtg catggttgtt acttgttaat gatggccaac atgtttttgatcgtgcatta cacttaggta tgagaatctc aaacatacat gattatcatc aattactcacttttaagata acgtttcttt atttcatatt caaattttta ataccccaaa cattttcttataaagcccca tttggtgaaa tcgttttcct catcacaatt taaatacaaa gaacacaacaaacgaactag cttaaggcaa tatacaagcc aagcgctcag caatggtaga tctcaacatgtcttgctcgg ccaccgatct cgccgtcctg ttgggtccta atgccacggc ggcggccaactacatatgtg gccagctagg cgacgtcaac aacaaattca tcgacaccgc tttcgctatagacaacactt acctcctctt ctccgcctac cttgtcttct ctatgcagct tggcttcgctatgctctgtg ccggttccgt gagagccaag aatactatga acatcatgct taccaacgtccttgacgctg cagccggtgg tctcttctat tatctgtttg gctacgcctt tgcctttggatctccgtcca atggtttcat cggtaaacac tactttggtc tcaaagacat ccccacggcctctgctgact actccaactt tctctaccaa tgggcctttg caatcgctgc ggctggaatcacaagtggct cgatcgctga acggacacag ttcgtggctt acctaatcta ttcctctttcttaaccgggt ttgtttaccc ggtcgtctct cactggttct ggtcagttga tggatgggccagcccgttcc gtaccgatgg agatttgctt ttcagcaccg gagcgataga tttcgctgggtccggtgttg ttcatatggt cggaggtatc gctggactct ggggtgcgct catcgaaggtccacgacttg gccggttcga taacggaggc cgtgccatcg ctcttcgtgg ccactcggcgtcacttgttg tccttggaac attcctcctc tggtttggat ggtacggatt taaccccggttccttcaaca agatcctagt cacgtacgag acaggcacat acaacggcca gtggagcgcggtcggacgga cagctgtcac aacaacgtta gctggctgca ccgcggcgct gacaaccctatttgggaaac gtctactctc gggacattgg aacgtcactg atgtatgcaa cggcctcctcggagggtttg cagccataac tggtggctgc tctgtcgttg agccatgggc tgcgatcatctgcgggttcg tggcggccct agtcctcctc ggatgcaaca agctcgctga gaagctcaaatacgacgacc ctcttgaggc agcacaacta cacggtggtt gcggtgcgtg gggactaatattcacggctc tcttcgctca agaaaagtac ttgaaccaga tttacggcaa caaacccggaaggccacacg gtttgtttat gggcggtgga ggaaaactac ttggagctca gctgattcagatcattgtga tcacgggttg ggtaagtgcg accatgggga cacttttctt catcctcaagaaaatgaaat tgttgcggat atcgtccgag gatgagatgg ccggtatgga tatgaccaggcacggtggtt ttgcttatat gtactttgat gatgatgagt ctcacaaagc cattcagcttaggagagttg agccacgatc tccttctcct tctggtgcta atactacacc tactccggtttgattt本发明还可以利用拟南芥AtPRP3基因的启动子驱动拟南芥铵转运因子基因AtAMT1；1在转基因植物中进行表达，用于提高作物对氮肥的吸收率。操作过程如下
