一种由转基因蔬菜作物获得无外源基因蔬菜收获品的方法

专利名称：：一种由转基因蔬菜作物获得无外源基因蔬菜收获品的方法
技术领域：
：本发明属于植物基因工程领域。具体涉及从转基因植物中获得不含外源基因的作物产品的方法，其主要步骤涉及相关基因和结构元件的分离克隆、载体构建、遗传转化和分子检测、鉴定等步骤。本发明还涉及一种可遗传操作的重组载体的构建。该载体具有良好的通用性。
背景技术：
：植物转基因过程中，由于外源DNA被植物细胞吸收和整合进入植物基因组的频率很低，为了有效的选择、识别和鉴定转化的细胞和植株，导入目的基因的同时，需要引入选择标记基因以赋予受体植物特定的抗性。目前，所用的标记基因主要是编码抗生素或抗除草剂的基因。随着转基因植物的获得，标记基因已不再具有利用价值，但它仍在植物中不断指导酶的合成，消耗细胞资源，而且由于生物安全问题其对消费心理也形成一定压力。开发无标记基因或剔除标记基因的转基因系统，创造无标记基因的转基因植物具有重要意义。同时随着转基因植物的商品化种植，人们越来越关注外源基因的生物安全性，而不仅仅局限于标记基因的生物安全性，因为人们在采用基因工程进行作物遗传改良的时所用到的外源基因大量来自于微生物、动物或异源植物。人们同样担心这种来自异源生物的抗病、抗虫、抗病毒等基因是否具有食品和环境安全性。作为一种外源基因，无论是标记基因或目的基因，在转基因植物获得后并行使其相应功能后，将其从植物体内特别是在食用植物产品中彻底清除势在必行。目前，对外源目的基因的安全性研究却刚刚起步，国内外获得无标记基因转基因植物的方法，可归纳为以下4种，即无标记基因转化法、生理代谢基因选择法、目的基因载体与标记基因载体共转化法和标记基因切除法。第一种方法需借助PCR扩增直接对获得的非选择再生苗进行检测鉴定，后期选择工作量大、费用高，目前还没有现成的技术体系。第二种方法局限性大，转入的生理代谢相关基因影响植物个体发育，不宜采用。较为实用的是后两种方法，即双载体共转化法和标记基因切除法，后者又分为转座子法、位点特异重组法等。所谓共转化法，是将标记基因和目的基因分别放在两个不同的T-DNA内，构建在同一Ti质粒或不同的Ti质粒上，同时转化植物，转化后两个T-DNA片段分别整合到植物基因组不同位置。转基因植株经过自交，标记基因和外源基因由于减数分裂将被分离开来，从而在后代群体中可以选择到无标记基因的转化植株。有三种共转化途径将目的基因和标记基因分离(1)二质粒二菌株法；(2)二质粒一菌株法；(3)一质粒一菌株法(即双T-DNA法)不过，两基因共转化到同一细胞的频率较低，且要求整合的两基因容易通过染色体交换分离，因此，需要进行大量的筛选工作。另外，该方法要求植物能进行有性繁殖，不适合于无性繁殖的植物。转座子法主要是借助玉米Ac/Ds或Spm/dSpm两个研究最深入的转座子家族，转座子可携带转座标签之间的序列在基因组内跳跃，它们被转入其它作物后仍具有转座能力。标记基因和转座酶基因位于转座标签序列之间，通过转座酶的作用介导转座序列转移，可实现标记基因的剔除。然而，该方法完全寄希望于转座失误，即转座因子切除后不再重新插入新位置而消失，或重新插入到一个姊妹染色体中失活，或转座后通过随后的体细胞分离中丢失，因此成功率很低。同时，转座作用还导致原来与之相邻的DNA序列的改变，即转座的次级效应。位点特异重组法是将标记基因置于特定重组位点之间，通过相应的特异识别该位点的重组酶催化，产生特异重组或特异切除，利用此特性可将标记基因剔除。在转基因植物标记基因的剔除过程中，利用重组位点和重组酶的特点构建特异植物转化载体系统。即将标记基因置于T-DNA片段上的两个特异重组位点间；同时，将相应的重组酶基因构建到另一个植物转化载体上，以得到的两种转化植株杂交即可实现标记基因的切除。目前，主要发现了主要是存在于微生物中的五类位点特异重组系统，即细菌噬菌体P1的Cre-loxP系统、酵母质粒FLP-FRT系统、Zygosaccharomycesrouxii的R/RS系统、Mu噬菌体的Gin-gix重组酶系统以及λ噬菌体attB-P系统。Cre-loxP系统的lox位点由34bp特异序列构成，其中有8bp是核心序列，Cre重组酶是一个38.5KD的蛋白质，专一性的识别和催化两loxP位点之间序列的重组。利用了Cre-loxP特异位点重组系统切除转基因植物中的标记基因已在烟草、拟南芥等植物上获得成功(Gleave，etal，Selectablemarker-freetransgenicplantswithoutsexualcrossingtransientexpressionofcrerecombinaseanduseofaconditionallethaldominantgene.PlantMolBiol，1999，40223～235；ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)。