专利名称：精神分裂症相关基因mpzi1的多态性检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与精神分裂症相关的基因MPZ11，本发明还涉及MPZ11基因的单核苷酸多态性检测方法，以及MPZ11基因单核苷酸多态性在诊断精神分裂症方面的用途。属于生物技术的基因领域。
背景技术：
精神分裂症是一种复杂的且具有破坏性的脑功能紊乱，发病率约为1％，是严重影响人类精神和躯体健康的疾病之一，消耗了大量人力、物力和财力(Hyman SE.The NIMH perspectivenext steps in schizophrenia research.Biol.Psychiatry 2000b；471-7.)。虽然精神分裂症的确切病因还没有找到，但是同胞对分析，家系分析以及寄生子研究一致表明，遗传因素在发病机制中起了重要的作用(Barkur S，Shastry.SchizophreniaA genetic perspective(Review).Int J Mol Med 2002；9207-212.)。基因组遗传连锁筛选鉴别出了染色体上许多位点有阳性LOD值，这样就排除了精神分裂症的发生是由单一主要的位点导致的(Pulver AE，Lasseter VK，Kasch L，et al.Schizophreniaa genome scan targets chromosomes 3p and 8p as potential sites ofsusceptibility gene.Am J Med Genet 1995；60252-260.)。进行全基因组的关联分析是一个具有良好前景的精神分裂症分子遗传学研究方法。SNPs(单核苷酸多态性)即某一物种中，在基因组的特定位置上存在着的单个核苷酸的序列变化。普遍认为SNPs在人类基因组中每1Kb就有1个，总数可达约1千万个，是人类基因组多态性的主要来源，约占人类DNA多态性的90％(Collins，F.S.，Brooks，L.D.& Chakravarti，A.，A DNA polymorphism discoveryresource for research on human genetic variation，Genome Res，1998，8(12)，1229-31.)。由于SNPs密度很高，数量众多，非常稳定，并且绝大多数情况下只有两种等位基因型，可进行自动化的大规模检测，所以它是很好的遗传标记。位于1q23.3的MPZ11(髓磷脂蛋白零样1，myelinproteinzerolike 1)编码一种43-kD跨膜糖蛋白，是少突胶质细胞髓壳的主要蛋白组成之一。MPZ11与髓磷脂蛋白零有45.8％同源性，又称为蛋白零相关(proteinzero-related)基因(Zhao ZJ，Zhao R.Purification and cloning of PZR，a binding proteinand putative physiological substrate of tyrosine phosphatase SHP-2.ＪBiol Chem 1998；273(45)29367-29372.)。MPZ11通过其细胞内免疫受体ITIMs基序被酪氨酸磷酸酯酶SHP-2去磷酸化，在中枢神经系统少突胶质细胞的增殖、分化和转化过程中具有重要的信号转导作用(Zhao R，Zhao ZJ.Dissecting theinteraction of SHP-2 with PZR，an immunoglobulin family proteincontaining immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs.J Biol Chem2000；275(8)5453-5459.)。MPZ11有两种主要转录本4.0-kb和3.8-，1.3-kb。MPZ11在检测的所有组织中均有表达，包括心脏、胎盘、肾脏和胰腺，但在脑组织中的表达水平很低。(Zhao R，Zhao ZJ.Identification of a variant formof PZR lacking immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs.BiochemBiophys Res Commun 2003；303(4)1028-1033.)。有研究表明精神分裂症患者脑组织中MPZ11的mRNA的表达明显增加(1.29倍，P＝0.0263)(Tkachev D，Mimmack ML，Ryan MM，Wayland M，Freeman T，Jones PB，Starkey M，WebsterMJ，Yolken RH，Bahn S.Oligodendrocyte dysfunction in schizophrenia andbipolar disorder.Lancet 2003；362(9386)798-805.)。