(1)用融合基因转化微型番茄用普通YEP液体培养基培养带有AtPRP3-AtAMT1；1融合基因的农杆菌，至OD600为1.0左右离心收集菌体，然后用同体积的液体MS培养基(含100mmol/L乙酰丁香酮)重新悬浮菌体；取微型番茄无菌幼苗的叶片，在上述菌液中侵染10分钟，然后放至共培养培养基上暗培养2天；将上述外植体移至脱菌培养基上光照培养3天，移至不定芽分化培养基上培养，诱导生芽；当再生芽长至约2厘米高时转入不定根分化培养基上培养，诱导生根；将生根较好的植株移入土中，继续培养至开花结实。
(2)用融合基因转化拟南芥菜当拟南芥菜的第一根花茎抽出时，在花茎的第一片叶子上面将子花茎剪掉，4-10天后新的花茎抽出，长到2-10厘米时用于转化实验；用普通YEP液体培养基培养带有AtPRP3-AtAMT1；1融合基因的农杆菌，至OD600为1.8左右离心收集菌体，用液体的1/2MS培养基(含5％蔗糖和0.02％ Silwet L-77)重新悬浮菌体，使OD600为0.8左右；取200ml菌液放入烧杯中，将植物倒立放入菌液中浸泡10-15分钟，然后平放于磁盘中，用保鲜膜密封，暗培养一天；第二天将保鲜膜取下，将植物直立培养，直至果荚已完全变成褐色时收获种子。
有益效果将该融合基因转入植物基因组中，可获得根系过表达高亲和铵转运因子、从而能从贫瘠土地或者低氮肥施用条件下高效吸收氮肥的转基因农作物新品种，对于降低农业利植的生产成本和大量氮肥施用造成的水土污染具有重要意义。
我们利用土壤农杆菌介导的转化方法，将AtPRP3-AtAMT1；1融合基因成功转入了模式植物拟南芥和微型番茄Micro-Tom中。与野生型相比，转基因拟南芥和转基因番茄都表现出极强的抗低氮胁迫能力，转基因微型番茄还表现出衰老延缓和果实中番茄红素含量显著提高的特点。番茄红素的抗氧化能力是维生素E的100倍，对多种癌症有防治作用，素有“番茄中的黄金”之称。AtPRP3-AtAMT1；1融合基因转入其它作物，也可以获得高效吸收氮肥、减少化肥施用量和水土污染、抗土地贫瘠的转基因作物新品种。
图1带有AtPRP3-AtAMT1；1融合基因的双元载体构建流程2转基因微型番茄的融合基因PCR检测图3非转基因(A)和转基因(B)微型番茄的抗低氮胁迫能力图4转基因拟南芥菜的融合基因PCR检测图5非转基因(A)和转基因(B)拟南芥菜的抗低氮胁迫能力图6番茄果实中的番茄红素测定图7番茄叶片中单位叶面积叶绿素含量测定具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。
实施例1拟南芥根系特异性表达启动子AtPRP3启动子克隆以拟南芥基因组DNA为模板利用PCR方法扩增1733bp的AtPRP3基因启动子，回收扩增产物并进行TA克隆。
(1)PCR扩增目的片段根据GenBank已发表的拟南芥菜根系特异性表达AtPRP3基因启动子区的序列设计特异引物，在下游引物中引入BglII酶切位点。
上游引物5’-TAGAAGAGTTGTAACGCAAGCTGTG-3’下游引物5’-AGATCTACCATTGCTGAGCGCTTGGC-3’(引入BglII切点)按常规方法提取拟南芥基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备AtPRP3基因启动子片段。
PCR反应体系
PCR反应程序94℃5分钟，94℃30秒，70℃3分钟，7个循环；94℃30秒，65C 3分钟，30个循环；72℃10分钟；4℃保存。
(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定①目的片段的回收(陷阱法)制备含有两排样品槽孔的琼脂糖凝胶，制胶时平行插两排梳子，分别作为点样孔和收集孔；将PCR产物加于点样孔内，进行电泳；当目的片段电泳到收集孔的前方，并即将进入时，关闭电源，吸干收集孔内的电泳缓冲液并用新的缓冲液清洗3-4次，然后用新的缓冲液注满，重新开启电源，继续电泳；当目的片段全部进入收集孔后，停止电泳，将收集孔内的全部缓冲液吸出，转移到1.5mL离心管中；加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，混匀，-20℃放置2小时；13,000r/min离心15分钟，弃上清；沉淀用75％的乙醇洗1-2次，真空抽干，溶于6μL无菌双蒸水中。
②加A尾由于经pfu高保真聚合酶聚合得到的片段是平末端，因此，回收纯化得到的DNA片段只有在加A尾后，才能与T载体更好的连接。
加入下列反应体系的试剂，72℃反应半个小时，完成加A尾。
③连接加入下列反应体系的试剂，16℃反应过夜，实现目的片段与pGEM-T-Easy载体的连接。