有报道指出，在Cre-loxP系统中引入瞬时表达Cre重组酶的切除并不彻底、效率很低，还需要再一轮的组培再生过程，因此其可行性较差(Gleave，etal，Selectablemarker-freetransgenicplantswithoutsexualcrossingtransientexpressionofcrerecombinaseanduseofaconditionallethaldominantgene.PlantMolBio1，1999，40223～235)。植物上利用酵母质粒单链重组酶的FLP-FRT系统也随之发展起来(Kilbyetal.，FLPrecombinaseintransgenicplantsconstitutiveactivityinstablytransformedtobaccoandgenerationofmarkedcellclonesinArabidopsis.PlantJ，1995，8637-652；Lyzniketal.，FLP-mediatedrecombinationofFRTsitesinthemaizegenome.NucleicAcidsRes.1996，243784-3789.)。FRT位点也是由34bp特异序列构成，其中8bp是核心序列，FLP是48KD的其专一重组酶蛋白。Lloyd等(1994)将酵母的FLP-FRT位点重组系统应用于烟草，实验发现，FLP重组酶在植物组织中具有表达活性，可切除GUS标记基因，但重组酶表达效率较低，(LloydAM，DavisRW.FunctionalexpressionoftheyeastFLP/FRTsite-specificrecombinationsysteminNicotianatabacum.MolGenGenet，1994，242653～657)。而Zygosaccharomycesrouxii的R/RS系统和Mu噬菌体的Gin-gix重组酶系统，则与Cre-loxP和FLP-FRT系统相似，但在植物中还未见应用的报道。以上方法不仅效率低，而且均需要通过重组酶切除与后代的分离选择过程，周期较长，工作量大。利用λ噬菌体attB-P系统实现标记基因的自我剔除，而且周期短，便于人为控制，还可以应用于无性繁殖植物。有利用att特异位点进行载体构建和基因克隆的专利申请(一种位点重组反向克隆基因的方法及其利用，中国发明专利申请号01130855.9)，与本发明不同。也有利用att特异位点自主重组实现标记基因的剔除的文献，但其效率很低(Zubkoetal.IntrachromosomalrecombinationbetweenattPregionsasatooltoremoveselectablemarkergenesfromtobaccotransgenes.NatureBiotech，2000，18442～445)，且没有专利报道。attB位点的序列段较短(21bp)，核心序列7bp，attP位点由352bp特异序列构成，同attB位点一样，核心序列也为7bp。λ-att重组酶(INT)基因，可特异识别attB和att-P位点并进行位点间序列的特异切除。引入INT重组酶，并由组织特异性启动子或化学诱导性启动子驱动，识别att位点切除外源基因的研究尚无专利报道。本申请人的前期工作分别申请了三项相关发明专利，其中发明专利申请“一种位点重组反向克隆基因的方法及其应用”(中国发明专利申请号01130855.9)仅仅引入att位点进行基因克隆而未涉及INT重组酶；发明专利申请“一种剔除转基因植物中标记基因的方法”(中国发明专利申请号200310111414.3)和发明专利申请“一种能够使转基因植物自主剔除标记基因的方法”(中国发明专利申请号200310111415.8)虽然利用INT重组酶识别att位点切除标记基因，但重组酶是分别由组成型启动子和地塞米松诱导型启动子，同时该专利也没有对目标基因的生物安全性加以考虑，仅涉及标记基因的生物安全性策略。同样诱导性启动子驱动重组酶应用于植物转基因研究只剔除了标记基因，外源基因仍然存在植物体内(ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提出一种由转基因蔬菜作物获得无外源基因蔬菜收获品的方法，该方法的核心是构建一种通用性良好的重组表达载体，该载体及其遗传转化方法特别适合从带有外源基因的转基因番茄和转基因小白菜等蔬菜作物中剔除其外源基因，从而生产无外源基因的蔬菜作物的收获品。本发明利用λ噬菌体位点特异重组系统，化学诱导性启动子或组织特异性启动子驱动重组酶INT表达，构建特殊的植物转化载体，在特定发育阶段和组织器官剔除转基因植物中的所有外源基因包括标记基因，目标基因和重组酶基因，获得不携带外源基因的植物产品，从而提高转基因农产品的生物安全性。本发明通过以下技术方案实现一种适用于从转基因植物中剔除外源基因的重组载体pEGF，保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCC-M205109。