专利名称：抗白色念株菌感染的反义寡核苷酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于反义寡核苷酸技术领域，更具体属于一种以白色念珠菌I型核酶核心假结为靶标的反义寡核苷酸的序列，同时涉及到该反义寡核苷酸在治疗白色念珠菌感染中的应用。
背景技术：
真菌感染，尤其是机遇型真菌感染是最近这二十多年在北美和欧洲一些发达国家引起了严重的临床问题。机遇型真菌感染的流行是随着AIDS，癌症及器官移植等的急速增加而来的。AIDS病人本身免疫系统崩溃，癌症化疗和进行器官移植均会引起病人免疫力的急剧下降。白色念珠菌和卡氏肺囊虫这类机遇型真菌是在病人免疫力低下时才引起难以治疗的严重感染(Andriole VT 1999 The 1998 Garrod lecture.Current and future antifungal therapynew targets for antifungal agents.J AntimicrobChemother 44151-162.；Watson J 2002 Pneumocystis cariniiwhere are we now？JHIV Ther 78-12.；Wolff AJ，O′Donnell AE 2003 HIV-related pulmonary infectionsareview of the recent literature.Curr Opin Pulm Med 9210-214；de Repentigny L 2004Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions.Curr OpinMicrobiol 7324-329.)。真菌感染治疗的困难主要是因为人和动物都是真核生物，所以有效的治疗靶标少，有效的药物也非常缺乏。中国目前在临床上使用的抗真菌药物主要是西方通用的吡咯类药物。现有的药物均有副作用强的特点，使真菌感染的治疗更加困难。
研究发现白色念珠菌26s前体rRNA中含有一个I型内含子核酶，此核酶的有效剪切是该病原菌存活的必要条件(Edman JC，Kovacs JA，Masur H，Santi DV，Elwood HJ，Sogin ML 1988 Ribosomal RNA sequence shows Pneumocystis carinii to bea member of the fungi.Nature 334519-522.；Mercure S，Montplaisir S，Lemay G 1993Correlation between the presence of a self-splicing intron in the 25S rDNA of C.albicansand strains susceptibility to 5-fluorocytosine.Nucleic Acids Res 216020-6027.；Liu Y，Leibowitz MJ 1993 Variation and in vitro splicing of group I introns in rRNA genes ofPneumocystis carinii.Nucleic Acids Res 212415-2421.)。因为人和动物体内没有I型内含子核酶，所以此核酶就可以成为杀灭白色念珠菌的有效靶基因。国际上最初用抗生素来进行抗真菌的研究，因为大家发现抗生素能够在体外抑制I型内含子核酶的自我剪切，但是当抗生素进入细胞以后却发现它不仅能够抑制I型内含子核酶的自我剪切，而且能够结合到细菌的核糖体上从而抑制细菌的翻译以及线粒体的翻译过程并导致细菌的蛋白质合成受阻(Waldsich C，Semrad K，Schroeder R 1998.Neomycin B inhibits splicing of the td intron indirectly by interfering with translation andenhances missplicing in vivo.RNA 41653-1663.)。后来人们又发现Pentamidine(戊烷脒)也能够在体外抑制I型内含子核酶的自我剪切，但是体内的检测实验却发现它既能抑制体内内含子核酶的自我剪切又能抑制线粒体的翻译(Miletti KE，Leibowitz MJ 2000 Pentamidine inhibition of group I intron splicing in Candida albicanscorrelates with growth inhibition.Antimicrob Agents Chemother 44958-966.；Zhang Y，Bell A，Perlman PS，Leibowitz MJ 2000 Pentamidine inhibits mitochondrial intronsplicing and translation in Saccharomyces cerevisiae.RNA 6931-951.)。虽然抗生素和Pentamidine都能够抑制I型内含子核酶的自我剪切，但是由于它们在体内作用位点的不专一性会导致真菌感染治疗中的较强的副作用。
自20世纪90年代以来，人们主要以四膜虫I型内含子核酶作为模型在体外研究RNA的折叠问题并取得了令人瞩目的成就(Cech TR 1990 Self-splicing of group Iintrons.Annu Rev Biochem 59543-568.)。研究表明四膜虫核酶在体外折叠非常缓慢，其中核心假结的折叠需要几分钟甚至几个小时才能完成。所以申请人以白色念珠菌I型内含子的P3-P7核心假结为分子靶标来设计核酶剪切的反义寡核苷酸抑制剂。Gel-shift实验与RNase H footprinting(Zhang L，Xiao M，Lu C，Zhang Y 2005 Fastformation of the P3-P7 pseudoknota strategy for efficient folding of the catalyticallyactive ribozyme.RNA 1159-69.)实验都表明反义寡核苷酸确实结合到核酶的正确位点。同时我们发现在转录环境中反义寡核苷酸能够强烈抑制核酶的自我剪切。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种以白色念珠菌核酶核心假结为靶标的反义寡核苷酸的序列，该序列能抑制白色念珠菌生长，即通过以白色念珠菌I型核酶核心假结为靶标设计反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸不仅能够在体外强烈抑制白色念珠菌I型核酶的自我剪切，而且在白色念珠菌体内也能够专一地抑制核酶的自我剪切并引起细胞的死亡。
本发明的另一个目的在于该反义寡核苷酸序列在治疗白色念珠菌感染治疗中的应用。
本发明再一个目的在于反义寡核苷酸序列的衍生物在治疗白色念珠菌感染中的应用。