④转化和阳性克隆的鉴定按常规的CaCl2诱导和转化方法，制备E.coli DH5α感受态细胞，用10μL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp、X-gal和IPTG的平板上，37℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用BglII和EcoRI双酶切，产生3kb的pGEM-T-Easy载体片段和包含AtPRP3基因启动子的1742bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生1733bp的AtPRP3基因启动子片段，即为含有AtPRP3启动子的阳性克隆。
⑤测序验证经酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交菌穿刺培养物进行DNA测序，证明与GenBank accession No.AL162651的序列完全一致。
实施例2拟南芥高亲和铵转运因子AtAMT1；1基因克隆根据GenBank已发表的拟南芥AtAMT1；1基因cDNA的序列信息(GenBank accession numberX75879)设计特异引物，在5’端分别引入BglII和BstEII酶切位点。PCR产物的大小应是1526bp。
上游引物5’-AGATCTCAACATGTCTTGCTCGGCCA-3’(引入BglII切点)下游引物5’-GGTCACCAAATCAAACCGGAGTAGGT-3’(引入BstEII切点)按常规方法提取拟南芥基因组DNA，以基因组DNA为模板，用PCR方法扩增AtAMT1；1基因，然后用pUCm-T载体进行TA克隆。PCR反应体系、反应条件、目的片段的回收、克隆和测序，同实施例1。
实施例3利用pCAMBIA1301载体构建AtPRP3-AtAMT1；1融合基因(1)从大肠杆菌中提取载体质粒pCAMBIA1301(该菌株可从其它实验室获得或从试剂公司购买，)，用EcoRI/BstEII双酶切回收大的载体片段。
(2)从实施例1所制备的TA克隆中提取质粒，用BglII/EcoRI双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳(陷阱法，同实施例1)回收AtPRP3启动子片段。
(3)从实施例2所制备的TA克隆中提取质粒，用BglII/BstEII双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收AtAMT1；1基因片段。
(4)将上述三个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA1301载体上的AtPRP3-AtAMT1；1融合基因构建(见图1)。
连接体系
(5)用连接混合物转化E.coli DH5α，挑选转化平板上的白色菌落，方法同实施例1。
(6)提取白色菌落的质粒，用BstEII和EcoRI双酶切产生两个片段，一个是8975bp的pCAMBIA1301载体片段，另一个是3256bp的AtPRP3-AtAMT1；1融合基因。
(7)以白色菌落的质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的AtPRP3-AtAMT1；1融合基因，扩增片段的大小是1608bp。所用引物如下5’-AGATCTCAACATGTCTTGCTCGGCCA-3’5’-TAATCATCGCAAGACCGGCAACA-3’(8)经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。
(9)从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌LBA4404，获得工程化农杆菌，用于植物转化。
实施例4转基因微型番茄的制备用AtPRP3-AtAMT1；1融合基因转化微型番茄的步骤如下(1)农杆菌培养从平板上挑取带有AtPRP3-AtAMT1；1融合基因的农杆菌单菌落，接种于3mL含50mg/L卡那霉素及25mg/L链霉素的普通YEP液体培养基中，28℃下振荡培养1天；取1mL菌液加至20mL新鲜液体YEP培养基中，继续振荡培养至OD600为1.0左右；将菌液转入50mL离心管中，3000r/min离心20分钟收集菌体；用同体积的液体MS培养基(含100mmol/L乙酰丁香酮，简称AS)重新悬浮菌体。
MS培养基的成分(单位mg/L)NH4NO3(硝酸铵)1 650KNO3(硝酸钾) 1 900KH2PO4(磷酸二氢钾)170MgSO4·7H2O(硫酸镁) 370CaCl2·2H2O(氯化钙) 440铁盐溶液将5.57g的FeSO4·7H2O(硫酸亚铁)和7.45g的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶于1L水中。