2、一种适用于从茄科或十字花科蔬菜转基因作物中获得无外源基因的收获品的方法，它包括以下步骤构建一种可遗传操作的重组载体pEGF，该载体保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCC-M205109；1)目标基因装载于步骤1)所述的载体上，得到植物转化载体；2)用农杆菌介导的方法进行植物遗传转化，得到转基因植物；3)纯化和纯合所述的转基因植物；4)将所述转基因植物与化学诱导剂接触或不接触；5)通过分子检测鉴定得到所述的无外源基因植物或植物收获品其中步骤2)所述的目标基因是ACO，将其构建于重组载体pEGF中，得到转化载体pEGF-ACO；其中步骤2)所述的目标基因是Mi，将其构建于重组载体pEGF中，得到转化载体pEGF-Mi；其中步骤2)所述的目标基因是Bt，将其构建于重组载体pEGF中，得到转化载体pEGF-Bt；其中步骤5)所述的诱导物为β-雌二醇水溶液，施用浓度为2μM/L，其施用方法是将所述的β-雌二醇溶液与所述的转基因植物的叶面或根部接触。。其中步骤5)所述的经过与β-雌二醇溶液接触的植物是转基因耐贮藏番茄和转Bt基因抗虫小白菜。其中步骤5)所述的不与β-雌二醇溶液接触的植物是转基因抗线虫番茄。本发明的技术关键是构建一种适用于从转基因植物中剔除外源基因的通用的重组载体pEGF，将需要剔除目标基因(例如本发明所涉及的BT、Mi基因)装载于所述的重组载体上，得到转化载体；将该转化载体通过电激法导入农杆菌细胞，再利用农杆菌介导的遗传转化方法转化植物，得到转基因植物；纯化和纯合所述的转基因植物通过使用组织特异型启动子或化学诱导型启动子启动重组剔除反应最终获得无外源基因的植物收获品。本发明的具体步骤如下所示，其中本发明的总体技术路线如图1所示。1、λ噬菌体位点特异性重组系统所需元件的克隆根据λ噬菌体基因组序列(美国国立生物技术信息中心，基因注册号NC_001416)设计引物，分别获得重组酶基因(INT)及其识别序列(attP)。扩增INT基因的正反引物分别是INTF5′-ATGGGAAGAAGGCGAAGTC-3′，INTB5′-TTATTTGATTTCAATTTTGTCCCAC-3′，扩增attP位点的正反引物分别是attPF5′-GATTGCGAGGCTTTGTGCTT-3′，attPB5′-GGCAGGGAGTGGGACAAAAT-3′。在20μL反应体系中，分别加入13.65mLddH2O，1.5mM/LMgCl2，0.2mM/LdNTPs，0.5μM/L正向和反向引物，0.25μLλ噬菌体裂解物，0.5UTaqDNA聚合酶。扩增INT基因的反应循环参数为94℃预变性3min，然后94℃1min，62℃1min，72℃1min30s，反应30个循环，最后72℃延伸10min。扩增attP反应循环参数94℃预变性3min，然后94℃1min，56℃1min，72℃40s，反应30个循环，最后72℃延伸10min。INT基因和attP的PCR特异片段经切胶回收。前者片段回收产物与pMD18-T载体(购自日本TaKaRa公司)连接，而后者回收产物和pGEM_-TEasy(美国Promega公司)载体连接，分别转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒进行酶切后电泳分析鉴定。重组克隆分别命名为pMDTINT和pGTP。进一步序列分析证明，重组克隆中插入片段分别为INT基因和attP位点。其序列长度分别为INT基因(1071bp)，attP序列(353bp)。INT基因序列(全长1071bp，已公开的序列)attP序列为(353bp，已公开的序列)GATTGCGAGGCTTTGTGCTTCTCTGGAGTGCGACAGGTTTGATGACAAAAAATTAGCGCAAGAAGACAAAAATCACCTTGCGCTAATGCTCTGTTACAGGTCACTAATACCATCTAAGTAGTTGATTCATAGTGACTGCATATGTTGTGTTTTACAGTATTATGTAGTCTGTTTTTTATGCAAAATCTAATTTAATATATTGATATTTATATCATTTTACGTTTCTCGTTCAGCTTTTTTATACTAAGTTGGCATTATAAAAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGATTTCAATTTTGTCCCACTCCCTGCC。2.重组载体构建利用λ噬菌体位点特异性重组系统，组织特异性启动子驱动重组酶表达或化学诱导启动子驱动重组酶表达，从而将外源基因包括目的基因和标记基因在特定阶段或特定组织剔除，获得不携带外源基因的植物产品。构建重组载体pEGF过程如下以SalI和SacI对pMDTINT(INT基因装载至pMD18-T载体后的重组质粒)进行酶切，回收INT基因片段与XhoI，SacI酶切的pMV(由pBI121改造)的大片段连接，从而将INT基因构建到植物表达载体中，定名为pBINT。