由于MPZ11与中枢神经少突胶质细胞正常功能维持有着密切的关系，它们的表达异常可能与精神分裂症的病理机制相关。
经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有MPZ11基因与精神分裂症相关联的研究报道，也没有MPZ11基因多态性位点与精神分裂症的相关性报道。
发明内容
本发明的目的就在于揭示MPZ11基因及其多态性位点与精神分裂症的相关性，及其在检测精神分裂症方面的用途。
首先，本发明提供了一种检测MPZ11基因的单核苷酸多态性的方法，它包括如下步骤(a)确定MPZ11基因中rs3767444和rs2051656的单核苷酸多态，即SEQID NO1所示序列的第1001位和SEQ ID NO2所示序列的第925位的核苷酸。
(b)采用等位基因特异的实时聚合酶链反应技术检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性以及单核苷酸多态的类型。
其次，本发明提供了两种MPZ11基因的核酸序列，其一具有SEQ ID NO1所示的序列，且第1001位为C；其二具有SEQ ID NO2所示的序列，且第925位为A。
SEQ ID NO1ggccgagggg acccagccca tggggaacgc gggcctccgc gactggccgg 50gaaggcgcag agcctctttc ttctctttcc tggatcctgg agtgcggagg 100aggaggggag agtgctttac cttgctcctt cccggggggc ggtccagggg 150agcggacccg gcgggcggct gcggtgagcc ctcgcggcgc accctgccct 200ctcctcgtgg tgactctgga tcgtctaggc cctcccggat tctgactcag 250gaactagggt tctggcgttc ttcacctttg ggaggtggcg gaaagttgca 300ggtttttcat ttgtagggcc tttgttgatt tgtttcctgt taagccaggg 350ttttgttgta agttcccttt cccatgctct cattcagttt taagtctccg 400taataaaaga gtctcatttc cgtggtctgc aaaacgccaa taaaaaaata 450ttgttacttc taggttagaa tgcaaagagc ttggaatacc agtgagatgg 500cctggcttaa aagaatttgg tcaaatccat cataattcca gacgtagcca 550ccataatttg acaagacata gagcattaaa aagcataatt ttcctaaagg 600
aaaaaaaaag ctcctttttc ttaccaaata ttgtgactca agcttaaggt 650aaacctcggg ctcaatttat gggaattgga tgacttgttt tatggacatc 700tgaagtggta tctgccacag gacttttctg tgttgttgtt caaagcaaag 750tacttgttgc tgtctccgaa tttagttaaa taatagttat aaagagggcc 800agctgctaag aaaccacgta gatttttttc attccctttg ttttcaaaat 850gtcagttatg atttagcatc acagtatctg aataccagag tttactcagt 900aatttctttc ttcatggaaa agttcttaat ataatccttg gatcagggaa 950actaggtgaa gttctgttgg atcaccaact gttccactta aacagtgatt 1000ccaggggctg taaagcataa atgtaaaagt ctccctaccc tccaggggtt 1050gacagatgat gacacacttt gtgtaagaca caatccattc tgtattttgt 1100cttagaaaaa aaggttaaaa gtgtgtttgt tggtggtggt atttgtgttt 1150aatcaaacaa gtagaaaata gcctaaaatt aaggtttatc agaaatatgc 1200ttcagacaga attgttatgc atgagaggtc agacattgct atggaggaca 1250aagcagttag ggtgatctta attaaaatca gggtattaaa cgtagaagga 1300gtgcaaaact acatagtagt gaaaagatca