MnSO4·4H2O(硫酸锰) 22.3ZnSO4·7H2O(硫酸锌) 8.6H3BO3(硼酸) 6.2KI(碘化钾)0.83NaMoO4·2H2O(钼酸钠) 0.25CuSO4·5H2O(硫酸铜) 0.025CoCl2·6H2O(氯化钴) 0.025甘氨酸2盐酸硫胺素0.4盐酸吡哆素0.5烟酸 0.5肌醇 100蔗糖 30 000琼脂 10 000pH5.8(2)农杆菌介导的转化用10％安替福明消毒微型番茄种子10分钟，然后种在MS培养基上，培养无菌苗；取8天苗龄的无菌幼苗，切除子叶端部，并将每片子叶切成两块，置于已经备好的菌液中侵染10分钟；取出叶片，用无菌滤纸吸干，叶面朝下放至共培养培养基(MS+维生素B5+1mg/L吲哚乙酸+1mg/L玉米素+100mmol/L乙酰丁香酮)上，暗培养2天。
(3)植株再生和培育将上述外植体移至脱菌培养基(MS+维生素B5+1mg/L吲哚乙酸+1mg/L玉米素+400mg/L头孢霉素)上，光下培养3天；将外植体移至不定芽分化培养基(MS+1.5mg/L吲哚乙酸+1mg/L+0.1mg/L玉米素+适当浓度的潮霉素)上，每隔两周继代一次，诱导生芽；当再生芽长至约2厘米高时，将其转入不定根分化培养基(MS+0.6mg/ml吲哚丁酸+适当浓度的潮霉素)上，每隔两周继代一次，诱导生根；将生根较好的植株移入土中，继续培养至开花、结实。
(4)转基因植株的PCR检测分别剪取每棵转化植株的一个叶片，提取总DNA，以总DNA为模板，用引物5’-AGATCTCAACATGTCTTGCTCGGCCA-3’(+)5’-AAGCTGCATAGAGAAGACAAGGT-3’(-)进行PCR反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳，出现184bp的AtPRP3-AtAMT1；1融合基因条带，以野生型微型番茄的总DNA为负对照进行PCR反应，未出现融合基因条带，证明目的片段已整合到植物基因组中(见图2)。
在图2中目标带为184bp.(从左到右，泳道依次为Marker DL2000，-野生型负对照，CB03农杆菌菌裂解正对照，CB03转基因拟南芥，及3个CB03转基因品系。)(5)转基因微型番茄的抗低氮胁迫能力检测低氮水培液中培养方法含氮完全水培液为Hoagland水培液，低氮水培液中的铵根浓度是含氮完全水培液的1/40，总氮浓度是含氮完全水培液的1/80。低氮水培液中生长15天的T1代转基因苗生长正常，而相同生长条件下野生型番茄不能正常生长，叶片逐渐变黄枯萎(见图3)。
(6)转基因微型番茄的番茄红素测定高效液相色谱法测定番茄中的番茄红素1)实验材料药品仪器①样品新鲜成熟的转基因番茄果实样品及同时期的野生型果实(对照)样品，去籽去皮，迅速进行冷冻处理，粉碎，置棕色瓶中，密封，真空干燥箱中避光保存，并尽快测定。
②试剂丙酮、无水乙醇、石油醚(沸程30℃～60℃)、乙酸乙酯、三氯甲烷等均为分析纯；乙腈、甲醇为色谱纯；标准品为Sigma公司产品(纯度为90％～95％，番茄中提取)；；超纯水(大于17MΩ)。流动相溶剂都是HPLC色谱纯。
③仪器岛津10Avp高效液相色谱仪；Ultrospec 4300pro紫外分光光度计；旋转蒸发仪；TG-328型半自动电光分析天平。
2)样品制备及分析标样的配制 将1mg番茄红素标准品用流动相溶解后，定容至50ml，配制成20ug/ml的标准溶液。
样品制备 称取上述样品约100g，用捣碎机捣碎后，准确称取10μg於碘量瓶中，加0.1gBHT，用石油醚、丙酮混合液(1∶1，V/V)反复提取，无水硫酸钠脱水，用混合液定容至50mL，整个操作应避光。取上述提取液，减压蒸干或氮气吹干，用1mL甲醇溶解，经0.3μm微孔滤膜过滤后用作上机液，注入色谱分析。
色谱条件 色谱柱C18柱416mmid×250mm，5μm，岛津公司。流动相二氯甲烷∶甲醇∶乙腈(体积比0125∶1∶1)；流量016～018ml/min。检测器UV-VIS，检测波长472nm，流速110ml/min，柱温室温；进样量20μl。
(试验处理及数据测定均为3次重复，最后用平均值表示结果，数据统计与制图采用Microsoft Excel。)番茄红素的测定结果表明AtPRP3-AtAMT1；1转基因番茄果实中的番茄红素含量是相同生长条件下的野生型的1.72倍。测定结果见图6。
(7)转基因微型番茄的叶绿素测定取一定量阳性转基因苗新鲜叶及少量同一生长时期的野生番茄新鲜叶片(负对照)为材料，打孔，取一定数量打孔圆片研磨、95％乙醇浸提，定容后在665nm和649nm波长下比色(比色用752紫外可见光分光光度仪)，然后根据C(mg.L-1)＝20.31 OD649+8.04 OD665(OD为分光值)计算叶绿素浓度，最后用公式Y(mg·dm-2)＝〔浓度(mg·L-1)×提取液总量(mL)〕/〔叶面积(dm2)×100〕换算成单位叶面积叶绿素含量。
