专利名称：精神分裂症相关基因ttr的多态性位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与精神分裂症相关的基因TTR及TTR基因的多态性位点检测方法，以及TTR基因单核苷酸多态性在诊断精神分裂症方面的用途。属于生物技术的基因领域。
背景技术：
精神分裂症是一种复杂的精神疾病，人群发病率高达1％，消耗了大量人力、物力和财力。它的典型症状包括思维混乱、幻觉、错觉和妄想等阳性症状，以及社会退缩、情感淡漠和意志消退等阴性症状。同胞对分析家系分析以及寄生子研究一致表明，遗传因素在精神分裂症的发病机制中起重要作用(BarkurS，Shastry.SchizophreniaA genetic perspective(Review).Int J Mol Med2002；9207-212)。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是疾病易感性、外显性、抵抗性以及药物反应性等生物学性状差别的重要遗传学基础，很多疾病与基因突变或基因多态有关。不同于传统的单基因研究方式，目前对基因的相互作用、多个基因组合与疾病关系的研究日益受到关注。随着SNPs的不断发现和人类第三代遗传标记图的绘制等进展，与疾病相关的人类基因信息数据库、与基因组多态性和基因突变有关的数据库dbSNP、HGBASE等相继建立，为从SNPs探讨复杂性疾病的机制探讨提供了可行性，因此对疾病相关调节通路的候选基因进行SNPs的关联研究，可能是多基因疾病研究如精神分裂症取得突破的希望所在。
Transthyretin(TTR)基因全长6.5KB，定位于染色体上18q12.1，共有四个外显子。迄今为止，有多达80个以上的与疾病相关的突变位点被报道(SaraivaMJ et al.，Transthyretin mutations in hyperthyroxinemia and amyloiddiseases.Hum Mutat 2001；17493-503)，其中绝大多数突变引起外周神经变性疾病(Frigerio R et al.，An unusual transthyretin gene missense mutation(TTR Phe33Val)linked to familial amyloidotic polyneuropathy.Amyloid2004；11121-124)。TTR在成年人体内的肝脏和脑部脉络膜中大量合成，然后由肝脏分泌到血浆或从脉络膜进入脑脊液中(Episkopou V et al.，Disruption ofthe transthyretin gene results in mice with depressed levels of plasmaretinol and thyroid hormone.Proc Natl Acad Sci U S A 1993；902375-2379)。研究发现，TTR是唯一能在脑脊液中大量表达存在的甲状腺素结合蛋白(HerbertJ et al.，Transthyretina choroid plexus-specific transport protein inhuman brain.Neurology 1986；36900-911)。美国国家环境健康科学研究中心的研究人员已经确定大脑中的转甲状腺蛋白(transthyretin)通过阻塞β-淀粉体来保护脑细胞不受破坏来终止阿尔茨海默症的进级。另外，在精神疾病患者的脑脊液样品中发现TTR表达水平有明显变化。
经对现有技术的国内外文献和专利检索，至今未见有TTR基因多态性位点与精神分裂症的相关性报道，而对TTR基因与精神分裂症相关联的研究也很少。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测精神分裂症相关基因TTR的多态性位点的方法，并利用检测得到的TTR基因的单核苷酸多态性位点来诊断精神分裂症。
为实现这样的目的，本发明公开了一种检测转甲状腺蛋白TTR基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于包括以下步骤1)用常规酚氯仿方法从人的血液中提取DNA，浓度校正至10ng/μl，作为DNA模板；2)设计寡核苷酸引物序列，用聚合酶链式反应扩增，反应体系为15μl，其中20μM正/反向引物0.3μl，2mM脱氧核苷酸1.5μl，含20mM镁离子的缓冲液1.5μl，DNA聚合酶0.15μl及DNA模板1.0μl和灭菌双蒸水10.25μl，退火温度为53度，退火时间为1分钟，扩增32个循环，得到TTR基因外显子区域的DNA序列；