以pMV质粒(由pBI121改造)为基本载体，对其以PmeI酶切并CIAP去磷酸化处理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端补平。两者回收产物连接从而将片段attP插入pBI121(美国国立生物技术信息中心，基因注册号AF485783)的PmeI位点，定名为pPBIP。以HindIII对pPBIP酶切，T4DNA聚合酶末端补平并用CIAP去磷酸化处理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端补平。两者回收产物连接从将attP插入pPBIP的HindIII位点，从而构建成中间载体pMF。以pBINT的XhoI/EcoRI片段取代pMF相应片段，从而构建成重组载体pEGF(携有该重组载体pEGF的大肠杆菌(Escherichiacoli)保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTC-M205109)。该重组载体pEGF的T-DNA区内含有λ噬菌体重组酶基因(INT)，其上游有SalI和XbaI多克隆位点，可置换包括组织特异性启动子和化学诱导性启动子在内的启动子，其物理图谱见图2所示。3.植物转化载体构建将外源基因通过XhoI和SpeI双酶切回收产物连接到pEGF中相同酶切位点中。同时根据具体研究要求可以对其启动子以SalI、XbaI双酶切，置换所需要的目的启动子。本发明实施例中采用的是化学诱导启动子系统XVE(参见文献ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)和果实特异启动子E8(周晓红等。番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析，第一军医大学学报，2003；23(1)25-29)，从而构建成植物转化载体。4.植物的遗传转化通过农杆菌介导的方法把上述转化载体导入植物基因组，获得抗性愈伤或再生芽；进而将所述的抗性愈伤或再生芽诱导成小植株；对所述的转基因小植株喷施抗生素(例如卡那霉素)，通过筛选和自交选择纯化，获得纯合的转基因单株或株系。本发明采用两类启动子来驱动INT基因的表达，一是利用化学诱导型启动子，即利用化学诱导剂(如β-雌二醇)喷施转基因植物的叶面或根，诱导植物体内INT基因表达，从而将所述的外源基因从转基因植物产品中清除；二是采用组织特异启动子驱动INT表达，使转基因植株特定组织中表达INT，产生同样的剔除外源基因效果，获得无外源基因的植物收获品。详细制备方法如实施例1-3所示。5.外源基因的剔除外源基因整合进植物基因组中，可采用以下两种方法将外源基因剔除。①当转化载体中INT是由化学诱导启动子驱动，转化植株通过抗生素筛选获得转基因纯合株系，以特定的化学诱导物以诱导种子或植株中INT基因表达，识别attP位点并对两位点间进行特异切除，剔除外源基因，获得无外源基因的植物产品(例如在本发明的其中一个实施例转基因番茄中，采用抗生素为100mg/L卡那霉素，利用抗生素筛选纯化。由于INT是由受雌激素诱导启动子驱动，所以采用β-雌二醇诱导之后，INT重组酶启动表达，识别attP靶序列)。当转化载体中INT是由组织特异性启动子驱动表达，在所获得转基因植株通过同样的方法获得纯合株系，在特定组织表达INT，识别attP位点并对两位点间进行特异切除，剔除外源基因，获得在特定组织中无外源基因的植物产品(如本发明的一个实施例转基因番茄中，采用抗生素为100mg/L卡那霉素，利用抗生素筛选纯化。由于INT受果实特异表达驱动子E8(周晓红等。番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析。《第一军医大学学报》2003；23(1)25-29)驱动，在果实发育成熟后期E8驱动INT表达，识别attP靶序列)。其技术流程见图6(具体步骤见实施例1-3所示)。6.分子检测、鉴定提取待鉴定的纯合转化植株材料DNA，分别以目标基因、标记基因NPTII和重组酶基因INT的特异引物(如实施例1-3所示)，通过PCR扩增进行鉴定；或以上述三种外源基因序列为探针进行SouthernBlot分子鉴定(具体步骤参见实施例1)。本发明的主要优点是1.本发明利用特异启动子驱动重组酶表达，在特定发育阶段和发育器官发生重组剔除，可以更容易人为控制，具有很强的可操作性。2.本发明对外源基因包括目标基因，标记基因和重组酶基因等安全性加以考虑，彻底缓解转基因产品的外源基因的生物安全性。3.可以充分对目标基因行使功能之后从植物基因组剔除，既缓解了生物安全性，又改良了植物的性状。本发明的有益效果如表1和表2所示表1本发明三个实施例中外源基因的剔除效率注三种蔬菜作物均本发明所获得的转基因作物，其中番茄1是转抗根结线虫基因的转基因作物；番茄是耐贮藏转基因番茄作物；小白菜是转BT基因的作物。每个物种每批处理20株，共三批。表2本发明与现有技术主要技术指标比较图1.是本发明的流程图。INT基因的启动子可替换为组织特异启动子或可诱导型启动子。