(试验处理及数据测定均为3次重复，最后用平均值表示结果，数据统计与制图采用MicrosoftExcel。)测定结果表明转基因植株的叶绿素含量是相同生长条件下的野生型的1.25倍。测定结果见图7。
实施例5转基因拟南芥的制备用AtPRP3-AtAMT1；1融合基因转化拟南芥的步骤如下
(1)植物材料的准备在转化实验的四周前将拟南芥种子种入土中，当第一根花茎抽出时，在花茎的第一片叶子上面将子花茎剪掉；4-10天后新的花茎抽出，长到2-10厘米时进行转化实验。
(2)农杆菌培养和转化从平板上挑取农杆菌单菌落，接种于3mL含50mg/L卡那霉素及25mg/L链霉素的普通YEP液体培养基中，28℃下振荡培养1天；取1mL菌液加至20ml新鲜液体YEP培养基中，继续振荡培养至OD600为1.8左右；将菌液转入50mL离心管中，3000r/min离心20分钟收集菌体；用液体1/2MS培养基(含5％蔗糖，0.05％ Silwet L-77)重新悬浮农杆菌菌体，稀释至OD600为0.8左右；取200ml菌液放入烧杯中，将植物倒立放入菌液中，使花苞浸泡1-15分钟；把植物从菌液中取出，将多余菌液擦掉，平放于磁盘中，用保鲜膜密封，暗培养一天；第二天早上将保鲜膜取下，将植物直立培养，土壤全部变干后浇水，直至果荚已完全变成褐色时收获种子。
(3)转化植株的PCR检测分别剪取转基因植株和非转基因植株的一个叶片，提取总DNA进行，用引物5’-TAGAAGAGTTGTAACGCAAGCTGTG-3’5’-AAGCTGCATA GAGAAGACAAGGT-3’进行PCR反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳，转基因植株出现1911bp的AtPRP3-AtAMT1；1融合基因条带，非转基因植株未出现融合基因条带，证明目的片段已整合到植物基因组中(见图4)。
在图4中目标带为1911bp.(泳道+为构建质粒PCR正对照；-为系统负对照；wt野生型拟南芥菜负对照；1～15为转基因拟南芥菜品系。)(4)转基因拟南芥的抗低氮胁迫能力测定转基因拟南芥在低氮胁迫条件下氮吸收能力和生长发育状况的检测转基因拟南芥抗低氮胁迫的能力都远强于野生型，野生型幼苗正常氮源培养一周后转移到1/10MS氮源培养基上，侧根发生和莲座期新叶发生都受到明显抑制，叶片背向卷曲，一般30天内陆续死亡，而大部分转基因植株能在1/10MS氮源培养基上生长60天以上。(图5)序列列表SEQUENCE LISTINGC<110>南开大学<120>高亲和铵转运因子融合基因及其在转基因植物中的应用<130>20050712<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>拟南芥<220><221>primer_bind<222>(1)..(25)<223>
<400>1tagaagagtt gtaacgcaag ctgtg 25<210>2
<211>26<212>DNA<213>拟南芥<220>
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<400>3agatctcaac atgtcttgct cggcca26<210>4<211>26<212>DNA<213>拟南芥<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(26)<223>
<400>4ggtcaccaaa tcaaaccgga gtaggt26<210>5<211>3246<212>DNA<213>拟南芥<220>
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ctatccattc aagtttaggt tgttgctttg ttctactatt aatatagctc ggccttgtga 120ttatctagtt acgtttattg ctgtgtcttt tgttcatgca tattatttca ttgctttata 180atgatacata atatcatact ttggtaatta cttagggatg tctttttgaa attattaatc 240agtcatagaa catatatatt catccaactc taatagatgg tatatgatat gaatgtttac 300cataccacac aacatacgat ggaaaaatga tgagttgatg acaggtcata