专利名称：毛细管电泳酶微反应器、制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种毛细管电泳酶微反应器、制备方法及其用途，可以用于药物高通量筛选、临床诊断、以及酶学和蛋白质组学等方面。
背景技术：
毛细管电泳酶微反应器是近年发展起来的一种微分析技术，它是将毛细管作为酶反应的微室，反应后的产物可以通过电泳过程直接进行分离和测定。毛细管电泳酶微反应器实现了在线酶反应、样品处理及分离检测的一体化；由于毛细管柱的内径只有25-75μm，因而反应池的体积只有几个纳升，特别适合于体积微量的生物活性样品的分析；同时结合毛细管电泳的高效分离和自动化的操作毛细管电泳酶微反应器也很容易实现反应分析的自动化和高通量。
毛细管电泳酶微反应器的出现始于Bao和Regnier的工作，即文献1Bao，J.，Regnier，F.E.，J.Chromatogr.1992，608，217-224报道了利用毛细管电泳技术在线测定6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，这一方法后来被称作为电泳混合微反应技术，简称EMMA技术。即先将底物和酶依次导入毛细管，形成两个区带；当加上一定电压后，酶和底物的区带因其迁移速度不同而发生混合，停止电泳一段时间使其发生反应并生成产物；然后再加上一定的电压，使得产物、酶及底物根据各自不同的电泳淌度而实现分离。但此方法要求酶和底物具有不同的电泳淌度一定程度上限制了它的应用。
为了使毛细管电泳酶微反应器具有更大的载样量、提高酶的活性、稳定性及重复利用性、减少对环境的污染，近年来又出现了毛细管电泳固载酶微反应器。即在毛细管一端先将酶进行固定化，然后通过进样使得底物进入微反应器与固载酶发生反应，进而实现分离和检测。文献2Kato，M.，Sakai-Kato，K.，Jin，H.M.，Kubota，K.，Miyano，H.，Anal.Chem.2004，76，1896-1902提出了在毛细管柱端运用光聚合溶胶-凝胶法制备得到一多孔介质，通过优化溶胶-凝胶的反应条件将固定化酶制成一薄膜状并均匀地涂于多孔介质的表面，并将其成功运用于蛋白质的肽谱分析中。这样的微反应器为底物和酶提供了巨大的作用表面，并使得蛋白质等大分子能较容易的透过多孔介质。但其制备步骤较复杂，且多孔介质的形态受到很多因素的影响而不易控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种毛细管电泳酶微反应器。
本发明的目的还提供一种上述毛细管电泳酶微反应器的制备方法，即运用离子键合的酶固载化方法，采用自组装过程来实现毛细管电泳酶微反应器的制备。
本发明的又一目的是提供一种上述毛细管电泳酶微反应器的用途。将毛细管电泳酶微反应器发展成为一种新型的稳定可靠的酶抑制剂的高通量筛选技术，并可用于临床诊断、酶学及蛋白质组学方面的分析。
本发明的毛细管电泳酶微反应器是由毛细管、涂于毛细管内壁的聚电解质和与聚电解质发生自组装的酶组成。
所述的毛细管电泳酶微反应器中，所述的酶可以是各类氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶及合成酶。如酪氨酸激酶、蛋白激酶、肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶、丙氨酸氨基转移酶、醛缩酶、酸性磷酸酶或蛋白酶等。所述的聚电解质是水溶性的聚电解质，如聚溴化己二甲铵(HDB)、聚氯化环丁二甲铵(PDDA)等。
所述的毛细管柱总长是20-100cm，柱内径为25-100μm。优选长度30-80cm，内径25-75μm。
本发明的毛细管电泳酶微反应器可以是毛细管整个内壁涂有聚电解质和与聚电解质发生自组装的酶。但是从经济和效果出发，只需在涂有聚电解质的毛细管内壁一端组装酶就能够满足需要，其长度通常为0.5-5cm。余下的涂有聚电解质的毛细管还可以起到分离柱的作用。