自20世纪90年代以来，人们主要以四膜虫I型内含子核酶作为模型在体外研究RNA的折叠问题并取得了令人瞩目的成就(Cech TR 1990.Self-splicing of group Iintrons.Annu Rev Biochem 59543-568.)。研究表明四膜虫核酶在体外折叠非常缓慢，其中核心假结的折叠需要几分钟甚至几个小时才能完成。所以本发明另辟蹊径，决定从反义寡核苷酸技术着手寻找治疗真菌感染的新途径，即以白色念珠菌I型内含子的P3-P7核心假结为分子靶标来设计核酶剪切的反义寡核苷酸抑制剂。申请人知道转录环境与体内环境比较类似，既然白色念珠菌核酶P3-P7假结在转录中折叠很慢，所以体内核心假结有可能同样折叠很慢，可以用作抗真菌的分子靶标。申请人将体外筛选的反义寡核苷酸加入到培养基中检测其对白色念珠菌生长的抑制，平板计数法以及RT-PCR检测都表明反义寡核苷酸确实能抑制体内核酶的剪切并引起白色念珠菌生长的抑制。然后申请人用流式细胞仪检测到由反义寡核苷酸引起的白色念珠菌的死亡，而且在共聚焦荧光显微镜下观察到白色念珠菌对反义寡核苷酸的吸收。本发明介绍了一种以白色念珠菌的核心假结为靶标的反义寡核苷酸的筛选方法及其在抗白色念珠菌中的应用，结果表明与抗生素以及Pentamidine相比，本发明中的筛选出来的反义寡核苷酸不仅在体外强烈抑制白色念珠菌I型内含子核酶的自我剪切，而且在白色念珠菌体内专一地，高效地抑制该I型内含子核酶的自我剪切并引起细胞的死亡，从而极具潜力成为抗白色念珠菌感染的新药。
反义寡核苷酸技术是目前国际上比较成熟的技术，本发明通过以白色念珠菌(由Michael J.Leibowitz实验室赠送，编号分别为4-1，1016，1013，1012，1024，221，1002，1001，62-1，1004，1005；Liu Y，Leibowitz MJ 1993.Variation and in vitro splicingof group I introns in rRNA genes of Pneumocystis carinii.Nucleic Acids Res 212415-2421.；其中含有内含子的菌株编号为4-1，1016，1013，1012，1024，221，1002，1001；不含有内含子的菌株编号为62-1，1004，1005)I型核酶核心假结为靶标设计反义寡核苷酸来抑制白色念珠菌I型核酶的自我剪切从而抑制其生长。为了实现上述任务，本发明采用以下技术方案反义寡核苷酸体外筛选最佳靶标区域内含子主要分为I型，II型以及剪切体三种类型(Cech TR 1990.Self-splicing ofgroup Iintrons.Annu Rev Biochem 59543-568.)，这三类内含子的区别主要是它们的剪切方式不同。I型内含子是一类具有催化活性的大RNA分子，它们可以独立催化自身的切除和外显子的连接。这一反应在仅有RNA，金属离子和外源GTP存在的条件下即可发生，导致准确的内含子切割释放和外显子的连接(Cech TR 1990.Self-splicing of group I introns.Annu Rev Biochem 59543-568.)。在I型内含子催化的自剪接反应中，内含子核心处一个配对区P7上的一个未配对碱基及附近的若干碱基对形成了催化的活性部位。它们具有结合外源鸟苷的能力，而此外源鸟苷则引发I型内含子的两步连续核酸链切割一连接反应。在第一步，外源鸟苷的3’羟基(或它的5’磷酸取代物GMP，GDP或GTP)攻击5’剪切位点的磷原子，并与内含子5’的第一个核苷酸形成3’-5’磷酸二酯键，而在第二步中，5’外显子的3’羟基攻击3’剪切位点的磷原子，导致内含子的释放和外显子的连接。过去的研究表明I型内含子具有高度有序的二级结构及空间结构，而这些结构的形成则需要复杂的折叠途径。白色念珠菌26S rRNA基因中的内含子核酶属于I型内含子，具有379个碱基。有同行曾经用高通量筛选的方法在中科院北京药物所的药物库里面筛选对白色念珠菌26S rRNA基因中的I型内含子核酶有抑制作用的药物。本发明另辟蹊径根据白色念珠菌I型内含子核酶的碱基序列特征设计了与白色念珠菌I型核酶序列互补配对的，同时具有相同Tm(退火温度)值并且覆盖整个I型核酶区域的一组反义寡核苷酸(20个核苷酸左右)。在该I型核酶体外转录过程中，6mM镁离子以及游离的GTP的存在会导致转录出来的I型核酶的自我剪切。所以本发明设计在体外转录过程中筛选对核酶自我剪切有最佳抑制活性的反义寡核苷酸。实验结果表明以白色念珠菌I型核酶的核心假结为靶标的反义寡核苷酸239-260R，239-262R，242-260R，242-262R以及反义寡核苷酸1-26R对核酶自我剪切具有最好的抑制活性。但由于反义寡核苷酸1-26R与白色念珠菌I型核酶的5’外显子有6个核苷酸的同源性(见附图1)，这有可能会导致在未来的抗白色念珠菌感染治疗中引起副作用，所以本发明只选择了白色念珠菌I型核酶的核心假结区域做进一步的抗白色念珠菌感染的研究。
通过确认核心假结区域影响核酶活性的重要位点来筛选最佳的反义寡核苷酸反义寡核苷酸的体外筛选已经证明了白色念珠菌I型核酶的核心假结是潜在的抗真菌感染的靶标区域，为了得到抑制效果更好的反义寡核苷酸本发明于是进一步确认该靶标区域对核酶活性非常重要的核苷酸位点。具体方案如下本发明先固定白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域的G235位点，然后以G235→3’末端的方向设计长度一个一个缩短的反义寡核苷酸；同样地申请人固定核心假结区域的G262位点，然后以G262→5’末端的方向设计长度一个一个缩短的反义寡核苷酸(见附图1和实施例2)。所有设计的反义寡核苷酸的长度都在12-27个核苷酸之间。申请人接下来检测所有的反义寡核苷酸对白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的转录中自剪切反应的抑制效率。然后申请人分别通过8M的5％的PAGE胶来分离剪切产物并且使用scanner Typhoon 9200(Amersham Pharmacia生物技术公司)来定量分析反义寡核苷酸抑制该核酶自剪切的比例。本发明进一步使用GraphPad Prism4软件(www.graphpad.com)来计算每个反义寡核苷酸对核酶自剪切抑制的效率并给出抑制的EC50值。通过所有的EC50对比分析发现核酶的核心假结区域的几个核苷酸位点以及P3区域的所有核苷酸位点对核酶的活性都是非常重要的(见附图1)。本发明根据该实验筛选出来的对白色念珠菌I型核酶活性非常重要的核苷酸位点设计反义寡核苷酸序列240-261R(SEQ ID NO1，5’-CATACCTTTCCGTGCTCTACGA-3’)做下游的抗白色念珠菌感染的研究。同时申请人设计的反义寡核苷酸序列240-261R(SEQ ID NO1，5’-CATACCTTTCCGTGCTCTACGA-3’)的几个衍生物235-265R(SEQ ID NO2，5’-AGC CCA TAC CTT TCC GTG CTC TAC GAC GGC C-3’，与SEQ ID NO1有71.0％的同源性。)，235-262R(SEQ ID NO3，5’-CCA TAC CTT TCC GTG CTC TAC GACGGC C-3’，与SEQ ID NO1有78.6％的同源性。)，240-262R(SEQ ID NO4，5’-CCA TAC CTT TCC GTG CTC TAC GA-3’，与SEQ ID NO1有95.7％的同源性。)，243-262R(SEQ ID NO5，5’-CCATAC CTT TCC GTG CTC TA-3’，与SEQ ID NO1有82.6％的同源性。)，245-262R(SEQ ID NO6，5’-CCA TAC CTT TCC GTG CTC-3’，与SEQ ID NO1有73.9％的同源性。)，248-262R(SEQ ID NO7，5’-CCA TAC CTTTCC GTG-3’，与SEQ ID NO1有60.9％的同源性。)，255-265R(SEQ ID NO8，5’-AGC CCA TAC CT-3’，与SEQ ID NO1有26.9％的同源性。)在转录环境中强烈抑制白色念珠菌I型核酶的自我剪切(见具体操作方式附表1)。所以根据实验结果申请人得到一种分离的反义寡核苷酸序列SEQ ID NO1以及SEQ ID NO1的衍生物。因为反义寡核苷酸序列240-261R(SEQ ID NO1，5’-CATACCTTTCCGTGCTCTACGA-3’)和它的几个衍生物都是通过靶定白色念珠菌I型核酶的核心假结而抑制该核酶的自剪切的活性，所以反义寡核苷酸序列SEQ IDNO1和它的几个衍生物都具有相类似的治疗白色念珠菌感染的功能。以下本发明重点展示SEQ ID NO1在抗白色念珠菌感染中的应用。