35S启动子和Nos终止子之间的多克隆位点可装载目标基因。图2.是本发明中可剔除转基因植物中外源基因的植物转化载体pEGF，INT基因的启动子可替换为组织特异启动子或可诱导型启动子。35S启动子和Nos终止子之间的多克隆位点可装载目标基因。图3.本发明的可剔除标记基因NPTII和重组酶基因INT的植物转化载体pEGF-ACO，目的基因为ACO基因；由于反义ACO基因来自番茄基因组，可以不作外源基因考虑；图4.本发明的可剔除标记基因NPTII和重组酶基因INT和目标基因的植物转化载体pEGF-Mi，目的基因为基因Mi。图5.本发明的可剔除标记基因NPTII和重组酶基因INT和目标基因的植物转化载体pEGF-Bt，目的基因为基因Bt。图6.是本发明中剔除转基因植物中外源基因的技术过程，INT基因的启动子可替换为组织特异启动子或可诱导型启动子。图7.本发明剔除标记基因NPTII和重组酶基因INT，获得反义ACO植物转化植株的技术过程。目的基因为ACO基因，由于反义ACO基因来自番茄基因组，可以不作外源基因考虑。图8.本发明从转基因小白菜基因组剔除标记基因NPTII和重组酶基因INT和目标基因BT等外源基因，获得不携带外源基因的蔬菜产品的技术过程。图9.本发明中番茄果实特异表达重组酶剔除外源基因(包括重组酶基因，标记基因和Mi基因)，由抗线虫转基因番茄获得不携带外源基因的番茄果实的技术过程。图10.本发明实施例1分子鉴定结果，以NPTII探针进行Southern杂交，图中1，3，5--未剔除标记基因的纯合植株，2，4--剔除标记基因植株。图11.本发明实施例2分子鉴定结果，以NPTII探针进行Southern杂交，图中1，2，3，5，6--未剔除标记基因的纯合植株，1，4--剔除标记基因植株。图12.本发明实施例3分子鉴定结果，以BT为探针进行Southern杂交，图中1，2，4，6--未剔除标记基因的纯合植株，3，5--剔除标记基因植株。具体实施例方式实施例1从转反义ACO基因番茄中剔除标记基因和重组酶基因获得无外源基因的耐贮藏番茄乙烯(ethylene)在植物整个生命周期中起着至关重要的作用。植物体内乙烯的生成量主要是由ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)活性调节。利用基因工程反义表达ACS和ACO调控乙烯合成进而调控依稀对植物的生理效应，是当前乙烯研究的主要路径。利用我们构建的植物转化载体和方法，可从转反义ACO基因番茄中剔除标记基因，获得不含标记基因和重组酶基因的耐贮藏番茄，需要以下步骤1.载体构建在本实施例中，利用反义抑制技术利用反义ACO基因(封碧红等，转ipt和反义ACO基因番茄叶片衰老相关特性，植物生理与分子生物学报，2003，29535-541)抑制番茄果实乙烯表达，以延长番茄果实贮藏期，提高其耐贮性。由于ACO基因来源于番茄本身基因组，因此ACO不作为外源基因，其生物安全性可以忽略。同时在番茄果实中必须持久表达其反义RNA以达到反义抑制延长贮藏期的目的，所以仅仅考虑标记基因，剔除标记基因即可。以pEGF载体为基本载体，通过酶切连接的方法，把ACO基因导入载体pEGF，同时将化学诱导启动子XVE系统(见ZuoJ等，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.2001，19157-161)装载入SalI和XbaI之间，形成新的植物转化载体，将该转化载体命名为pEGF-ACO。该载体中，重组酶INT由化学诱导启动子驱动，重组酶基因，标记基因目介于两个attP位点之间，反义ACO基因位于重组盒之外。其结构图如图3。2.番茄遗传转化和诱导剔除利用农杆菌介导的遗传转化法，把载体pEGF-ACO转入性状优良的番茄品种“中蔬五号”(购买自商业品种)，获得卡那霉素抗性番茄幼苗。在载体pEGF-ACO中，由于INT是由化学诱导启动子驱动，β-雌二醇诱导之后，INT重组酶启动表达，识别attP位点，特异性的切除该两位点间的所有外源基因，包括标记基因NPTII以及重组酶基因INT。后期再生培养基中不加卡那霉素，添加2uM/Lβ-雌二醇诱导INT表达促进重组反应。转化过程中通过PCR或Southern杂交等方法，对获得的T0代转基因植株进行分子鉴定，以进一步确定转基因植株，以及标记基因剔除情况。其技术流程见图7。其中番茄的遗传遗传转化如下利用电激法(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)，将pEGF-ACO导入到农杆菌LBA4404中。通过根癌农杆菌介导的番茄遗传转化步骤如下1)、无菌苗和烟草细胞培养无菌苗培养番茄“中蔬五号”种子用70％酒精消毒1min，而后在20％的次氯酸钠(有效氯6％)中消毒15min，灭菌蒸馏水冲洗3次，将种子接种到1/2MS基本培养基(参见MurashigeT.andF.Skoog.Physiol.Plant，1962，15473-497)中，于25±2℃暗处直至种子发芽，然后于光照强度18001x，16h光/8h暗的光周期条件下培养。