本发明是运用离子键合的酶固载化方法，通过酶和聚电解质二者之间的自组装来实现在毛细管柱端制备毛细管电泳酶微反应器。如图1所示，1-1为毛细管纵向剖面图，1-2为横向剖面图。可将整根毛细管分为三个部分酶微反应器、分离柱及检测器。在微反应器部分中，1代表毛细管内壁，2为聚电解质层，3是酶分子层。其具体制备过程如下首先对毛细管壁用0.1-1mol/L一价金属的氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾等，预处理2-30分钟，使其带上负电荷；再用0.01-0.5％聚电解质水溶液处理2-10分钟，通过静电作用使得毛细管内壁呈现正电性；接着通过毛细管电泳仪自动进样使目标酶在毛细管柱端与聚电解质在4-80℃下发生自组装，通常采用20-40℃；5-15分钟后用缓冲液洗去未反应的酶，从而制得毛细管电泳酶微反应器，酶的用量为1-10纳升。通常采用pH为2-12的缓冲液，最好采用pH为6-9的缓冲液，其浓度为10-300mmol/L，所用的缓冲液可以为硼酸盐、磷酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷及N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸等。其原子力显微镜照片见图22-1为空白对照，2-2为聚电解质涂层，2-3为在聚电解质涂层基础上将酶分子通过自组装形成一单分子层。所述的聚电解质和酶如前所述。
本发明的毛细管电泳酶微反应器可以进行酶活的测定。酶活是指酶催化一定化学反应的能力，酶活的高低是研究酶的特性、进行酶的生产及应用时的一项必不可少的指标。在本发明中，将底物通过进样使其在柱端与酶发生反应，反应一定时间，一般为0.1-60分钟，最快的可在几秒内完成，再在毛细管两端加上一定的电压，通常为1千伏至30千伏，使未反应底物与产物得到分离和检测，所得产物峰面积的大小即代表酶活性的高低。
确保制备所得的微反应器具有酶的活性后，要对其稳定性及重现性进行考察。通过对其酶活的连续检测来考察微反应器的稳定性；通过对微反应器进行再生后酶活的考察，来判定其是否具有良好的重现性。
本发明还可以进行酶反应动力学的研究。通过在不同底物浓度下测反应产物的量可得到米氏曲线，从而用Lineweaver-Burk作图法求得米氏常数Km。再在不同底物浓度、不同抑制剂浓度条件下分别测反应产物的量，得到抑制曲线，从而求得抑制常数Ki。而抑制作用百分比可根据式(1)来计算得到%=100-(xblank·100)---(1)]]>方程式(1)中x为抑制剂存在时所测得的产物的量，blank为没有抑制剂时反应所生成的产物的量。将抑制剂的浓度与抑制作用百分比作图就可得到抑制剂对酶的抑制曲线，抑制剂的抑制效能(IC50)即可通过抑制曲线中当抑制作用百分比为50％时所对应的抑制剂浓度求得。由此可见，运用毛细管电泳酶微反应器可完成对酶和底物、抑制剂之间相互作用的研究。
在本发明中具体介绍将毛细管电泳酶微反应器用于酶抑制剂的高通量筛选。首先用一些已知的酶抑制剂进行判定，证实其与文献报道相符后，又将已知酶抑制剂加入到中药粗提液中来模拟用毛细管电泳酶微反应器来筛选一些粗提液中的酶抑制剂。此外，通过毛细管电泳仪的连续进样，来实现酶抑制剂筛选的高通量。
本发明的毛细管电泳酶微反应器还可以进行其它方面的应用。如对于各种可成为治疗疾病的药物靶点的酶或可用于临床诊断的酶，本发明均可通过对目标酶的酶活及其酶学动力学参数的测定来判定该酶是否符合分析的目的。还可将本发明与质谱联用，对各类蛋白水解酶进行肽谱分析，从而克服了传统方法中手工处理样品、反应时间长等缺点。此外，对于一些后翻译修饰反应，如磷酸化、糖基化及脂化等在调控细胞生物功能方面起着重要作用的反应，也可用本发明的毛细管电泳酶微反应器来分析。