3)对扩增后得到的DNA序列进行测序。测序反应总反应体积5μl，PE ABI的Big Dye 3.1荧光标记的终止底物循环测序试剂混合物1μl，200ng基因组DNA，3.3pmol引物，循环参数96℃，30s；50℃，30s；60℃，1min；循环30次，产物经乙酸钠/乙醇纯化后在DNA测序仪中进行自动测序，找出TTR基因外显子区域所有潜在的单核苷酸多态性位点。
其次，本发明在TTR基因的SEQ ID NO1所示序列的293位，SEQ ID NO2所示序列的第224位、第265位、第322位和第352位检测到了四个新的单核苷酸多态性位点和一个9核苷酸缺失的位点。其中，所述的单核苷酸多态性是在TTR基因的SEQ ID NO1所示序列的第293位为存在T，在其DNA互补链上为A等位位点；在SEQ ID NO2所示序列第224位为存在G，在其DNA互补链上为C等位位点；在SEQ ID NO2所示序列第265位为存在C，在其DNA互补链上为T等位位点；在SEQ ID NO2所示序列第322位为存在G在其DNA互补链上为A等位位点；在SEQ ID NO2所示序列第352位为存在GACTTCTTC，在其DNA互补链上为缺失GACTTCTTC。
再次，本发明提供了两种TTR基因的核酸序列，其一具有SEQ ID NO1所示的序列，且第293位为T；另一种具有SEQ ID NO2所示的序列，且第224位、第265位、第322位、第352位分别为G，C，G和GACTTCTTC。
SEQ ID NO1atagcagtgt gtctggaggc agaaaccatt cttgctttgg aaacaattac gtctgtgtta60tactgagtag ggaagctcat taattgtcga cacttacgtt cctgataatg ggatcagtgt120gtaattcttg tttcgctcca gatttctaat accacaaaga ataaatcctt tcactctgat180caattttgtt aacttctcac gtgtcttctc tacacccagg gcaccggtga atccaagtgt240cctctgatgg tcaaagttct agatgctgtc cgaggcagtc ctgccatcaa tgtggccgtg300catgtgttca gaaaggctgc tgatgacacc tgggagccat ttgcctctgg gtaagttgcc360aaagaaccct cccacaggac ttggttttat cttcccgttt 400SEQ ID NO2tttcggcgtg aatttgcaaa acaagacctg actctgtact cctgctctaa ggactgtgca60
tggttccaaa ggcttagctt gccagcatat ttgagctttt tccttctgtt caaactgttc120caaaatataa aagaataaaa ttaattaagt tggcactgga cttccggtgg tcagtcatgt180gtgtcatctg tcacgttttt cgggctctgg tggaaatgga tctgtctgtc ttctctcata240ggtggtattc acagccaacg actccggccc ccgccgctac accattgccg ccctgctgag300cccctactcc tattccacca cggctgtcgt caccaatccc aaggaatgag ggacttctcc360tccagtggac ctgaaggacg agggatggga tttcatgtaa ccaagagtat tccattttta420ctaaagcagt gttttcacct catatgctat gttagaagtc caggcagaga caataaaaca480ttcctgtgaa aggcactttt cattccactt taacttgatt ttttaaattc ccttattgtc540ccttccaaaa aaaagagaat caaaatttta caaagaatca aaggaattct agaaagtatc600tgggcagaac gctaggagag atccaaattt ccattgtctt gcaagcaaag 650另外，本发明检测到位于第二号外显SEQ ID NO1所示序列第293位的SNP1T→A的突变，它会造成氨基酸序列由谷氨酸到缬氨酸的改变，引起蛋白结构和功能的变化。等位位点A，即在其DNA互补链上为T等位位点，是产生精神分裂症的一个危险等位位点。
最后，本发明提供了一种检测精神分裂症的试剂盒，应用于对精神分裂症患者的辅助诊断和对个体是否具有精神分裂症的易感性进行评判，从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