烟草细胞培养烟草细胞NT1在KCMS-L中悬浮培养每周按2∶48稀释继代。2)、外植体准备和农杆菌培养在分离外植体前一天准备烟草看护培养基KCMS-S(看护培养基)，将生长了7天的烟草悬浮细胞吸取1.5ml转移到KCMS-S上，覆盖一张直径7cm的灭菌滤纸，25℃黑暗中过夜培养备用。外植体准备番茄种子发芽后6天，将无菌苗的子叶剪下或用刀片切下，子叶带有一小段叶柄接种于KCMS-S中预培养1天。农杆菌培养在含有卡那霉素的LB平板上挑取农杆菌单菌落接种于10ml含有50μg/L卡那霉素的LB培养基中于28℃，150r/m过夜培养至对数中期O.D1.03)转化再生将3～4皿的子叶外植体转移到50ml灭菌三角瓶中，经以MS0.2稀释至O.D＝0.2～0.3的农杆菌液接种感染5min，并轻轻摇动三角瓶，用吸管吸去农杆菌液，将外植体转移到灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，回接到KCMS-S上，于22℃进行1～2天的共培养；培养后将外植体小心转入MRS1上，2～3周后转入MRS2中。培养选择培养过程中及时清除掉农杆菌污染的材料。4)、再生芽生根移栽待再生芽长至1cm左右时，将芽切下放入RS中生根，2周后对生根良好，长至5cm左右的转化苗进行炼苗移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至大田中。表3番茄遗传转化所用培养基配方(包括耐贮藏番茄和抗根结线虫转基因番茄操作)注以上培养基除名称为KCMS培养基的pH为5.5外，其他培养基的pH均为5.8。3分子鉴定对于以pEGF-ACO转化的植株，收获第一代种子即T1代。由于T1代进行了分离，利用ACO基因上游CaMV35S启动子特异引物进行PCR检测(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。有特异性扩增产物的植株为含有反义基因的纯合与杂合植株，从T1代抗性植株上按单株收获种子，即T2代。继续利用PCR方法选择T2代植株，在T2代不再分离的株系，证明其对应的T1代植株为纯合单株，该株系为纯合株系。基因组提取及分子杂交方案如下利用CTAB法(Fultonetal.，1995.MicroprepprotocolforextractionofDNAfromtomatoandotherherbaceousplants.PlantMoleculorBiologyReporter，13，207-209)提取待鉴定转基因番茄植株叶片DNA。取0.5-1g幼嫩叶片于1.5mlEppendorf管中，迅速捣烂，加入700μl提取缓冲液(100mmol/lTris-HCl，pH＝8.0，1.4mol/lNaCl，20mmol/IEDTA，2％CTAB，0.1-2％巯基乙醇)65℃水浴30min，12000r/m离心5min，取上清液，用氯仿异戊醇(按体积比24∶1)抽提1次，加入冰冷的等体积异丙醇，摇匀，静置，12000r/m离心6min，沉淀用75％酒精洗涤、干燥、TE溶解、RNase处理后保存备用。以NPTII或INT基因片段的特异探针进行SouthernBlot(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)分子鉴定。PCR扩增pEGF-ACO载体上的INT(或)NPTII片段为模板，采用随机引物法((参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)(α-32p)dCTP标记探针。取20μg植物DNABamHI酶切过夜，1％琼脂糖胶电泳12h。转移到尼龙膜，预杂交，杂交，于-70℃放射自显影7天，洗X光片，照相记录结果。番茄转基因植株经化学诱导，基因组DNA通过分子鉴定没有特异扩增产物或杂交信号的，则证明标记基因和重组酶基因从转基因番茄中清除，获得无标记基因的耐贮藏番茄。NPTII引物为正向引物5′-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3′；反向引物5′-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3′。分子鉴定结果如图10。INT引物见