本发明的积极效果及优点1)方法简便，成本低(只需在毛细管柱端通过自组装过程即可制得酶微反应器)2)分析速度快(一个样品经过1分钟的在线反应及2.5分钟的分离过程便可完成分离和检测。)3)酶的稳定性好、可重复使用(至少经过300次反应，酶仍保持良好的活性，通过再生可使酶微反应器重复使用。)4)样品及试剂消耗少(实验中使用的毛细管柱内径为50μm，其用样量只有几个纳升。)5)易实现高通量和自动化(结合毛细管电泳的高效分离和自动化操作，可实现反应分析的自动化和高通量。)
图1.采用自组装过程制备的毛细管电泳酶微反应器示意图
图2.毛细管电泳微反应器的原子力显微镜照片图3.底物溶液中氯化钠浓度对酶活的影响图4.反应时间对酶活的影响图5.HDB涂层和PDDA涂层酶活稳定性考察对比图6.最佳条件下酶活的测定图7.毛细管电泳微反应器稳定性和寿命的考察图8.毛细管电泳微反应器的再生图9.卡托普利的抑制曲线图10.卡托普利Michaelis-Menten曲线(1)和Lineweaver-Burk曲线(2)图11.西拉普利的抑制曲线图12.西拉普利Michaelis-Menten曲线(1)和Lineweaver-Burk曲线(2)图13.对各类化合物筛选所得产物(HA)和未反应底物(HHL)的电泳分离图符号说明图1和2中，数字1代表毛细管内壁，2代表聚电解质层，3是酶分子层；图13中，数字1为底物溶液中不含酶抑制剂，2-5为底物溶液中含待筛选化合物2为酮基布洛芬，3为西拉普利，4为双黄连，5为利血平，6为卡托普利。附图中min表示分钟，mM表示毫摩尔/升，V表示酶反应速度，[HHL]表示底物浓度。
具体实施例方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实例以血管紧张素转化酶(ACE)、蛋白激酶A(PKA)及肿瘤生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR)为模型，所用聚电解质为聚溴化己二甲铵(HDB)，来进行毛细管电泳酶微反应器的制备；又以ACE为例对所制备的酶微反应器的稳定性、重复性及再生等方面进行考察，并将其运用于酶抑制剂的高通量筛选中。此外，用相类似的方法可将本发明应用于临床诊断、酶学及蛋白质组学方面的分析。
1.ACE毛细管电泳酶微反应器的制备首先对毛细管壁用0.1mol/L氢氧化钠预处理5分钟，再用0.1％HDB水溶液处理5分钟，接着将0.5U/ml ACE酶溶液以50mbar*10sec压力进样使其在柱端与HDB发生自组装，温度为37℃，5分钟后用20mM硼砂含0.01％HDB的pH8.0的操作缓冲液洗去未反应的酶，从而制得毛细管电泳酶微反应器，其长度为1cm。
2.PKA毛细管电泳酶微反应器的制备首先对毛细管壁用0.1mol/L氢氧化钠预处理10分钟，再用0.1％HDB水溶液处理5分钟，接着将0.3g/L PKA以50mbar*10sec压力进样使其在柱端与HDB发生自组装，温度为30℃，5分钟后用50mM三(羟甲基)氨基甲烷含0.01％HDB的pH7.5的操作缓冲液洗去未反应的酶，从而制得毛细管电泳酶微反应器，其长度为1cm。
3.EGFR毛细管电泳酶微反应器的制备首先对毛细管壁用0.1mol/L氢氧化钠预处理5分钟，再用0.1％HDB水溶液处理10分钟，接着将2μg/mL EGFR以50mbar*10sec压力进样使其在柱端与HDB发生自组装，温度为25℃，10分钟后用25mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸含0.01％HDB的pH7.4的操作缓冲液洗去未反应的酶，从而制得毛细管电泳酶微反应器，其长度为1cm。