共聚焦荧光显微镜观察白色念珠菌对反义寡核苷酸(SEQ ID NO1)的吸收前面已经阐明了在转录条件下靶定白色念珠菌I型核酶的核心假结的反义寡核苷酸引起该核酶强烈的自剪切抑制。接下来的实验是验证这些寡核苷酸在白色念珠菌体内是否能够抑制该核酶的自我剪切。但是如何将这些靶定白色念珠菌I型核酶的核心假结的反义寡核苷酸导入到白色念珠菌体内是一个关键的问题。研究表明白色念珠菌是一个优良的运输反义寡核苷酸的系统，它能够富集反义寡核苷酸到白色念珠菌体内使体内的反义寡核苷酸的浓度达到体外的10倍。而且在12小时之内反义寡核苷酸在白色念珠菌体内非常稳定存在(Disney MD，HaidarisCG，Turner DH 2003.Uptake and antifungal activity of oligonucleotides in Candidaalbicans.Proc Natl Acad Sci USA 1001530-1534.)。本发明用5’端标记绿色荧光素的反义寡核苷酸处理4-1(含有内含子)和62-1(不含内含子)菌，具体过程是将隔夜30℃生长在YPD培养基中的白色念珠菌稀释到YNB培养基使其起始的OD值为0.1，然后再加入25微摩尔末端标记了FITC的反义寡核苷酸242-260R于30℃生长8小时，最后，细胞被固定在载波片并盖上盖玻片在共聚焦荧光显微镜(Olympus，Japan)下观察5’端标记绿色荧光素的反义寡核苷酸在4-1和62-1菌细胞里面的定位。共聚焦荧光显微镜观察结果表明5’端标记绿色荧光素的反义寡核苷酸(SEQ ID NO1)充满整个细胞。同时用DAPI染料染4-1和62-1菌的核DNA以显示核的位置。因为大家知道前体核糖体RNA的自我剪切发生在细胞核内。实验结果表明5’端标记绿色荧光素的反义寡核苷酸不仅能够进入细胞而且能够进入到细胞核。所以说这个实验不仅证明了白色念珠菌能够有效地吸收外源的反义寡核苷酸，而且也说明了用反义寡核苷酸作为白色念珠菌体内I型核酶的自我剪切的抑制剂是可行的。
反义寡核苷酸(SEQ ID NO1)体内对白色念珠菌I型核酶自我剪切的抑制实验结果已经表明体外筛选出来的反义寡核苷酸能够在体外转录过程中抑制白色念珠菌I型核酶的自我剪切，因为转录过程同体内环境是类似的，另外本发明又发现白色念珠菌能够有效地吸收外源的反义寡核苷酸，而且在白色念珠菌的核里面也发现有反义寡核苷酸的富集。因为白色念珠菌的前体rRNA的自我剪切发生在细胞核里面，所以申请人想在体内检测反义寡核苷酸对白色念珠菌I型核酶自我剪切的抑制。实验中用到了两种白色念珠菌4-1和62-1。4-1含有I型核酶而62-1不含有I型核酶。申请人用根据体外筛选核心假结区域对白色念珠菌I型核酶自我剪切活性非常重要的核苷酸活性位点设计化学修饰的反义寡核苷酸240-261R(SEQ IDNO1，也是靶定白色念珠菌26S rRNA中I型核酶的核心假结，所有对该核酶活性非常重要的核心假结处的核苷酸位点均被包括)处理4-1和62-1菌，然后提这两种白色念珠菌的总RNA做RT-PCR实验检测它们的前体核糖体RNA的积累水平。相对于没有经过反义寡核苷酸240-261R处理的菌来说，反义寡核苷酸240-261R处理4-1菌的前体核糖体RNA的积累水平很高，说明反义寡核苷酸在体内确实能够抑制白色念珠菌I型核酶的自我剪切，从而造成了该核酶前体RNA的积累。但是对于62-1菌来说，因为它并没有内含子的存在，所以并没有观察到白色念珠菌前体RNA的水平的任何改变。同时本发明设计了一个对照反义寡核苷酸299-320R，这个反义寡核苷酸在白色念珠菌I型核酶的体外转录实验中结合在核酶的非核心假结区域而且不影响该核酶的自剪切活性，白色念珠菌I型核酶的体内自剪切抑制实验也表明这个反义寡核苷酸不抑制该核酶的自剪切反应。综合考虑这几个实验结果，本发明清楚地表明反义寡核苷酸240-261R在体内专一，高效地作用在白色念珠菌I型核酶上并抑制了核酶的自我剪切的活性。
平板生长法检测反义寡核苷酸(SEQ ID NO1)对白色念珠菌生长的抑制白色念珠菌26s前体rRNA中含有一个I型内含子核酶，此核酶的有效剪切是该病原菌存活的必要条件。本发明已经检测到在体内反义寡核苷酸化学修饰的240-261R(SEQ ID NO1)能够抑制白色念珠菌I型核酶的自我剪切，所以接下来本发明设计实验检测240-261R(SEQ ID NO1)是否能够抑制白色念珠菌的生长。本发明将白色念珠菌(包括4-1和62-1菌)于30℃生长在液体YNB培养基(pH 3)中，起始的OD540值为0.01。当菌液的OD540值达到1的时候，取菌液分别稀释5倍，20倍和100倍到新鲜的YNB液体培养基中并加入相应的反义寡核苷酸(包括2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸和没有化学修饰的反义寡核苷酸)。然后这些稀释的菌液取3.5微升点到YPD平板上于37℃隔夜生长。隔夜观察结果表明25微摩尔没有化学修饰的反义寡核苷酸240-261R显著地抑制了含有内含子的白色念珠菌4-1菌株的生长，但是对于没有内含子的白色念珠菌62-1菌株则没有任何抑制现象(即使经过25微摩尔2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸240-261R处理)。同时申请人发现与核酶没有关系的反义寡核苷酸299-320R也没有任何抑制发生。与此同时，5微摩尔2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸240-261R能够产生与25微摩尔没有化学修饰的反义寡核苷酸240-261R同样的抑制效果，申请人也发现25微摩尔2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸240-261R显著加强了抑制白色念珠菌生长的效果。因此我们可以得出结论靶定白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸能够在白色念珠菌体内外抑制核酶的自我剪切，从而导致了对含有内含子的白色念珠菌的生长的抑制。
流式细胞仪检测反义寡核苷酸(SEQ ID NO1)引起的白色念珠菌的死亡。
本发明已经确定了靶定白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸能够在白色念珠菌体内外抑制核酶的自我剪切，并且导致了对含有内含子的白色念珠菌的生长的抑制。紧接着申请人想确定该反义寡核苷酸是否能够引起含有内含子的白色念珠菌的死亡。
