专利名称：一种多色量子点微球编码方法
技术领域：
本发明属于纳米生物技术和生物分析技术领域，具体涉及一种对微球进行多色量子点光谱编码的方法。编码微球在经过生物学修饰后在基因表达、蛋白质间相互作用、高通量筛选、多通道生物学测定、医学诊断学和组合化学等方面都有广阔的应用前景。
背景技术：
近年来，对各类复杂体系中活性生物分子分析研究兴趣的快速增长，要求和刺激着新型分析检测技术的发明和发展。与传统分析检测技术如多孔板技术相比，最近发明的基于微球的分析检测技术，即悬浮阵列技术，由于在仪器装置中具有更好的传输流动性，并且单位体积能提供更多的分子识别位点(这有助于改进它的探测限制)等优点，在生物多元分析、基因表达、医学诊断、药物高通量筛选和组合化学等方面都具有很好的应用前景，近年来日益成为人们关注的焦点。但是，该技术的瓶颈在于对微球进行有效的编码。这几年，出现了许多对微球的编码方法。其中，利用量子点荧光信号对微球进行多色编码的技术由于具有更好的稳定性、可重复性、易于实现高通量探测等优点，而深受关注。然而，目前已报道的基于量子点的多色编码，由于没有考虑到生物学应用中生物探针荧光特性的特殊要求，在实用性方面还存在缺陷(如编码信号与探针信号存在交叠，不利于检测等)，有待进一步改善和提高。因此根据生物学研究特定的需要，选择合适发射波长的QDs对微球进行定量控制的多色编码，让出特定的波长段作为标记物信号的探测窗口，是很有必要而且很有实用价值的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多色量子点微球编码方法，该方法具有精确性和可重复性较高，操作简单易行。
本发明提供的一种多色量子点微球编码方法，其步骤为(1)根据待使用的荧光标记探针的发射波长，选择N种发射波长不与荧光标记探针发生重叠的量子点，2≤N≤10；(2)配制上述量子点的三氯甲烷溶液或甲苯溶液，分别测量其摩尔浓度；取上述量子点溶液，加入到稀释液中得到量子点混合溶液，作为装载液，稀释液由三氯甲烷和丙醇或正丁醇构成，其中三氯甲烷的体积比为40-80％，计算得到混合溶液中各量子点的摩尔浓度以及摩尔浓度比率；(3)将待编码微球加入到装载液中，充分均匀吸附后取出，并将微球清洗干净；(4)检测步骤(3)得到的编码微球的荧光光谱；(5)选定两种量子点，计算若干个编码微球的荧光光谱在选定的两种量子点的峰位处的荧光强度比值，将其比值的平均值作为该浓度比率装载液得到的编码微球的编码信号的平均值，将单球光谱两峰强度比值与平均值偏差的最大值作为其偏差值；分别以装载液中选定的两种量子点摩尔浓度比率和其对应编码微球两峰处荧光强度比值或其对数值作为横、纵坐标，绘制坐标点，并得到偏差值信息；(6)改变选定的两种量子点的摩尔浓度比率，配置不同浓度比率的装载液，重复步骤(3)-(5)，得到相应的编码微球及对应的信号和偏差，绘制坐标点，得到工作曲线；(7)根据步骤(6)得到的工作曲线，评估编码容量，指导微球的定量编码。
当N≥3时，在N种量子点中选取另外两种量子点，重复步骤(3)-(6)，绘制另一工作曲线。
本发明实现了由控制QDs装载液中不同发射波长QDs的摩尔浓度比率来控制微球中的编码信号，并且可以根据实验结果从理论上对QDs编码微球进行指导，具有很好的精确性和重复性，操作简单易行，而且采用光谱仪能对编码微球进行快速准确的识别，有利于促进量子点编码微球的发展和应用。
图1为量子点的紫外吸收和荧光光谱，其中(a)和(b)分别为黄色(575nm)量子点的紫外吸收和荧光光谱。(c)和(d)分别为红色(628nm)量子点的紫外吸收和荧光光谱。