4.酶反应条件的优化及酶活的测定对于上述1的酶微反应器，分别考察了底物溶液中氯化钠浓度和反应时间对酶活的影响，并对PDDA涂层与HDB涂层进行对比，最终在优化所得的最佳条件下对酶活进行测定。ACE活性的测定可通过在230nm处测ACE与底物肽HHL反应所得产物马尿酸(HA)的量来实现，其反应方程式见式(2) 实验中发现底物溶液中氯化钠浓度对酶活有着很大的影响，见图3，横坐标为底物溶液中氯化钠的浓度，纵坐标为酶活(产物峰面积)；底物浓度为2.33mM；酶浓度为0.5U/ml；反应时间为1min；其电泳条件为缓冲液为20mM硼砂含0.01％HDB(pH8.0)，压力进样，20mbar*4sec，电压-15kV，电流-37μA，检测波长230nm，柱温37℃，毛细管柱总长34.5cm，有效长度26cm，柱内径50μm。由图可知，ACE酶活随着底物溶液中氯化钠浓度的提高而提高，但由于过高浓度的氯化钠会引起酶的流失，故实验中将氯化钠浓度定为50mM。图4为反应时间对酶活的影响，其横坐标为反应时间，纵坐标为酶活(产物峰面积)；底物浓度为2.33mM(其中含50mM NaCl)；酶浓度为0.5U/ml；电泳条件同图3。从图中可以看出，ACE酶活在反应时间为5min时就可达到较高的水平，而当反应时间为1min时，其酶活已经足够进行酶抑制剂的筛选，因此，后面的实验均以反应时间1min来进行。此外，还将HDB涂层与PDDA涂层所得的毛细管电泳微反应器的酶活稳定性进行对比，如图5所示，横坐标为时间，纵坐标为酶活(产物峰面积)；底物浓度为2.33mM(其中含50mM NaCl)；酶浓度为0.5U/ml；反应时间为1min；电泳条件同图3。HDB涂层在制备后的60min内，其酶活仍保持良好，而PDDA涂层所得酶活随时间的延长而不断降低。故采用HDB涂层与酶分子发生自组装来制备毛细管电泳酶微反应器。
经过上述反应条件的优化，在所得最佳条件下对ACE酶活进行测定，如图6所示分别为反应1min(1)和20min(2)后所得产物(HA)和未反应底物(HHL)的6次相同条件的电泳分离图，其横坐标为迁移时间，纵坐标为吸光度。其中ACE浓度为0.5U/ml，底物HHL浓度为2.33mM(其中含50mM NaCl)，反应时间为1min，电泳条件同图3。从图中可以看出，每次经过酶微反应器反应后测得的酶活具有良好的重现性，且每个样可在2.5min内完成分离检测。
5.采用上述1的酶微反应器，通过连续300次进样测定酶的活性对固载化酶微反应器稳定性及寿命进行考察。如图7所示，其横坐标为进样次数，纵坐标为酶活(产物峰面积)，其中ACE浓度为0.5U/ml，底物HHL浓度为2.33mM(其中含50mM NaCl)，反应时间为1min，电泳条件同图3。在经过300次底物进样反应后，酶的活性保持良好，其RSD％为9.1％。由此可见，通过自组装过程制备的毛细管电泳微反应器具有良好的稳定性和寿命。
6.对上述1的毛细管电泳微反应器进行再生实验考察，结果证明了该酶微反应器经过7次再生后，其酶活仍然得到很好的保持，见图8，横坐标为再生次数，纵坐标为酶活(用产物HA的峰面积表示)，其中ACE浓度为0.5U/ml，底物HHL浓度为2.33mM(其中含50mM NaCl)，反应时间为1min，电泳条件同图3。七次再生酶活的RSD％为5.4％。
7.采用上述1的酶微反应器，以血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利及西拉普利为例进行酶学动力学的研究。图9-(1)为卡托普利的抑制曲线，其横坐标为卡托普利的浓度，左纵坐标用产物的峰面积表示为不同抑制剂浓度下的产物曲线，右纵坐标为抑制作用百分比表示为卡托普利的抑制曲线，ACE浓度为0.5U/ml，底物HHL浓度为2.33mM(其中含50mM NaCl)，反应时间为1min，电泳条件同图3。图9-(2)为低卡托普利浓度下产物曲线和抑制曲线的放大图。由此得到其IC50为80nM。图10-(1)为卡托普利Michaelis-Menten曲线卡托普利浓度分别为(■)0nM；(◆)50nM；()100nM，底物HHL浓度为0.25-5mM，ACE浓度为0.5U/ml，反应时间为1min，电泳条件同图3。