本发明将体外筛选的240-261R的5’端标记绿色荧光素，然后处理4-1和62-1菌8小时，接下来用碘化丙锭染色4-1和62-1菌。简短地说来，死亡的细胞能够被溴化丙锭染色，但是活的细胞不能够被碘化丙锭染色(Bai F，Xi JH，Wawrousek EF，Fleming TP，Andley UP 2003.Hyperproliferation and p53 Status ofLens Epithelial Cells Derived from αB-crystallin Knockout Mice.J Biol Chem 27836876-36886.；Wysocki R，Kron SJ 2004.Yeast cell death during DNA damage arrest isindependent of caspase or reactive oxygen species.J Cell Biol 166311-316.)。见附图8，象限I和象限II里面的细胞表示吸收了FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R的细胞；象限II和象限III里面的细胞表示死亡的细胞；从象限III像象限II转移的细胞表示因吸收了FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R而死亡的细胞。FITC和碘化丙锭的荧光信号通过FACScan flow cytometer(Beckman Coulter)检测，通过EXPO32ADC software来分析。FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R引起的细胞死亡率的计算公式是死亡率＝象限II/(象限I+象限II)。数据通过GraphPad Prism 4.0program(www.graphpad.com)作图。
通过流式细胞仪就可以检测到进入细胞的反义寡核苷酸发出的绿色荧光和其引起细胞死亡而发出的红色荧光，从而计算反义寡核苷酸引起的细胞死亡的比例。流式细胞仪结果显示240-261R诱发具有I型核酶的4-1菌的死亡的比率高达50％，相对于不含有内含子核酶的62-1菌来说，240-261R诱发62-1菌株的死亡的比率仅仅达到4％(背景水平)。本实验结果清楚地表明反义寡核苷酸240-261R在体内专一，高效地作用在白色念珠菌I型核酶上并抑制了核酶的自我剪切的活性，最终引起了含有内含子核酶的白色念珠菌4-1的死亡。
反义寡核苷酸(SEQ ID NO1)作为抗真菌感染潜在药物的普遍实用性前面的实验结果表明了反义寡核苷酸能够在体内外抑制白色念珠菌I型核酶的自我剪切从而引起细胞的死亡。因此说反义寡核苷酸可以作为抗真菌感染潜在的药物。为了了解反义寡核苷酸240-261R对所有含有内含子核酶的白色念珠菌有广谱性的致死效应，下面本发明验证了反义寡核苷酸240-261R对于另外11种白色念珠菌临床菌株的致死效果。其中8株菌(4-1，1016，1013，1012，1024，221，1002，1001)存在I型核酶；3株(62-1，1004，1005)不存在I型核酶。实验结果表明反义寡核苷酸对大部分存在I型核酶的白色念珠菌都有较好的抑制率(30％-50％)；而对于3株不存在I型核酶的白色念珠菌没有好的抑制率(大约4％)。表明了反义寡核苷酸240-261R在体内专一，高效地作用在白色念珠菌I型核酶上并抑制了核酶的自我剪切的活性，最终引起了含有内含子核酶的白色念珠菌4-1的死亡，而且表明了靶定白色念珠菌26S rRNA基因中的I型内含子核酶的核心假结的反义寡核苷酸普遍实用于含有I型核酶的白色念珠菌抗感染治疗。与此同时，申请人设计合成的反义寡核苷酸SEQ ID NO1的几个衍生物235-265R(SEQ ID NO2，5’-AGC CCA TACCTT TCC GTG CTC TAC GAC GGC C-3’，与SEQ ID NO1有71.0％的同源性。)，235-262R(SEQ ID NO3，5’-CCA TAC CTT TCC GTG CTC TAC GAC GGC C-3’，与SEQ ID NO1有78.6％的同源性。)，240-262R(SEQ ID NO4，5’-CCA TAC CTT TCC GTG CTCTACGA-3’，与SEQ ID NO1有95.7％的同源性。)，243-262R(SEQ ID NO5，5’-CCATAC CTT TCC GTG CTC TA-3’，与SEQ ID NO1有82.6％的同源性。)，245-262R(SEQID NO6，5’-CCA TAC CTT TCC GTG CTC-3’，与SEQ ID NO1有73.9％的同源性。)，248-262R(SEQ ID NO7，5’-CCA TAC CTT TCC GTG-3’，与SEQ ID NO1有60.9％的同源性。)，255-265R(SEQ ID NO8，5’-AGC CCA TAC CT-3’，与SEQ ID NO1有26.9％的同源性。)和反义寡核苷酸SEQ ID NO1都是通过靶定白色念珠菌I型核酶的核心假结而抑制该核酶的自剪切的活性，所以反义寡核苷酸序列SEQ ID NO1和它的几个衍生物都具有相类似的治疗白色念珠菌感染的功能。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果目前现有的治疗真菌感染的药物主要是化学类药物如吡咯类药物，其毒副作用较强。还有的化学类药物如Pentamidine，它的作用靶标非常广泛。白色念珠菌26s前体rRNA中含有一个I型内含子核酶，本发明发现此核酶的有效剪切是该病原菌存活的必要条件。因为人和动物体内没有I型内含子核酶，所以此核酶就可以成为杀灭白色念珠菌的有效靶基因。本发明中针对白色念珠菌I型内含子核酶核心假结区域设计的反义寡核苷酸能够在体内外专一，高效地作用在I型内含子核酶上并引起细胞的死亡。相对于化学类药物来说，反义寡核苷酸药物能够高效地引起白色念珠菌的死亡，而且反义寡核苷酸药物专一性非常高，它只作用于白色念珠菌的26S rRNA上的I型核酶，对人无任何毒副作用。因此该反义寡核苷酸非常有潜力成为新型的抗真菌感染的药物。
图1为白色念珠菌I型核酶的二级结构图。
在I型内含子被发现以后，随着越来越多的I型内含子被测序，序列比对分析已经揭示这些RNA分子一些共有的二级结构特征。早期的研究已经表明，在多数I型内含子的二级结构中，有9个配对区是保守的，它们分别被命名为P1-P9(Burke，J.M.，Belfort，M.，Cech，T.R.，Davies，R.W.，Schweyen，R.J.，Shub，D.A.，Szostak，J.W.and Tabak，H.F.1987.Structural conventions for group I introns.NucleicAcids Res.，15，7217-7221)。P1环区与3’外显子所形成的P10也在多数I型内含子中被发现(Cech TR 1990.Self-splicing of group I introns.Annu Rev Biochem 59543-568.)。它们组成了I型内含子的基本框架。其中，P1，P10与P2是底物结构域，它们携带着内含子5’与3’末端的剪接位点；P4，P5，P6组成一个结构域，它与由P3，P7，P8，P9组成的另一个结构域一同构成了I型内含子的催化部分，二者之间形成的间隙则正好来容纳底物。在催化结构域中，P3与P7是两个远程配对。它们形成了一个拓扑学上称之为假结的结构。其中的P7在整个I型内含子的催化中起着至关重要的作用，它的5’配对区第二碱基为一未配对突起，与临近的碱基对一同构成了一个可以结合鸟苷的结构，晶体结构显示，这是I型内含子进行催化活动的中心(Golden，B.L.，Gooding，A.R.，Podell，E.R.，and Cech，T.R.1998.A preorganized activesite in the crystal structure of the Tetrahymena ribozyme.Science，282，259-264)。在该白色念珠菌I型核酶二级结构图中，本发明根据白色念珠菌I型核酶的序列特征设计了一系列覆盖整个内含子序列的反义寡核苷酸，每条反义寡核苷酸的长度20个核苷酸左右，并且具有同等的Tm(退火温度)值。染成淡蓝色的核苷酸表示反义寡核苷酸结合的起始位点，染成绿色的核苷酸表示结合的结束位点。橙色核苷酸表示白色念珠菌I型核酶的核心假结区域对该核酶活性非常重要的位点。