tattattatg 360tatcttggca tgccatatgt tttgggctca caattatatt tcaattctta accaaattgg 420gcttcttaaa cattcaccag gcccattgac ataatcattt cgattcagtt ttcagaaggg 480tttttgactc taggatccct ttctctaaag ctcattgcca ttaacgttaa acaaaaacac 540tagaaatcaa caaaaactat ttacctaaac caaaacaatc acagtttata cagagtacaa 600aatagtgtca taaaacccaa gtaaattaga gaattgatta gggaatatat atgtaagcag 660agttactaat aaaacacctt ctgggataaa agagaagaag gtattatcag cgaaactcgc 720agctttagtt taggcctcac atgaatcaga taagtacttc atcaaactta gctgggatta 780agaaaggccc ttccatctct ctaatttctc ttctctattt gaaaacaact tttaaactat 840gaatcaaact gcgagcctta aacattctct aagcatatga gaaaacaaag acgaagaacc 900ctaattctaa gatccaacat aagaaaataa acaaaaaccg aagagaaaaa tatatcgccg 960aatatatata acaaatctcc gatcattagt caatcgccgc ttgagcttgg atttgaggca 1020aagacaaata tataggattt gcttttttca tcattagggt ttccagtttt caatgttttg 1080ggcttatatt atcgggcctt taggtttaat tggcccatta gttgaaacta tacacggatg 1140gttttcttac tttctaattg ctacaaacaa cagactaatc tgtttttaca tatttaatgg 1200
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1.高亲和铵转运因子融合基因，其特征在于，利用拟南芥根系特异性表达基因AtPRP3的启动子与高亲和铵转运因子AtAMT1；1基因构建AtPRP3-AtAMT1；1融合基因。
2.根据权利要求1所述的高亲和铵转运因子融合基因，其特征在于，所设计的拟南芥根系特异性表达基因AtPRP3的启动子的PCR扩增引物如下，其中下游引物引入Bgl II切点上游引物5’-TAGAAGAGTTGTAACGCAAGCTGTG-3’下游引物5’-AGATCTACCATTGCTGAGCGCTTGGC-3’。
3.根据权利要求1所述的高亲和铵转运因子融合基因，其特征在于，所设计的拟南芥高亲和铵转运因子AtAMT1；1基因的PCR扩增引物如下，上游引物引入Bgl II切点，下游引物引入BstE II切点上游引物5’-AGATCTCAACATGTCTTGCTCGGCCA-3’下游引物5’-GGTCACCAAATCAAACCGGAGTAGGT-3’。
4.根据权利要求1所述的高亲和铵转运因子融合基因，其特征在于，AtPRP3-AtAMT1；1融合基因的构建，具体操作步骤如下(1)以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增AtPRP3基因得启动子，回收扩增产物并进行TA克隆；(2)以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增AtAMT1；1基因，回收扩增产物并进行TA克隆；(3)分别用Bgl II/EcoR I、Bgl II/BstE II双酶切含有AtPRP3基因启动子的TA克隆质粒和含有AtAMT1；1基因的TA克隆质粒，回收AtPRP3基因启动子片段和AtAMT1；1基因片段；(4)用EcoR I/BstE II双酶切pCAMBIA1301质粒，回收大的载体片段；(5)混合上述AtPRP3基因启动子片段、AtAMT1基因片段片段和pCAMBIA1301载体片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA1301载体上的AtPRP3-AtAMT1；1融合基因的构建。