ctagagtaat agccccatac 1350aacttggacg taactcttca gtaatgaaga tgaatgttga tatgtaaaaa 1400tcagcagctg atgttattgg ttcaacttag aaaattattg aatctaaaat 1450tcttgccaaa tcacctcttt tctggtcatg gatactgcac ataagagttt 1500atcttttaca ggatagcttc taaagtttta tcaagacagt tactcagcaa 1550acattcactg agcacctttt aagtgcttaa cacttaaaag gtgggaggtt 1600aggtctcact gtgttgccca ggctgctctg gaactgaaac tcctgggctc 1650cagtgattcc tctgcctttt cctcgcaagc agctggggct acaggtgtgt 1700gccactgtgt agggtcagaa gcacattggt aaagatgtac tgtgggagct 1750tgaaggaggg tcattatctc agactgtagt tcaggctact ggaggaaggg 1800agtttaaact gggtaggcat gggggagggg cagaagtaca tacagagtta 1850
tgaatgaacc tgttggtagt tcagtatagt gggaggttgg agtgtatata 1900aggggaatgg tgggagttga ggcaggagag cctgccaagg gcaccagctt 1950acaaagggcc ttgtctgcca cacttaatcc aatgaggatt tctctgtcta 2000SEQ ID NO2ttgtaaactg ggttgaagag gttgtaccat atttgtttct gtgcctcccc 50cagtgatgag ttcattgact tagaagaatg agtgagtgtc aggtatagaa 100aatagtttaa aaacatgtga tcattttgac acccattgtt atgttgtctt 150ttgtttttat atatctgttg cttcatcttg ccgtcagttg catttctata 200tttttgtttc tatttattta ttattattat tttttacatt tgttcttcaa 250attgccaatt catcagctgc agtacatcag agagtttgtc accagttaag 300caggctcctc ggaagtcccc ctccgacact gagggtcttg taaagagtct 350gccttctgga tctcaccagg taatggctga ttgcgattct gcccactgca 400ctgttcccta cagcttggtg ctctgtcact tccttgggtg tggaaaagaa 450tactgagcta tgagagacag agacagagac agacagacag agacaaagag 500agagtgggag tgaggaatta aagggctggc ctaggaagac cacaggaaaa 550tatgtggtga agaatctgct tgagtaaaga tttccatgaa accaccaata 600acataaattg tttactaacc atgtagcttc cttgcctcaa gcagaattag 650gaaatggctt tgtcagtaaa agattcttta attgcccaag gaaatgaatc 700taatgaagga gattctttct gtattgaggt actctaagat aagaaattag 750caaggaaaag ttggtattct tagtattgat aataaaacca aaattatttt 800ctgtggattc tttagaaaaa atggaaagta agcatttatc tgaataatta 850ataggcttga tgaacaagga atggttttgg tttctacttg tagaaagtac 900agaagagaaa caggttttat ttggaagtta gcatataatc tagctttgtg 950tgttttggct gtagtatttt aattataact gtggcttggc aaaaattcca 1000