图2为体外转录过程中反义寡核苷酸对白色念珠菌I型核酶的自我剪切的抑制图。
本发明根据白色念珠菌I型核酶的序列特征设计了一系列覆盖整个内含子序列的反义寡核苷酸(见图1，淡蓝色表示反义寡核苷酸结合的起始位点，绿色表示结合的结束位点)，每条反义寡核苷酸的长度20个核苷酸左右，并且具有同等的Tm(退火温度)值。在该I型核酶体外转录过程中，6mM镁离子以及游离的GTP的存在会导致转录出来的I型核酶的自我剪切。所以本发明加入设计合成的反义寡核苷酸以检测它们对转录中I型核酶自我剪切的抑制。结果显示针对白色念珠菌I型核酶核心假结区域设计的反义寡核苷酸239-260R，239-262R，242-260R，242-262R以及与P1区域结合的反义寡核苷酸1-26R均有很好的抑制效果。
图3为体外转录过程中RNase H检测反义寡核苷酸与白色念珠菌I型核酶的结合图。
在自剪切反应进行一小时以后加入RNase H(一种能切DNA与RNA杂交链的RNA酶)，结果显示所有的反义寡核苷酸都结合在正确的位置而且四个靶定白色念珠菌26S rRNA中的I型核酶核心假结区域的反义寡核苷酸239-260R，239-262R，242-260R，242-262R结合最为紧密。这个结果也直接证明了靶定白色念珠菌26S rRNA中的I型核酶核心假结区域的反义寡核苷酸具有最好的抑制该核酶的自我剪切的效果。
图4为反义寡核苷酸对核酶自剪切反应的抑制以及与核酶结合效率的定量分析图。
定量分析的结果表明靶定白色念珠菌26S rRNA中的I型核酶核心假结区域的反义寡核苷酸239-260R，239-262R，242-260R，242-262R具有最好的抑制该核酶的自我剪切的效果，同时RNase H实验也证明这些反义寡核苷酸与该I型核酶结合最为牢固。
图5为共聚焦荧光显微镜观察白色念珠菌对反义寡核苷酸的吸收图。
本发明用5’端标记绿色荧光素的反义寡核苷酸处理4-1(含有内含子)和62-1(不含内含子)菌，具体过程是将隔夜30℃生长在YPD培养基中的白色念珠菌稀释到YNB培养基使其起始的OD值为0.1，然后再加入25微摩尔末端标记了FITC的反义寡核苷酸240-261R(SEQ ID NO1)于30℃生长8小时，最后，细胞被固定在载波片并盖上盖玻片在共聚焦荧光显微镜(Olympus，Japan)下观察5’端标记绿色荧光素的反义寡核苷酸在4-1和62-1菌细胞里面的定位。共聚焦荧光显微镜观察结果表明5’端标记绿色荧光素的反义寡核苷酸(SEQ ID NO1)充满整个细胞。同时用DAPI染料染4-1和62-1菌的核DNA以显示核的位置。因为大家知道前体核糖体RNA的自我剪切发生在细胞核内。实验结果表明5’端标记绿色荧光素的反义寡核苷酸不仅能够进入细胞而且能够进入到细胞核。
图6为反义寡核苷酸体内对白色念珠菌I型核酶自我剪切的抑制图。
4-1菌含有I型内含子而62-1菌不含有。本发明用体外筛选的靶定白色念珠菌I型核酶的核心假结的反义寡核苷酸(终浓度25μM)处理4-1和62-1菌8小时，然后处理细胞提取细胞总RNA做RT-PCR检测白色念珠菌前体rRNA的积累水平，同对照相比，如果白色念珠菌前体rRNA的水平升高，则表明该反义寡核苷酸抑制白色念珠菌I型核酶的自我剪切。同时本发明设计了一个对照反义寡核苷酸299-320R，它的结合位置在白色念珠菌I型核酶的非核心假结区域，而且在体外转录中对白色念珠菌I型核酶自我剪切没有抑制。如图所示，在4-1菌中靶定白色念珠菌I型内含子核酶的核心假结的240-261R能抑制白色念珠菌I型核酶自我剪切从而造成前体核糖体RNA的积累。而299-320R以及对照没有观察到这种现象。因为4-1菌株含有内含子，所以这个结果说明了反义寡核苷酸240-261R确实作用在白色念珠菌I型核酶上并且抑制了该核酶的自我剪切，从而造成了前体RNA的积累。另外一方面，62-1菌株不含有内含子，结果显示在62-1菌中无论是哪个反义寡核苷酸都不能观察到前体核糖体RNA水平的变化。本发明设计了PGK(3-phosphoglyceratekinase三磷酸甘油酸激酶)基因的mRNA作为PCR反应的内参。这些实验清楚地说明了反义寡核苷酸在体内专一性地作用在I型核酶上并抑制了核酶的自我剪切的活性。同时我们观察到500纳摩尔的化学修饰的反义寡核苷酸240-261R与2微摩尔的没有化学修饰的反义寡核苷酸240-261R对白色念珠菌I型核酶的抑制效果等同，说明了反义寡核苷酸240-261R经过化学修饰以后具有更高的抑制效率。
图7为平板生长法检测反义寡核苷酸对白色念珠菌生长的抑制图。
本发明用不同的反义寡核苷酸(终浓度25μM)处理4-1和62-1菌，然后将反义寡核苷酸处理过的4-1和62-1菌分别稀释不同的梯度并点样到平板上面隔夜观察。结果显示25微摩尔没有化学修饰的反义寡核苷酸240-261R显著地抑制了含有内含子的白色念珠菌4-1菌株的生长，但是对于没有内含子的白色念珠菌62-1菌株则没有任何抑制现象(即使经过25微摩尔2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸240-261R处理)。同时申请人发现与核酶没有关系的反义寡核苷酸也没有任何抑制发生。与此同时，5微摩尔2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸240-261R能够产生与25微摩尔没有化学修饰的反义寡核苷酸240-261R同样的抑制效果，申请人也发现25微摩尔2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸240-261R显著加强了抑制白色念珠菌生长的效果。因此申请人可以得出结论靶定白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸能够在白色念珠菌体内外抑制核酶的自我剪切，从而导致了对含有内含子的白色念珠菌的生长的抑制。而且经过化学修饰的反义寡核苷酸提高了对白色念珠菌I型核酶的自我剪切的抑制。
图8为流式细胞仪检测反义寡核苷酸引起的白色念珠菌的死亡图。
本发明根据体外筛选的对白色念珠菌I型核酶活性非常重要核苷酸位点设计了反义寡核苷酸240-261R(SEQ ID NO1)，然后5’端标记FITC(绿色荧光素)，处理4-1和62-1菌8小时，接下来用碘化丙锭染色4-1和62-1菌。简短地说来，死亡的细胞能够被溴化丙锭染色，但是活的细胞不能够被碘化丙锭染色(Bai F，Xi JH，Wawrousek EF，Fleming TP，Andley UP 2003.Hyperproliferation and p53 Status ofLens Epithelial Cells Derived from αB-crystallin Knockout Mice.J Biol Chem 27836876-36886.；Wysocki R，Kron SJ 2004.Yeast cell death during DNA damage arrest isindependent of caspase or reactive oxygen species.J Cell Biol 166311-316.)。见附图6，象限I和象限II里面的细胞表示吸收了FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R的细胞；象限II和象限III里面的细胞表示死亡的细胞；从象限III像象限II转移的细胞表示因吸收了FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R而死亡的细胞。FITC和碘化丙锭的荧光信号通过FACScan flow cytometer(Beckman Coulter)检测，通过EXPO32ADC software来分析。.FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R引起的细胞死亡率的计算公式是死亡率＝象限II细胞数/(象限I细胞数+象限II细胞数)图9为流式细胞仪检测11株(4-1，1016，1013，1012，1024，221，1002，1001，62-1，1004，1005)临床白色念珠菌对反义寡核苷酸的敏感性图。