5.根据权利要求1所述的高亲和铵转运因子融合基因，其特征在于，融合基因的序列如下tagaagagtt gtaacgcaag ctgtggttgt gggtgacgat cttccttatt tcgatattggctatccattc aagtttaggt tgttgctttg ttctactatt aatatagctc ggccttgtgattatctagtt acgtttattg ctgtgtcttt tgttcatgca tattatttca ttgctttataatgatacata atatcatact ttggtaatta cttagggatg tctttttgaa attattaatcagtcatagaa catatatatt catccaactc taatagatgg tatatgatat gaatgtttaccataccacac aacatacgat ggaaaaatga tgagttgatg acaggtcata tattattatgtatcttggca tgccatatgt tttgggctca caattatatt tcaattctta accaaattgggcttcttaaa cattcaccag gcccattgac ataatcattt cgattcagtt ttcagaagggtttttgactc taggatccct ttctctaaag ctcattgcca ttaacgttaa acaaaaacactagaaatcaa caaaaactat ttacctaaac caaaacaatc acagtttata cagagtacaaaatagtgtca taaaacccaa gtaaattaga gaattgatta gggaatatat atgtaagcagagttactaat aaaacacctt ctgggataaa agagaagaag gtattatcag cgaaactcgcagctttagtt taggcctcac atgaatcaga taagtacttc atcaaactta gctgggattaagaaaggccc ttccatctct ctaatttctc ttctctattt gaaaacaact tttaaactatgaatcaaact gcgagcctta aacattctct aagcatatga gaaaacaaag acgaagaaccctaattctaa gatccaacat aagaaaataa acaaaaaccg aagagaaaaa tatatcgccgaatatatata acaaatctcc gatcattagt caatcgccgc ttgagcttgg atttgaggcaaagacaaata tataggattt gcttttttca tcattagggt ttccagtttt caatgttttgggcttatatt atcgggcctt taggtttaat tggcccatta gttgaaacta tacacggatggttttcttac tttctaattg ctacaaacaa cagactaatc tgtttttaca tatttaatggttcagatgtc atcaaagatt atctgtccaa atatttatat tataagatac attttaatatttaattatga tttagtagag cggccgatcc gttttgatat gtttagaact aaaaattgaaatatactaaa atcaaaattg gcaaacattt gaacgagtct catttatatg tcctctgaccatattattta atgggcctat cacatttccc gagcccagat aacgtctttt cagttctcctatccttttgg tcagcttgtg catggttgtt acttgttaat gatggccaac atgtttttgatcgtgcatta cacttaggta tgagaatctc aaacatacat gattatcatc aattactcacttttaagata acgtttcttt atttcatatt caaattttta ataccccaaa cattttcttataaagcccca tttggtgaaa tcgttttcct catcacaatt taaatacaaa gaacacaacaaacgaactag cttaaggcaa tatacaagcc aagcgctcag caatggtaga tctcaacatgtcttgctcgg ccaccgatct cgccgtcctg ttgggtccta atgccacggc ggcggccaactacatatgtg gccagctagg cgacgtcaac aacaaattca tcgacaccgc tttcgctatagacaacactt acctcctctt ctccgcctac cttgtcttct ctatgcagct