tagcttagtt cagtttgatt tttctggggt agaaagcatg ctaaagaatt 1050tggccagtta tagctttgtc ctaaaaaggt gttagctggt gggaatggat 1100ttaagaggaa ataaagagag taacagtgtt ttgtgggaaa agtacccata 1150gtcttattcc atagttgtta tatgtggtga ggaaactaag gcattgtgat 1200gttaaattac taaaagcaca cacccagtta gtgacagaac tggggctaga 1250acccaggtgt ctagatagca tgttctctac cacagcatca ggctcattac 1300ttgttcctgt tctatctgtc tgtctctctc tcacattaca taatatatgt 1350cagatacctc agtctactaa tttgggttgt gaacaggaat atggttgtaa 1400atgaagacat gaaagttaca tacacatagg catagcatct aaaaaagcat 1450tggaacattt ttattccgcc cttgaagcac tatggaagtt gcttttttgc 1500tgaaaacaaa ccagaaaaaa gaaaaagaaa ctgtggtttt caagacagtg 1550gaacacaaat tatgcagcac tgtcatcccc aaaagaaagg aaacagacaa 1600tgtgagccgt gttattgccc cagtgtactg ccttgaagca gtttccacac 1650tgcagtgtag gtggggaaaa tggaaactgg gcccagctgt ctcactcaat 1700tgagaaggcg gaaatcagaa tttggggagg tcaaggaggc taagatttat 1750gaggctgagt accaaagaag gaaccataga gagagcgtgc taggatgagc 1800acgagcactt cagagatttg gagcggggtc cccttgagtc tttgtctgat 1850tacagagttg tatacacata ggagaacact ctctgaaacc aggggaagaa 1900ctacctgaaa tgcagtaggt tgcacaatgc ctggtgctca cacaggtgag 1950ggactagttt gtgttcctaa gagccagagt agagagactt ataatacaca 2000再次，本发明提供了两组检测MPZL1基因单核苷酸多态时应用到的等位基因特异性的核酸引物，长度为16-25bp，且分别特异性地扩增出rs3767444 SEQID NO1所示序列中第1001位和rs2051656 SEQ ID NO2所示序列的第925位单核苷酸多态性的扩增产物。
SNP位点rs3767444扩增引物如下反向引物15’-GCTTTACAGCCCCTGG-3’ (SEQ ID NO3)；反向引物25’-TGCTTTACAGCCCCTGA-3’(SEQ ID NO4)；正向引物5’-GGATCACCAACTGTTCCACTTAAAC-3’(SEQ ID NO5)。
SNP位点rs2051656扩增引物如下正向引物15’-AGAGAAACAGGTTTTATTTGGA-3’(SEQ ID NO6)；正向引物25’-GAGAAACAGGTTTTATTTGGG-3’(SEQ ID NO7)；反向引物5’-TACAGCCAAAACACACAAAGC-3’(SEQ ID NO8)。
最后，本发明提供了一种检测精神分裂症的诊断试剂盒。包括(1)特异性扩增MPZ11基因单核苷酸多态性位点的引物两组；(2)检测扩增产物与正常的MPZ11基因相比是否存在变化所学的试剂。以获得所述的SEQ ID NO1所示序列中第1001位和SEQ ID NO2所示序列的第925位单核苷酸多态性的类型。
利用本发明提供的精神分裂症相关的基因及其多态性位点的核酸序列，构建对精神分裂症进行遗传学诊断的试剂盒；作为药物设计靶点来进行药物的筛选，寻找出具有调节MPZ11表达的活性分子，促进新的抗精神疾病药物的发现；应用于对精神分裂症的辅助诊断和对个体是否具有精神分裂症的易感性进行评判，从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本实施例中先进行样本的收集和基因组抽提，从上海，安徽，吉林省的精神病院采集到的精神分裂症核心家系523个，患者平均年龄27.3±7.9岁(标准差)，其中298为女性；所有患者均符合精神分裂症的DSM-IV(diagnostic andstatistical manual of mental disorders，fourth edition)诊断标准，每例病人的诊断均经两位以上的精神病专家复诊后确诊。所有患者均具有幻想、幻觉、妄想、思维紊乱和认知障碍的临床表现。全体参与者均为汉族，并在正式的知情同意书上签字。以常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至10ng/ul。