发明内容。实施例2从抗根结线虫转基因番茄中获得无外源基因的番茄果实产品植物根结线虫(Meloidogynespp.)是严重制约世界农作物产量的重要病原线虫之一。在引起植物侵染性病害的四大病原中，植物寄生线虫的危害超过细菌和病毒，仅次于真菌病害。番茄根结线虫病(Meloidogyneincognita)严重危害番茄种植生产。将抗根结线虫基因Mi导入番茄的抗虫基因工程具有重要的育种实际意义。与其同时导入番茄基因组的有抗性标记基因NPTII。利用我们构建的植物转化载体和方法，可从抗线虫转基因番茄中获得无外源基因的番茄果实，需要以下步骤1.载体构建以pEGF载体为基本载体，通过酶切连接的方法，以番茄果实特异启动子E8(见周晓红等，番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析，第一军医大学学报，2003，23(1)25-29)插入pEGF的SalI和XbaI位点之间，并把Mi基因(彭德良等，番茄抗根结线虫Mi基因研究进展，沈阳农业大学学报，2001，32(3)220-223)作为目的基因导入载体pEGF，形成新的植物转化载体，将该载体命名为pEGF-Mi。该载体中标记基因，重组酶基因和Mi基因位于两个attP位点之间，INT由果实特异性启动子(E8)驱动表达。其物理图谱见图4。2.植物遗传转化通过通用的农杆菌介导方法把pEGF-MI转入番茄(品种为“中蔬五号”，购自商业品种)基因组，获得抗性愈伤和再生芽，通过筛选鉴定(番茄遗传转化详见实施例1)。转化过程中通过PCR或Southern杂交等方法(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)，对获得的T0代转基因植株进行分子鉴定，以进一步确定转基因植株。其技术流程见图9。3.外源基因的纯化对于以pEGF-Mi转化的番茄植株，收获T0代果实，通过PCR和Southern杂交检测外源基因的剔除情况，并采收第一代种子即T1代。由于T1代进行了分离，叶面喷施100mg/L卡那霉素水溶液对转基因番茄植株的T1代植株进行筛选。将具显示有卡那霉素抗性的植株确定为转基因纯合或杂合植株，从T1代抗性植株上按单株收获种子，即为T2代。按同样的浓度和方法继续叶面喷施、选择T2代转基因番茄植株，选择T2代不再分离的株系即为纯合株系。4.外源基因的消除栽植以上得到的纯合株系，并采收其成熟果实，初步得到无外源基因的转基因番茄5.分子鉴定提取待鉴定番茄成熟果肉DNA，分别以Mi基因(Mi引物正向引物5′-GGTTCTCTAGCTAAACTTCA-3′；反向引物5′-TATTTATCATATCAATATCAC-3′)、标记基因NPTII(NPTII引物正向引物5′-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3′；反向引物5′-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3′)和重组酶基因INT(INT引物序列见本
发明内容)的特异引物，通过PCR扩增进行鉴定，或以上述三种外源基因序列为探针进行SouthernBlot分子鉴定(分子鉴定详细方案见实施例1)。由纯化的抗线虫转基因番茄材料采收的成熟果实，经分子鉴定没有特异扩增产物或杂交信号的，则证明外源基因已从果实组织中剔除，获得无外源基因的番茄果实。其分子鉴定结果如图11所示。实施例3由转BT基因抗虫小白菜获得无标记基因的蔬菜产品BT基因来自于华中农业大学微生物农药国家工程技术中心，该基因来自于苏云金芽胞杆菌(简称BT)基因工程菌WG001的杀虫晶体蛋白基因“cryIAc”(中国发明专利号ZL01128475.7)，其表达蛋白能特异毒杀鳞翅目害虫如小菜蛾等昆虫。将该基因导入小白菜对进行蔬菜抗虫育种具有重要意义。利用本发明构建的植物重组载体pEGF，可从转cryIAc基因抗虫小白菜中获得无外源基因的蔬菜产品，具体步骤如下1.载体构建以pEGF载体为基本载体，利用XhoI和SpeI对pEGF进行双酶切，将cryIAc基因导入载体pEGF，同时将化学诱导启动子XVE系统(见ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)装载入SalI和XbaI之间，形成新的植物转化载体，命名为pEGF-BT。其结构图如图5。2.植物遗传转化利用农杆菌介导的遗传转化法，把载体pEGF-BT转入小白菜(品种为“矮脚黄”，购自商业种)，获得转基因的小白菜植株。转化过程中通过PCR或Southern杂交方法(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)，对获得的T0代转基因植株进行分子鉴定，以进一步确定转基因植株(分子鉴定方法见实施例1)。农杆菌的培养和诱导将农杆菌LBA4404接种于50mg/L卡那霉素(Km)和50mg/L利福平(Rif)的LB液体培养基，在150r/m，28℃条件下振荡培养16h，离心收集菌体，重新悬浮于含0.25mol/LCaCl2和100mg/L乙酰丁香酮(AS)的诱导培养基中，28℃，150r/m振荡培养2～4h。小白菜遗传转化从小白菜无菌苗上切取带有1～2mm叶柄的子叶，插入MS基本培养基附加2.0mg/L6-BA、1.0mg/L萘乙酸、0.5mg/L脱落酸、7.4g/L琼脂和30g/L蔗糖(pH5.8)上预培养2～3天。诱导培养后的农杆菌用无激素的液体MS培养基按1∶10稀释，将子叶取出浸入稀释后的农杆菌悬浮液中，10min后将子叶取出，并用无菌的吸水纸将材料上多余菌液吸掉，然后将子叶转移到MS-1培养基上，在25℃和漫射光下共培养2～4天。