tggcttcgctatgctctgtg ccggttccgt gagagccaag aatactatga acatcatgct taccaacgtccttgacgctg cagccggtgg tctcttctat tatctgtttg gctacgcctt tgcctttggatctccgtcca atggtttcat cggtaaacac tactttggtc tcaaagacat ccccacggcctctgctgact actccaactt tctctaccaa tgggcctttg caatcgctgc ggctggaatcacaagtggct cgatcgctga acggacacag ttcgtggctt acctaatcta ttcctctttcttaaccgggt ttgtttaccc ggtcgtctct cactggttct ggtcagttga tggatgggccagcccgttcc gtaccgatgg agatttgctt ttcagcaccg gagcgataga tttcgctgggtccggtgttg ttcatatggt cggaggtatc gctggactct ggggtgcgct catcgaaggtccacgacttg gccggttcga taacggaggc cgtgccatcg ctcttcgtgg ccactcggcgtcacttgttg tccttggaac attcctcctc tggtttggat ggtacggatt taaccccggttccttcaaca agatcctagt cacgtacgag acaggcacat acaacggcca gtggagcgcggtcggacgga cagctgtcac aacaacgtta gctggctgca ccgcggcgct gacaaccctatttgggaaac gtctactctc gggacattgg aacgtcactg atgtatgcaa cggcctcctcggagggtttg cagccataac tggtggctgc tctgtcgttg agccatgggc tgcgatcatctgcgggttcg tggcggccct agtcctcctc ggatgcaaca agctcgctga gaagctcaaatacgacgacc ctcttgaggc agcacaacta cacggtggtt gcggtgcgtg gggactaatattcacggctc tcttcgctca agaaaagtac ttgaaccaga tttacggcaa caaacccggaaggccacacg gtttgtttat gggcggtgga ggaaaactac ttggagctca gctgattcagatcattgtga tcacgggttg ggtaagtgcg accatgggga cacttttctt catcctcaagaaaatgaaat tgttgcggat atcgtccgag gatgagatgg ccggtatgga tatgaccaggcacggtggtt ttgcttatat gtactttgat gatgatgagt ctcacaaagc cattcagcttaggagagttg agccacgatc tccttctcct tctggtgcta atactacacc tactccggtttgattt
6.高亲和铵转运因子融合基因的应用，其特征在于，利用AtPRP3-AtAMT1；1融合基因转化微型番茄和拟南芥，获得抗低氮胁迫能力的转基因微型番茄和拟南芥。
7.根据权利要求6所述的高亲和铵转运因子融合基因的应用，其特征在于，用AtPRP3-AtAMT1；1融合基因转化任何植物而获得具有抗低氮胁迫能力的转基因新品种。
全文摘要
高亲和铵转运因子融合基因及其在转基因植物中的应用，属于植物基因工程领域。本发明利用拟南芥根系特异性表达基因AtPRP3的启动子和高亲和氨转运因子基因AtAMT1；1，构建了融合基因AtPRP3－AtAMT1；1，并成功地将融合基因转入模式植物拟南芥和微型番茄中，使转基因拟南芥和番茄表现出极强的抗低氮胁迫能力。该融合基因的转入可以提高转基因植物对氮肥的吸收率，减少化肥施用量和污染，降低生产成本，保护环境。此外，转基因番茄还表现衰老延缓、叶绿素和果实中番茄红素含量显著提高的特点，而番茄红素具有强抗氧化能力和多种癌症的防治功能。该融合基因也能转入其它作物，获得高效吸收氮肥和抗土地贫瘠的转基因新品种。
文档编号C12N15/66GK1737148SQ20051001454
公开日2006年2月22日 申请日期2005年7月15日 优先权日2005年7月15日
发明者王宁宁, 张茹, 林景瑜, 李鹏丽, 李晔, 崔孟祥 申请人:南开大学