步骤1确定目标位点，MPZ11基因中rs3767444和rs2051656的单核苷酸多态，即为MPZ11基因的SEQ ID NO1所示序列的第1001位和SEQ ID NO2所示序列的第925位的核苷酸。
步骤2检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性以及单核苷酸多态的类型。
本发明采用等位基因特异的实时聚合酶链反应技术(allele specificreal time PCR)对MPZ11基因的SNP位点rs3767444(其等位位点对为C/T)，SEQ ID NO1第1001位和rs2051656(其等位位点对为A/G)SEQ ID NO2第925位在核心家系中的频率分布情况进行了检测。PCR反应以及检测都是在ABI PRISM 7900序列检测仪上同时进行。
SNP位点rs3767444扩增引物如下反向引物15’-GCTTTACAGCCCCTGG-3’(SEQ ID NO3)；反向引物25’-TGCTTTACAGCCCCTGA-3’(SEQ ID NO4)；正向引物5’-GGATCACCAACTGTTCCACTTAAAC-3’(SEQ ID NO5)。
SNP位点rs2051656扩增引物如下正向引物15’-AGAGAAACAGGTTTTATTTGGA-3’(SEQ ID NO6)；正向引物25’-GAGAAACAGGTTTTATTTGGG-3’(SEQ ID NO7)；反向引物5’-TACAGCCAAAACACACAAAGC-3’(SEQ ID NO8)。
PCR扩增试剂反应分两孔，每孔反应体系总体积为5ul，其中ddH2O1.35ul 灭菌双蒸水MasterMix2.50ul TaqManuniversal PCR master mix(AppliedBiosystems)，SYBR green I 0.05ulSYBR green I荧光20uM反/正向引物0.05ul20uM正/反向引物1或20.05ul10ng DNA 1.00ul 10ng人体DNA扩增摸板PCR反应条件(PCR反应是在ABI PRISM 7900检测仪上进行)50℃激活uracil-N-glycosylase(UNG)，95℃12min，50X(95℃ 15秒，58℃30秒，)；dissociation95℃15秒，60℃15秒，95℃15秒。
看图分析软件ABI PRISM SDS2.1(ABI PRISM 7900检测仪自带)。
MPZ11基因SNP与精神分裂症的相关性统计利用ETDT软件进行单个位点传递不平衡检验(http//linkage.rockefeller.edu/soft/list.html)。计算等位位点频率和Hardy-Weinberg平衡，选用卡方检验进行统计学分析，统计学的显著性水平设定为p＜0.05。
结果位于1q23.3区域MPZ11基因上的rs3767444(其等位位点对为C/T)和rs2051656(其等位位点对为A/G)等位位点在核心家系中的频率分布情况请见表1。
表1ETDT分析单个SNP结果。
标记 多态 频率(第二个等位基因) 传递∶不传递X2(P值)rs3767444C/T0.8904147∶1076.299(0.0121)rs2051656A/G0.3581164∶2669.856(0.0017)
从上表中可见位于1q23.3区域MPZ11基因上的常见型单核苷酸多态性位点rs3767444的C等位位点，即在其DNA互补链上为T等位位点；位点rs2051656的A等位位点，即在其DNA互补链上为G等位位点，二者在核心家系传递不平衡检验中传递和不传递的等位基因间存在显著型差异P值分别为0.0121和0.0017，因此是产生精神分裂症的两个个危险等位位点，其中rs2051656的危险性更高。样本量具有大于90％的统计学强度来检测到“弱小的”基因效应。与精神分裂症显著相关的rs3767444位点和rs2051656位点，均位于内含子区域，可能影响RNA的转录和剪切。
检测试剂盒制备检测精神分裂症易感性的试剂盒，其中含有下列可扩增出SEQ ID NO1所示序列中第1001位和SEQ ID NO2所示序列的第925位单核苷酸多态性引物组SNP位点rs3767444扩增引物如下反向引物15’-GCTTTACAGCCCCTGG-3’(SEQ ID NO3)；反向引物25’-TGCTTTACAGCCCCTGA-3’(SEQ ID NO4)；正向引物5’-GGATCACCAACTGTTCCACTTAAAC-3’(SEQ ID NO5)。
SNP位点rs2051656扩增引物如下正向引物15’-AGAGAAACAGGTTTTATTTGGA-3’(SEQ ID NO6)；正向引物25’-GAGAAACAGGTTTTATTTGGG-3’(SEQ ID NO7)；反向引物5’-TACAGCCAAAACACACAAAGC-3’(SEQ ID NO8)。