1)包括特异性扩增TTR基因单核苷酸多态性SNP1T→A的引物对；2)与正常的TTR基因相比，检测扩增产物是否存在变化所需的试剂；并以此能够判断所述的SEQ ID NO1所示序列中第293位单核苷酸多态性的类型。
本发明新发现的单核苷酸多态性位点不仅是疾病诊断的分子标记，也是该疾病的药物候选靶点。本发明的诊断精神分裂症的方法，不仅适用于人类，也可诊断实验动物，用于精神分裂症治疗药物的开发和药效的评价，促进开发治疗精神分裂症药物的进程，更可以提高诊断的正确率。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。值得注意的是，以下实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
1.技术路线第一步DNA的抽提从长春和吉林采集到散发性的精神分裂症患者48例，平均年龄33.5±7.6岁，其中24例为女性。所有的病人都根据DSM-IV标准进行了严格的诊断，并签署了经上海市人类遗传资源委员会批准的统一的知情同意书。对照样品共有50例，来自西安和吉林，其中女性22例，平均年龄40.2±10.2岁。用常规酚氯仿方法从人的血液中提取DNA，浓度校正至10ng/μl，作为DNA模板。
第二步设计寡核苷酸引物序列，进行聚合酶链式反应(PCR)PCR反应体系为15μl，在PE 9600型PCR仪进行。其中ddH2O 10.25μl 灭菌双蒸水dNTP 1.5μl脱氧核苷酸Buffer 1.5μl含20mM镁离子缓冲液20μM 正向引物0.3μl20μM 反向引物0.3μlDNA聚合酶 0.15μl10ng DNA 1.0μlPCR反应条件(1)94℃ for 4min，1 cycle，(2)94℃ for 30s，53℃ for 50 s，70℃ for1min，32 cycles，(3)72℃ for 7min，1 cycle；扩增引物如下第二号外显子正向引物ctgtgttatactgagtagggaagc反向引物gtcctgtgggagggttct第四号外显子正向引物ccttctgttcaaactgttcc
反向引物ttctgcccagatactttcta扩增后得到TTR基因外显子区域的DNA序列。
第三步，对扩增后得到的DNA序列进行测序把第二步得到的PCR产物取5μl加入1.5μl sap酶，先在37度酶切45min后，在80度变性20min。测序反应总反应体积5μl，加PE ABI的Big Dye荧光标记的终止底物循环测序试剂混合物1μl，200ng基因组DNA，3.2pmol引物，在PE 9600型PCR仪进行单引物PCR循环，循环参数96℃，30s；50℃，30s；60℃，1min；循环30次。经乙酸钠/乙醇法纯化测序反应产物，加模板抑制试剂(TSR)95℃、4min变性后，将样品放入PE PRISM3100型DNA测序仪中进行自动测序(使用POP 6毛细管胶)。由此找出TTR基因外显子区域所有潜在的单核苷酸多态性位点。
2.数据统计和分析TTR基因多态性位点在病人和正常人的频率分布信息见表1。统计利用CLUMP 1.9 Version卡方分析(http//linkage.rockefeller.edu/soft/list.html)，模拟次数达到10000次，计算等位基因、基因型在正常人和疾病患者的分布，统计学的显著性水平设定为P＜0.05。
表1TTR基因多态性位点在病人和正常人的频率分布多态性位点等位基因 突变类型位置 序列编号 病人中分布频率a正常人中分布频率bSNP1 T→A 错义Exon 2SEQl29340/48 5/50SNP2 G→C / Intron 3 SEQ222412/48 5/50SNP3 C→T 同义 Exon 4SEQ22651/48 2/50SNP4 G→A 同义 Exon 4SEQ23222/48 3/50Del9 GACTTCTCC/del 缺失 Exon 4SEQ23521/48 1/50a杂合子在病人中分布频率。
b杂合子在正常人中分布频率。
结果SNP2(其等位位点为T/A)在正常人和精神病患者中的分布有显著差异(P＝0.0001)，而等位基因A相对于T来说，是精神疾病的危险位点。
3.检测试剂盒制备检测精神分裂症患者易感性的试剂盒，其中含有SEQ ID NO1所示序列第293位SNP1的引物对正向引物ctgtgttatactgagtagggaagc反向引物gtcctgtgggagggttct用测序的方法可以轻易地检测出第293位T＞A型SNP。
本发明具有实用性的例证1)所建立的方法可用于分析人体的位于18q12.1区域TTR基因上的单核苷酸多态性位点SNP1的A等位位点，即在其DNA互补链上为T等位位点有无，来应用于对精神分裂症患者的辅助诊断和对个体是否具有精神分裂症的易感性进行评判，从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