图2为不同浓度比率的装载液得到的编码微球的编码信号。
图3为编码微球信号强度比率与对应装载液中两种QDs浓度比率分别取对数后的关系曲线，其中，纵坐标是lg(Iy/Ir)，横坐标是lg(Cy/Cr)。
具体实施例方式
下面以二种量子点为例对本发明作进一步详细的说明。
(1)根据生物研究需要用到的特定荧光标记探针如GFP、FITC、Rh.6G、FAM、HEX、TET、Texas Red、Cascade Blue、Cy3TM、Cy5TM等的发光特点，选择两种以上合适发射波长的量子点对微球进行多色编码。选择的原则是量子点的发射波长要避开标记探针的发射波长，避免量子点发射峰与探针发射峰出现交叠。
(2)配制上述两种量子点的三氯甲烷溶液或甲苯溶液，分别测量其摩尔浓度。分别取少量确定体积的量子点溶液，加入到由三氯甲烷和丙醇或三氯甲烷和正丁醇组成的一定体积的稀释液中，稀释得到量子点的混合溶液作为装载液，稀释液中三氯甲烷的体积比为4080％。计算得到混合溶液中上述两种量子点的摩尔浓度以及摩尔浓度比率。
(3)将待编码的微球一次性加入到装载液中，加入了微球的装载液放置摇床上充分振摇动，微球充分均匀吸附量子点后，离心取出，用乙醇清洗掉附着在微球表面的量子点，得到这一摩尔浓度比率的装载液得到的编码微球。
(4)随机挑(3)得到的若干个编码微球，测出编码微球的荧光光谱，分别计算这些单球光谱在两个峰位处的荧光强度比值，求出比值的平均值作为这一浓度比率装载液得到的对应编码微球的编码信号的平均值，取单球光谱两峰强度比值与平均值偏差的最大值作为这一样品的偏差值。装载液中两种量子点摩尔浓度比值和其对应编码微球两峰处荧光强度比值或其对数值，分别作为横、纵坐标，绘制坐标点，及其偏差值信息。
(5)重复(3)至(4)步，得到一系列摩尔浓度比率的装载液相对应的编码微球的编码信号及其偏差。在坐标轴中，描出由点(lg(Iy/Ir)，lg(Cy/Cr))(或(Iy/Ir，Cy/Cr)构成的工作曲线。其中，Iy和Ir分别为微球光谱在两个峰位处的荧光强度，Cy和Cr分别为装载液中两种量子点的摩尔浓度。
(6)根据步骤(5)得到的工作曲线，如果相邻点之间的偏差值不存在交叠，则它们是能被鉴别区分的；如果存在偏差值的交叠，则会给它们的鉴别带来影响，那么它们不宜同时用于同一实验的编码应用。此外，如果想要得到这两种量子点的编码信号为(Iy/Ix)的编码小球，在工作曲线上我们可以找到(Iy/Ix)对应的点读出相应的装载液浓度比率值，配置该浓度比率的装载液对这种小球进行编码，就可得到所需要的编码信号的编码小球。
(7)对于两种以上量子点的情况，即N＝3、4、…或10时，任意选取其中两种量子点，固定其余量子点的摩尔浓度，改变选定的两种量子浓度，得到一系列不同浓度比值的装载液。以选定的两种量子点，重复步骤(3)-(5)，绘制工作曲线。改变选取的两种量子点，固定其它量子点的摩尔浓度，又可以得到一条工作曲线，按此方法，可得到多条工作曲线。
实施例这里以结合使用荧光染料FITC(520nm)作为标记探针为例，对本发明作进一步详细的说明。
(1)考虑到FITC(520nm)的发射波长在蓝色区域，我们选择黄色(575nm)和红色(628nm)CdSe/ZnS量子点对商业化的聚苯乙烯微球进行两色编码。测量并计算黄、红两种量子三氯甲烷溶液摩尔原始浓度分别为5.663×107M和8.594108M。