一共有11种临床的菌株被用来检测反义寡核苷酸240-261R所引起的细胞的死亡，虽然每株菌的对240-261R反义寡核苷酸的吸收效率不同，但是对于含有内含子的菌株来讲，反义寡核苷酸240-261R引起的死亡率都在30％-50％之间；而对于没有内含子的菌株来讲，240-261R引起的死亡率都在4％(背景水平)左右。这个结果表明了反义寡核苷酸240-261R在体内专一，高效地作用在白色念珠菌I型核酶上并抑制了核酶的自我剪切的活性，最终引起了含有内含子核酶的白色念珠菌4-1的死亡，而且表明了靶定白色念珠菌26S rRNA基因中的I型内含子核酶的核心假结的反义寡核苷酸普遍实用于含有I型核酶的白色念珠菌抗感染治疗。
具体实施例方式
实施例1体外转录过程中筛选对白色念珠菌I型核酶的自我剪切的抑制的反义寡核苷酸。
申请人根据白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的序列设计了21个寡核苷酸(1-26R，18-40R，30-50R，50-68R，69-92R，93-109R，107-126R，120-138R，137-159R，160-179R，180-203R，204-220R，221-241R，239-262R，255-277R，267-288R，280-300R，299-320R，317-338R，337-359R，356-379R，赛百胜公司合成)，他们覆盖了整个核酶的序列并且具有相同的Tm值(退火温度)。然后用白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的自剪切反应系统来筛选这21个反义寡核苷酸中能有效抑制该自剪切系统的反义寡核苷酸。
具体实施方式
是在白色念珠菌26SrRNA中的I型内含子核酶的自剪切系统中，该自剪切核酶的内含子为379个核苷酸，5’外显子为129个核苷酸，3’外显子为100个核苷酸。通过PCR的方法得到该前体核酶的DNA产物。接下来通过体外转录(10微升体系)的方法得到该核酶的前体RNA。该转录系统包括以下成份5×转录缓冲液2微升500微摩尔rATP，rCTP and rUTP100微摩尔rGTP)0.01μCi[α-32P]GTP(3000Ci/mmol)前体核酶的PCR产物4微升T7RNA聚合酶0.5微升(20units/微升)分别的21个设计的反义寡核苷酸(终浓度4微摩尔)该转录系统于37℃反应1小时，因为在该转录体系中含有6mM镁离子和足够的GTP，所以在该系统中有核酶的自剪切反应的发生。与此同时，在该转录体系中加入核糖核酸酶H(大连宝生物公司生产，终浓度0.4U/μl)在37℃反应1分钟。然后申请人分别通过8M的5％的PAGE胶来分离剪切产物以及核糖核酸酶H的切割产物并且使用scanner Typhoon 9200来定量分析核酶自剪切以及核糖核酸酶H切割的比例。通过对比分析结合核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸239-260R，239-262R，242-260R，242-262R以及P1区域的反义寡核苷酸1-26R会引起强烈的核酶自剪切反应的抑制。但是由于P1区域与核酶的5’外显子是同源的，所以以P1区域为靶标设计的反义寡核苷酸可能在体内会引起副作用，所以在下面的研究中只集中在以白色念珠菌的核心假结为靶标的抗白色念珠菌的研究。
实施例2确认核心假结区域影响核酶活性的重要位点通过实施例1已经确定了白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域对反义寡核苷酸非常敏感，反义寡核苷酸靶定该区域会引起核酶白剪切反应的强烈抑制，同时核糖核酸酶H的切割实验也表明所有的寡核苷酸都结合在正确的位置。下一步目标是想进一步确认核心假结区域对核酶的自剪切活性十分重要的核苷酸。
具体实施方式
是先固定白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域的G235位点，然后以G235→3’末端的方向设计长度一个一个缩短的反义寡核苷酸；同样地固定核心假结区域的G262位点，然后以G262→5’末端的方向设计长度一个一个缩短的反义寡核苷酸。所有设计的反义寡核苷酸的长度都在12-27个核苷酸之间。申请人接下来检测所有的反义寡核苷酸对白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的转录中自剪切反应的抑制效率。反应体系为5×转录缓冲液2微升500微摩尔rATP，rCTP and rUTP100微摩尔rGTP)0.02μCi[α-32P]GTP(3000Ci/mmol)前体核酶的PCR产物4微升T7RNA聚合酶0.5微升(20units/微升)分别的33个设计的反义寡核苷酸(终浓度4微摩尔)然后分别通过8M的5％的PAGE胶来分离剪切产物并且使用scanner Typhoon 9200(Amersham Pharmacia生物技术公司)来定量分析核酶自剪切的比例。进一步使用GraphPad Prism4软件(www.graphpad.com)来计算每个反义寡核苷酸对核酶自剪切抑制的效率并给出抑制的EC50值(见附表1)。紫红色表示固定白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域的G235位点而设计的反义寡核苷酸；蓝色表示固定核心假结区域的G262位点而设计的反义寡核苷酸。橙色表示抑制活性高的反义寡核苷酸的正对照。阴影部分表示对核酶活性十分重要的位点(见附图1)。
附表1设计的反义寡核苷酸抑制该核酶自剪切活性的EC50值以及最大的抑制效率。
通过所有的EC50对比分析我们发现了核酶的核心假结的一些对白色念珠菌I型 核酶自剪切活性非常重要的核苷酸位点(见附图1)。然后本发明根据该实验筛选出来的对白色念珠菌I型核酶活性非常重要的核苷酸位点设计反义寡核苷酸序列240-261R(SEQ ID NO1，5’-CATACCTTTCCGTGCTCTACGA-3’)做下游的抗白色念珠菌感染的研究。与此同时，申请人设计合成的反义寡核苷酸SEQ ID NO1的几个衍生物235-265R(SEQ ID NO2，5’-AGC CCA TAC CTT TCC GTG CTC TAC GAC GGCC-3)，235-262R(SEQ ID NO3，5’-CCA TAC CTT TCC GTG CTC TAC GAC GGCC-3’)，240-262R(SEQ ID NO4，5’-CCA TAC CTT TCC GTG CTC TAC GA-3’)，243-262R(SEQ ID NO5，5’-CCA TAC CTT TCC GTG CTC TA-3’)，245-262R(SEQID NO6，5’-CCA TAC CTT TCC GTG CTC-3’，与SEQ ID NO1有73.9％的同源性。)，248-262R(SEQ ID NO7，5’-CCA TAC CTT TCC GTG-3’)，255-265R(SEQID NO8，5’-AGC CCA TAC CT-3’)和反义寡核苷酸SEQ ID NO1都是通过靶定白色念珠菌I型核酶的核心假结而抑制该核酶的自剪切的活性，所以反义寡核苷酸序列SEQ ID NO1和它的7个衍生物都具有相类似的治疗白色念珠菌感染的功能。