2)可以利用本方明所介绍的方法以及上述1)所述，把SNP1的A等位位点，(即在其DNA互补链上为T等位位点)作为药物设计靶点来进行药物筛选，促进新的抗精神分裂症药物出现。
3)采用本发明提供的精神分裂症相关的基因及其多态性位点的核酸序列，构建对精神分裂症进行遗传学诊断的试剂盒。
4)采用本发明提供的引物序列可以特异、高效地检测出SEQ ID NO1所示序列的第293位SNP1多态性位点。
5)本发明公布的SNP2，SNP3，SNP4和一个9核苷酸缺失的多态性位点在汉族人群中未显示与精神分裂症相关，但它们可能引起其他疾病的发生，是潜在的药物设计靶点。
此外，考虑到SNP1T→A是一个错义突变的单核苷酸位点，它的变化会造成氨基酸序列由谷氨酸(酸性氨基酸)到缬氨酸(中性氨基酸)的改变，使得转甲状腺蛋白的结构和功能发生变化。目前，正在加紧对此进行研究，期望在不久的将来进一步加强和完善这一发明。
权利要求
1.一种检测转甲状腺蛋白TTR基因多态性位点的方法，其特征在于包括如下步骤1)用常规酚氯仿方法从人的血液中提取DNA，浓度校正至10ng/μl，作为DNA模板；2)设计寡核苷酸引物序列，用聚合酶链式反应扩增，反应体系为15μl，其中20μM正/反向引物0.3μl，2mM脱氧核苷酸1.5μl，含20mM镁离子的缓冲液1.5μl，DNA聚合酶0.15μl及DNA模板1.0μl和灭菌双蒸水10.25μl，退火温度为53度，退火时间为1分钟，扩增32个循环，得到TTR基因外显子区域的DNA序列；3)对扩增后得到的DNA序列进行测序，测序反应总反应体积5μl，PE ABI的Big Dye 3.1荧光标记的终止底物循环测序试剂混合物1μl，200ng基因组DNA，3.3pmol引物，循环参数96℃，30s；50℃，30s；60℃，1min；循环30次，产物经乙酸钠/乙醇纯化后在DNA测序仪中进行自动测序，找出TTR基因外显子区域所有潜在的单核苷酸多态性位点。
2.转甲状腺蛋白TTR基因的多态性位点，其特征在于在TTR基因的SEQ IDNO1所示序列的第293位，SEQ ID NO2所示序列的第224位、第265位、第322位为四个新的单核苷酸多态性位点，第352位为9核苷酸缺失的位点。
3.根据权利要求2的转甲状腺蛋白TTR基因的多态性位点，其特征在于在TTR基因的SEQ ID NO1所示序列的第293位为存在T，在其DNA互补链上为A等位位点；在SEQ ID NO2所示序列第224位为存在G，在其DNA互补链上为C等位位点；在SEQ ID NO2所示序列第265位为存在C，在其DNA互补链上为T等位位点；在SEQ ID NO2所示序列第322位为存在G在其DNA互补链上为A等位位点；在SEQ ID NO2所示序列第352位为存在GACTTCTTC，在其DNA互补链上为缺失GACTTCTTC。
4.根据权利要求2的转甲状腺蛋白TTR基因的多态性位点，其特征在于位于第二号外显SEQ ID NO1所示序列293位的SNP1T→A的突变会造成氨基酸序列由谷氨酸到缬氨酸的改变，引起蛋白质结构和功能的变化，等位位点A，即在其DNA互补链上为T等位位点，是产生精神分裂症的一个危险等位位点。
5.转甲状腺蛋白TTR基因的两种核酸，其特征在于，其中一种具有SEQ IDNO1所示的序列，且第293位为T；另一种具有SEQ ID NO2所示的序列，且第224位、第265位、第322位、第352位分别为G，C，G和GACTTCTTC。
6.一种精神分裂症的诊断试剂盒，其特征在于包括1)特异性扩增TTR基因单核苷酸多态性SNP1T→A的引物对；2)与正常的TTR基因相比，检测扩增产物是否存在变化所需的试剂。
全文摘要
本发明公开了一种与精神分裂症相关的基因TTR及其新发现的多态性位点，以及在检测精神分裂症方面的用途。本发明还提供了一种检测TTR基因的单核苷酸多态性的方法，并用上述方法在TTR基因的SEQ ID NO1所示序列的第293位，SEQ ID NO2所示序列的第224位、第265位、第322位和第352位检测到了四个新的单核苷酸多态性位点和一个9核苷酸缺失的位点。其中，位于第二号外显子293位的SNP1T→A的突变会造成氨基酸序列由谷氨酸到缬氨酸的改变，引起蛋白结构和功能的变化，等位位点A，即在其DNA互补链上为T等位位点，是产生精神分裂症的一个危险等位位点，其可应用于精神分裂症的诊断。
文档编号C12Q1/68GK1683559SQ20051002410
公开日2005年10月19日 申请日期2005年2月28日 优先权日2005年2月28日
发明者贺林, 杨异凤, 万春玲, 冯国鄞 申请人:上海交通大学