在ABI PRISM 7900上对产物与正常对照进行分析，可轻易地检测出SEQ IDNO1所示序列中第1001位的T＞C型SNP和SEQ ID NO2所示序列的第925位的A＞G型SNP。
本发明的具有实用性的例证1)所建立的方法可用于分析人体的位于1q23.3区域MPZ11基因上的常见型单核苷酸多态性位点rs3767444的C等位位点和rs2051656的A等位位点在其DNA互补链上为T等位位点和G等位位点有无，来应用于对精神分裂症的辅助诊断和对个体是否具有精神分裂症的易感性进行评判。从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
2)可以利用本发明所介绍的方法以及上述1所述和rs3767444的C等位等位位点(即在其DNA互补链上为T等位位点)及rs2051656的A等位位点(即在其DNA互补链上为G等位位点)作为药物设计靶点来进行药物的筛选，寻找出具有调节MPZ11表达的活性分子，促进新的抗精神疾病药物的发现。
3)利用本发明提供的精神分裂症相关的基因及其多态性位点的核酸序列，构建对精神分裂症进行遗传学诊断的试剂盒。
4)采用本发明提供的引物序列可以特异、高效的检测出SEQ ID NO1所示序列中第1001位和SEQ ID NO2所示序列的第925多态性位点。
5)由于MPZ11对中枢神经系统少突胶质细胞功能的影响，因此它很可能还参与了其他神经、精神性疾病的病理过程。因此，本发明为今后对MPZ11基因与其他中枢神经系统性疾病关系公开了前期最宝贵的经验、实验基础和应用技术。
此外，位于rs3767444和rs2051656多态性位点上下2000bp的DNA序列中还有不少SNP位点，这些位点可能同样对MPZ11的表达具有调节作用。期望在不久的将来进一步加强和完善这一发明。
权利要求
1.一种检测MPZ11基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于包括步骤如下1)确定在MPZ11基因的SEQ ID NO1所示序列的第1001位的单核苷酸多态rs3767444的核苷酸和SEQ ID NO2所示序列的第925位的单核苷酸多态rs2051656的核苷酸；2)应用等位基因特异的实时聚合酶链反应技术检测在所述位置单核苷酸多态的类型。
2.如权利要求1所述检测MPZ11基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是在rs3767444 SEQ ID NO1第1001为存在C，在其DNA互补链上为T等位位点；在rs2051656 SEQ ID NO2第925为存在A，在其DNA互补链上为G等位位点。
3.如权利要求1所述的检测MPZ11基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于所用的两组等位基因特异性引物长度为16-25bp，且特异性地扩增出含MPZ11基因的rs3767444 SEQ ID NO1所示序列中第1001位单核苷酸多态性和在rs2051656 SEQ ID NO2所示序列中第925位单核苷酸多态性的扩增产物。
4.MPZ11基因的两种核酸，其特征在于，其中一种具有SEQ ID NO1所示的序列，且第1001位为C；另一种具有SEQ ID NO2所示的序列，且第925位为A。
5.一种精神分裂症的诊断试剂盒，其特征在于1)包括特异性扩增MPZ11基因单核苷酸多态性rs3767444和rs2051656的引物两组；2)含有检测扩增产物与正常的MPZ11基因相比是否存在变化所需的试剂；3)能够判断所述的SEQ ID NO1所示序列中第1001位单核苷酸多态性和SEQ ID NO2所示序列中第925位单核苷酸多态性的类型。
全文摘要
本发明公开了一种精神分裂症相关基因MPZl1单核苷酸多态性检测方法及其在诊断精神分裂症方面的应用。本发明中MPZl1基因的两个单核苷酸多态性位于1q23.3区域，具有SEQ ID NO1所示的核酸序列的rs3767444，多态性位点为C等位位点，在其DNA互补链上为T等位位点；SEQ ID NO2所示序列的rs2051656多态性位点为A等位位点，在其DNA互补链上为G等位位点。利用本发明提供的精神分裂症相关的基因及其多态性位点的核酸序列，构建对精神分裂症进行遗传学诊断的试剂盒，可应用于对精神分裂症的辅助诊断和对个体是否具有精神分裂症的易感性进行评判，有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
文档编号C12Q1/68GK1683558SQ20051002403
公开日2005年10月19日 申请日期2005年2月24日 优先权日2005年2月24日
发明者贺林, 贺光, 刘信民, 冯国鄞 申请人:上海交通大学