实施例3共聚焦荧光显微镜观察白色念珠菌对反义寡核苷酸的吸收通过实验已经证明了靶定白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸会引起核酶自剪切反应的强烈抑制，但是在白色念珠菌体内反义寡核苷酸是否会引起核酶自剪切反应的强烈抑制是本发明所关心的问题。但是如何将这些靶定白色念珠菌I型核酶的核心假结的反义寡核苷酸导入到白色念珠菌体内是一个关键的问题。研究表明白色念珠菌是一个优良的运输反义寡核苷酸的系统，它能够富集反义寡核苷酸到白色念珠菌体内使体内的反义寡核苷酸的浓度达到体外的10倍。而且在12小时之内反义寡核苷酸在白色念珠菌体内非常稳定存在(Disney MD，Haidaris CG，Turner DH 2003.Uptake and antifungal activity ofoligonucleotides in Candida albicans.Proc Natl Acad Sci USA 1001530-1534.)。所以接下来本发明阐述白色念珠菌对外源的反义寡核苷酸的吸收效率。具体的实施方式是将隔夜30℃生长在YPD培养基中的白色念珠菌稀释到YNB培养基使其起始的OD值为0.1，然后再加入25微摩尔末端标记了FITC的反义寡核苷酸240-261R(SEQ ID NO1)于30℃生长8小时，通过离心获取所有的细胞然后用以下方式处理细胞(1)用纯净水洗涤收获的细胞。
(2)4℃甲醛固定细胞5分钟。
(3)用含有0.5％的Triton X-100的PBS缓冲液洗涤细胞。
(4)用DAPI染料染细胞核。
(5)通过轻微的振荡悬浮细胞溶液。
(6)离心重新用PBS缓冲液和纯净水洗涤细胞。
最后，细胞被固定在载波片并盖上盖玻片在共聚焦荧光显微镜(Olympus，Japan)下观察，结果显示无论是对于含有内含子的菌株还是不含内含子的菌株都能有效地吸收FITC末端标记的反义寡核苷酸。并且FITC末端标记的反义寡核苷酸分布在整个细胞之内包括细胞核(见附图5)。
实施例4体外筛选的反义寡核苷酸在白色念珠菌体内对I型核酶自我剪切的抑制。
前面已经证明了白色念珠菌能够有效吸收外源的反义寡核苷酸，于是用体外筛选的反义寡核苷酸来检测其对白色念珠菌体内自剪切反应的抑制。
具体实施方式
为将隔夜30℃生长在YPD培养基中的白色念珠菌稀释到YNB培养基使其起始的OD值为0.1，然后分别加入2微摩尔或者0.5微摩尔反义寡核苷酸于30℃生长8小时，然后用以下方式处理细胞提取细胞总RNA1.所有的样品12000转离心2分钟(25℃)。
2.弃上清，用100微升以下溶液重悬菌液。
90微升1摩尔山梨醇溶液和0.1摩尔EDTA(pH 8.0)的混合物；10微升0.1％β巯基乙醇；4微升50单位的裂解酶。
3.然后30℃温育20分钟。
4.12000转离心2分钟，去上清。
5.加入200微升complete bufferA重悬菌液然后加入2倍体积的酚-氯仿剧烈振荡90秒。
6.室温12000转离心10分钟。
7.吸取上清。
8.取2微升上清加入RQ1DNA酶(Promega，终浓度0.4U/μl)消解DNA 60分钟。
9.1微升1∶4稀释的DNA酶消解产物被加入到10微升逆转录体系中，逆转录酶(Promega公司生产)的终浓度为0.5U/μl。最后，取1微升逆转录产物作为下游PCR实验的模板。其中的引物序列(赛百胜公司合成)分别为
Ca21585’-TAATACGACTCACTATAGGGAATTAAAACATAGCATTGTGATG-3’Ca23865’-GGCTGTGGTTTCGCTAGAT-3’Intron 5’T75’-TAATACGACTCACTATAGGCAACCCACAAGGGAGGCAAA-3’PGK-L5’-AGCGATTATCAATTGCAGAAG-3’PGK-R5’-TGGTATCTCAAGTTTTCCAAC-3’在其中PGK(3-phosphoglycerate kinase三磷酸甘油酸激酶)mRNA作为PCR反应的内参。2微摩尔靶定核酶的核心假结区域的240-261R反义寡核苷酸强烈抑制白色念珠菌体内核酶自剪切，所以观察到前提RNA水平的增高。2微摩尔靶定核酶的其它区域的299-320R反义寡核苷酸观察不到对白色念珠菌体内核酶自剪切的抑制。而且，2’-OMe化学修饰的240-261R反义寡核苷酸(Darhmarcon公司合成)提高了对色念珠菌体内核酶自剪切的抑制水平。因为可以看到500nM的2’-OMe化学修饰的240-261R反义寡核苷酸的抑制效率等同于2微摩尔没有进行2’-OMe化学修饰的240-261R反义寡核苷酸的抑制效率。因此可以推论靶定核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸强烈而且专一地抑制白色念珠菌体内核酶自剪切水平。
实施例5平板生长法检测反义寡核苷酸对白色念珠菌生长的抑制因为rRNA上I型内含子的剪切对于核糖体的成熟是必需的，所以阻止核酶的自剪切就会抑制白色念珠菌的生长。通过实验已经证明了靶定白色念珠菌核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸强烈而且专一地抑制白色念珠菌体内核酶自剪切水平。接下来申请人想知道靶定白色念珠菌核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸是否能够抑制白色念珠菌的生长。具体的实施方式是白色念珠菌于30℃生长在液体YNB培养基(pH 3)中，起始的OD540值为0.01。
当菌液的OD540值达到1的时候，取菌液分别稀释5倍，20倍和100倍到新鲜的YNB液体培养基中并加入相应的反义寡核苷酸(包括2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸和没有化学修饰的反义寡核苷酸)。
然后这些稀释的菌液取3.5微升点到YPD平板上于37℃隔夜生长。
结果显示25微摩尔没有化学修饰的反义寡核苷酸240-261R显著地抑制了含有内含子的白色念珠菌4-1菌株的生长，但是对于没有内含子的白色念珠菌62-1菌株则没有任何抑制现象(即使经过25微摩尔2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸240-261R处理)。同时发现与核酶没有关系的反义寡核苷酸也没有任何抑制发生。与此同时，5微摩尔2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸240-261R能够产生与25微摩尔没有化学修饰的反义寡核苷酸240-261R同样的抑制效果，同时也发现25微摩尔2’-OMe化学修饰的反义寡核苷酸240-261R显著加强了抑制白色念珠菌生长的效果。因此可以得出结论靶定白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸能够在白色念珠菌体内外抑制核酶的自我剪切，从而导致了对含有内含子的白色念珠菌的生长的抑制。而且经过化学修饰的反义寡核苷酸提高了对白色念珠菌I型核酶的自我剪切的抑制。
实施例6流式细胞仪检测反义寡核苷酸引起的白色念珠菌的死亡通过实验已经确定了靶定白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸能够在白色念珠菌体内外抑制核酶的自我剪切，从而导致了对含有内含子的白色念珠菌的生长的抑制。紧接着想确定该反义寡核苷酸是否能够引起白色念珠菌的死亡。