(2)改变装载液中两种量子点的摩尔浓度比率，我们配置得到了一系列浓度比率梯度变化的装载液(溶剂由60％三氯甲烷和40％丙醇组成，装载液总体积保持在0.5ml)，装载液中黄色与红色量子点摩尔浓度比值范围是0.3～659(具体0.3，0.6，3.3，6.6，9.9，19.8，39.5，79.0，164.7，329.5，659)。称量0.5mg聚苯乙烯微球11份，分别一次性加入到各浓度比率的装载液中，放置到摇床上振荡24小时，过滤得到编码微球，用无水乙醇清洗微球3次。
(3)检测编码微球的光谱信号。用光谱仪对每个样品随机测量30个单球光谱，求出其平均值作为该样品的单球光谱平均值，取最大偏差值最为光谱偏差，如图2。由图2可知，通过控制装载液中两种量子点浓度比率的梯度变化，我们得到了一系列信号强度比率呈梯度变化的编码微球，a~k光谱的Iy∶Ir分别是1∶15.8，1∶9.8，1∶6.2，1∶2.9，1∶2.4，1∶1.7，1∶1.2，1.3∶1，3.3∶1，4.7∶1，9.1∶1。图3中，Iy和Ir分别为编码微球在575nm和628nm处荧光强度，Cy和Cr分别为装载液中黄、红两种量子点的摩尔浓度。
(4)根据图3的工作曲线，可以看到，多数相邻的编码点之间偏差值存在交叠，它们不宜同时用于同一编码应用。我们可以挑出没有交叠的编码进行同时应用。此外，通过配制曲线上点对应的(Cy/Cr)装载液，对微球进行编码，可以得到我们想要的编码微球。
权利要求
1.一种多色量子点微球编码方法，其步骤为(1)根据待使用的荧光标记探针的发射波长，选择N种发射波长不与荧光标记探针发生重叠的量子点，2≤N≤10；(2)配制上述量子点的三氯甲烷溶液或甲苯溶液，分别测量其摩尔浓度；取上述量子点溶液，加入到稀释液中得到量子点混合溶液，作为装载液，稀释液由三氯甲烷和丙醇或正丁醇构成，其中三氯甲烷的体积比为40-80％，计算得到混合溶液中各量子点的摩尔浓度以及摩尔浓度比率；(3)将待编码微球加入到装载液中，充分均匀吸附后取出，并将微球清洗干净；(4)检测步骤(3)得到的编码微球的荧光光谱；(5)选定两种量子点，计算若干个编码微求的荧光光谱在选定的两种量子点的峰位处的荧光强度比值，将其比值的平均值作为该浓度比率装载液得到的编码微球的编码信号的平均值，将单球光谱两峰强度比值与平均值偏差的最大值作为其偏差值；分别以装载液中选定的两种量子点摩尔浓度比率和其对应编码微球两峰处荧光强度比值或其对数值作为横、纵坐标，绘制坐标点，并得到偏差值信息；(6)改变选定的两种量子点的摩尔浓度比率，配置不同浓度比率的装载液，重复步骤(3)-(5)，得到相应的编码微球及对应的信号和偏差，绘制坐标点，得到工作曲线；(7)根据步骤(6)得到的工作曲线，评估编码容量用于微球的定量编码。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于当N≥3时，在N种量子点中选取另外两种量子点，重复步骤(3)-(6)。
全文摘要
本发明公开了一种多色量子点微球编码方法，它根据生物学研究特定的需要，选择合适的量子点做多色编码。通过控制装载液中多色QDs的摩尔浓度比率来得到不同荧光强度比率的编码微球。对于确定的各量子点，首先描出关于微球中不同信号强度比率和装载液中QDs浓度比率的工作曲线，通过这条曲线，初步评估量子点的有效编码库容量，并且用于指导微球的光学编码。本发明具有很好的精确性和重复性，操作简单易行，而且采用光谱仪能对编码微球进行快速准确的识别，有利于促进量子点编码微球的发展和应用。
文档编号C12Q1/00GK1779461SQ20051001962
公开日2006年5月31日 申请日期2005年10月19日 优先权日2005年10月19日
发明者王海桥, 黄振立, 曹元成, 赵元弟 申请人:华中科技大学