然后将子叶转到MS基本培养基附加300mg/L羧苄青霉素、6mg/LAgNO3、7.4g/L琼脂和30g/L蔗糖(pH5.8)上培养5～7天，再将子叶移到MS基本培养基附加5mg/L卡那霉素、7.4g/L琼脂和30g/L蔗糖(pH5.8))进行选择培养，隔2周换一次培养基。30天后切取2厘米长抗性芽转移至生根培养基(MS基本培养基附加1.0mg/L吲哚-3-乙酸、7.4g/L琼脂和30g/L蔗糖(pH5.8))。2-3周后获得转BT基因的小白菜植株。3.植株的纯化将以上获得的以转BT基因化小白菜植株，于收获第一代种子(即T1代)播种幼苗，用100mg/L卡那霉素水溶液喷施转基因小白菜T1代植株进行筛选，选择具有卡那霉素抗性的植株得到含有BT基因的纯合或杂合植株；从T1代抗性小白菜植株上按单株收获种子，即为T2代。继续100mg/L用卡那霉素喷施法选择T2代植株，在T2代不再分离的株系，证明其对应的T1代植株为纯合单株，该株系为纯合株系。4.外源基因的剔除对上述获得的纯合小白菜株系，将其种子播种于田间之后，于该小白菜植株收获以前，于叶面喷施国际单位为2μM/Lβ-雌二醇水剂，间隔一天再用通浓度的β-雌二醇水剂喷施叶面一次，该过程称为化学诱导剂的应用(即接触)。初步得到不携带外源基因的小白菜。其技术流程见图8。5.分子鉴定提取待鉴定小白菜叶片或叶柄组织DNA，分别以目标基因BT(Bt引物正向引物5′-GTGGAGAACGCATTGAAACC-3′，反向引物5′-TCATTCAGCCTCGAGTGTTGCAGTA-3′)，标记基因NPTII(NPTII引物正向引物5′-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3′；反向引物5′-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3′)以及重组酶基因INT(INT基因引物序列见本
发明内容)的特异引物，通过PCR扩增进行鉴定，并以上述三种外源基因序列为探针进行SouthernBlot分子鉴定(分子鉴定方案详见实施例1)。分子鉴定结果如图12，图12表明，没有杂交信号的，则证明外源基因已从转基因小白菜中剔除。权利要求1.一种适用于从转基因植物中剔除外源基因的重组载体pEGF，保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCC-M205109。2.一种适用于从茄科或十字花科蔬菜转基因植物中获得无外源基因植物和植物收获品的方法，它包括以下步骤1)构建一种可遗传操作的重组载体pEGF，该载体保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCC-M205109；2)将目标基因装载于步骤1)所述的载体上，得到植物转化载体；3)采用农杆菌介导的方法进行植物遗传转化，得到转基因植物；4)纯化和纯合步骤3)所述的转基因植物；5)将所述转基因植物与化学诱导剂接触或不接触；6)通过分子检测、鉴定得到所述的无外源基因植物或植物收获品。3.权利要求2所述的方法，其中步骤2)所述的目标基因是ACO，将其构建于重组载体pEGF中，得到转化载体pEGF-ACO。4.权利要求2所述的方法，其中步骤2)所述的目标基因是Mi，将其构建于重组载体pEGF中，得到转化载体pEGF-Mi。5.利要求2所述的方法，其中步骤2)所述的目标基因是Bt，将其构建于重组载体pEGF中，得到转化载体pEGF-Bt。6.权利要求2所述的方法，其中步骤5)所述的化学诱导剂为β-雌二醇水溶液，施用浓度为2μM/L。7.权利要求2所述的方法，其中步骤5)所述的经过与β-雌二醇溶液接触的植物是转基因耐贮藏番茄和转Bt基因抗虫小白菜。8.权利要求2所述的方法，其中步骤5)所述的不与β-雌二醇溶液接触的植物是转基因抗线虫番茄。9.权利要求2或7所述的方法，其施用方法是将所述的β-雌二醇溶液与所述的转基因植物的叶面或根部接触。10.权利要求1所述的重组载体在剔除转基因番茄或转基因小白菜外源基因中的应用。全文摘要本发明利用生物的位点特异重组系统，结合组织特异性启动子和化学诱导启动子设计并构建植物转化载体，将目的基因、标记基因和位点特异性重组酶基因构建于重组酶识别序列之间，在所获得的转基因植物体内，组织特异性启动子或化学诱导启动子驱动重组酶的表达促使重组反应，实现将外源基因从转基因植物的基因组剔除。本发明还涉及一种通用很好的遗传重组载体，其保藏号为CCTCC－M205109，将一些目标基因装于所述的重组载体之上，得到适合遗传转化的转化载体，进而培育成无外源基因的转基因番茄和小白菜。文档编号C12Q1/02GK1952125SQ200510019620公开日2007年4月25日申请日期2005年10月18日优先权日2005年10月18日发明者叶志彪,张余洋,李汉霞,欧阳波,卢永恩,张俊红申请人:华中农业大学