具体实施方式
是从Darhmarcon公司购买FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R；YNB液体培养基中30℃培养白色念珠菌使其的OD540达到0.1。
然后加入5微摩尔FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R于37℃培养8小时。
5000转离心2分钟。
用1毫升PBS缓冲液洗涤两次。
用800微升的PBS缓冲液重悬白色念珠菌细胞溶液准备流式细胞仪实验。加入5微克的碘化丙锭(华美公司)到细胞悬浮液。简短地说来，死亡的细胞能够被溴化丙锭染色，但是活的细胞不能够被碘化丙锭染色(Bai F，Xi JH，Wawrousek EF，Fleming TP，Andley UP 2003.Hyperproliferation and p53 Status of Lens Epithelial CellsDerived from αB-crystallin Knockout Mice.J Biol Chem 27836876-36886.；WysockiR，Kron SJ 2004.Yeast cell death during DNA damage arrest is independent of caspase orreactive oxygen species.J Cell Biol 166311-316.)，见附图5。象限I和象限II里面的细胞表示吸收了FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R的细胞；象限II和象限III里面的细胞表示死亡的细胞；从象限III像象限II转移的细胞表示因吸收了FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R而死亡的细胞。FITC和碘化丙锭的荧光信号通过FACScan flow cytometer(Beckman Coulter)检测，通过EXPO32ADC software来分析。.FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R引起的细胞死亡率的计算公式是死亡率＝象限II/(象限I+象限II)。数据通过GraphPad Prism 4.0 program(www.graphpad.com)作图。
申请人一共选择了11株(4-1，1016，1013，1012，1024，221，1002，1001，62-1，1004，1005)临床的白色念珠菌菌株(其中4-1，1016，1013，1012，1024，221，1002，1001含有内含子62-1，1004，1005没有内含子)来检测它们对于FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R的敏感性。从附图9可以看出对于含有内含子的白色念珠菌菌株来说，虽然它们对FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R的吸收效率从5％到50％，但是FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R引起的细胞死亡率都保持在30％-50％；但是对于没有内含子的白色念珠菌来说，虽然它们对FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R的吸收效率都很高，但是FITC 5’末端标记反义寡核苷酸240-261R引起的细胞死亡率都保持在4％左右的低水平。这些结果有力地证明了靶定白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶的核心假结区域的反义寡核苷酸能够专一地，有效地引起白色念珠菌的死亡。与此同时，由于申请人设计合成的反义寡核苷酸SEQ ID NO1的衍生物SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8和反义寡核苷酸SEQ ID NO1一样都靶定白色念珠菌I型核酶的核心假结区域，所以这些衍生物同样在转录过程中以及白色念珠菌体内都能够专一，有效地抑制白色念珠菌I型核酶的自我剪切并引起白色念珠菌生长抑制和死亡。这些反义寡核苷酸SEQ ID NO1的衍生物抗白色念珠菌感染的实验过程与SEQ ID NO1的实验操作过程相同。
综上所述，本发明筛选出来的以白色念珠菌26S rRNA中的I型内含子核酶核心假结为靶标的反义寡核苷酸不仅在体外能够抑制白色念珠菌I型内含子核酶的自我剪切，而且在白色念珠菌体内专一地，高效地抑制白色念珠菌I型内含子核酶自我剪切并引起了白色念珠菌的死亡，申请人筛选出来的反义寡核苷酸及其衍生物序列经过动物实验以及进一步的临床实验的检测成为治疗白色念珠菌感染的新型高效并且无副作用的药物。
权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其具有SEQ ID NO1所示反义寡核苷酸序列。
2.一种分离的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO2所示反义寡核苷酸序列至少71％的同源性序列。
3.一种分离的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO3所示反义寡核苷酸序列至少78％的同源性序列。
4.一种分离的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO4所示反义寡核苷酸序列至少95％的同源性序列。
5.一种分离的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO5所示反义寡核苷酸序列至少82％的同源性序列。
6.一种分离的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO6所示反义寡核苷酸序列至少73％的同源性序列。
7.一种分离的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO7所示反义寡核苷酸序列至少60％的同源性序列。
8.一种分离的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO8所示反义寡核苷酸序列至少26％的同源性序列。
9.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸序列在治疗白色念珠菌感染中的应用。
10.根据权利要求2或3或4或5或6或7或8所述的反义寡核苷酸序列的衍生物序列在治疗白色念珠菌感染中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗白色念珠菌感染的反义寡核苷酸序列及其应用。筛选出一个以白色念珠菌I型内含子核酶的核心假结为靶标的反义寡核苷酸SEQ ID NO1及其衍生物来抑制白色念珠菌的生长，本发明表明该反义寡核苷酸在白色念珠菌体内外都能够强烈抑制该核酶的剪切活性而且发现这些寡核苷酸能够引起白色念珠菌细胞的死亡。本发明中设计的反义寡核苷酸具有抑制活性强，专一性高的特点，非常适合在治疗白色念珠菌感染中的应用，并且极有潜力发展为抗真菌感染的药。
文档编号C12N15/113GK1730654SQ20051001931
公开日2006年2月8日 申请日期2005年8月19日 优先权日2005年8月19日
发明者张翼, 张礼斌 申请人:武汉大学