(2)为相应的Lineweaver-Burk曲线卡托普利浓度分别为(■)0nM；(◆)50nM；()100nM，底物HHL浓度为0.25-5mM，ACE浓度为0.5U/ml，反应时间为1min，电泳条件同图3。由此可得，卡托普利的Km为1.305μM，Ki为30.8±7.9nM。图11为西拉普利的抑制曲线，其横坐标为西拉普利的浓度，左纵坐标用产物的峰面积表示为不同抑制剂浓度下的产物曲线，右纵坐标为抑制作用百分比表示为西拉普利的抑制曲线，ACE浓度为0.5U/ml，底物HHL浓度为2.33mM(其中含50mM NaCl)，反应时间为1min，电泳条件同图3。由此可得其IC50为33.4nM。图12-(1)为西拉普利Michaelis-Menten曲线西拉普利浓度分别为(■)0nM；(◆)50nM；(▲)100nM，底物HHL浓度为0.25-5mM，ACE浓度为0.5U/ml，反应时间为1min，电泳条件同图3。(2)为相应的Lineweaver-Burk曲线西拉普利浓度分别为(■)0nM；(◆)50nM；(▲)100nM，底物HHL浓度为0.25-5mM，ACE浓度为0.5U/ml，反应时间为1min，电泳条件同图3。由图可得，西拉普利的Km为0.645μM，Ki为27.4±4.1nM。
8.将上述1的酶微反应器用于酶抑制剂的筛选。将本发明运用于其它化合物的血管紧张素转化酶抑制剂的筛选中，图13为对五个化合物进行筛选所得产物(HA)和未反应底物(HHL)的电泳分离图其中1为底物溶液中不含酶抑制剂，2-5为底物溶液中含待筛选化合物2为酮基布洛芬，3为西拉普利，4为双黄连，5为利血平，6为卡托普利，其浓度均为500nM，底物浓度为2.33mM(其中含50mM NaCl)，酶浓度为0.5U/ml，反应时间为1min，电泳条件同图3。表1为各类化合物对ACE的抑制作用。其中将西拉普利加入到复方利血平溶液中也呈现出抑制作用，说明此法可用于中药粗提液中酶抑制剂的筛选。通过筛选可知，二巯基苏糖醇对ACE也有抑制作用。
表1.各类化合物对ACE的抑制作用
9.毛细管电泳酶微反应器用于其它酶的分析除上述实例外，本发明毛细管电泳酶微反应器还可采用下述各种酶，进行酶抑制剂的高通量筛选，并可用于临床诊断、酶学及蛋白质组学方面的分析。
表2.各类酶及其在人体中的作用
权利要求
1，一种毛细管电泳酶微反应器，其由毛细管、涂于毛细管内壁的聚电解质和与聚电解质发生自组装的酶组成。
2，如权利要求1所述的毛细管电泳酶微反应器，其特征是所述的酶为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或合成酶。
3，如权利要求1所述的毛细管电泳酶微反应器，其特征是所述的聚电解质是聚溴化己二甲铵或聚氯化环丁二甲铵。
4，如权利要求1所述的毛细管电泳酶微反应器，其特征是所述的毛细管柱总长为20-100cm，柱内径为25-100μm。
5，如权利要求4所述的毛细管电泳酶微反应器，其特征是所述的毛细管柱总长为30-80cm，柱内径为25-75μm。
6，如权利要求1所述的毛细管电泳酶微反应器，其特征是涂有聚电解质的毛细管的内壁一端组装酶，其长度为0.5-5cm。
7，一种如权利要求1、2或3所述的毛细管电泳酶微反应器的制备方法，其特征是对毛细管壁用0.1-1mol/L一价金属的氢氧化物预处理2-30分钟；再用0.01-0.5％聚电解质水溶液处理2-10分钟；接着通过毛细管电泳仪自动进样使目标酶在毛细管柱或其一端与聚电解质发生自组装，温度为4-80℃，5-15分钟后用缓冲液洗去未反应的酶制得毛细管电泳酶微反应器，酶的用量为1-10纳升，采用pH为2-12的缓冲液，其浓度为10-300mmol/L。
8，如权利要求7所述的毛细管电泳酶微反应器的制备方法，其特征是所述的缓冲液pH为6-9的缓冲液。
9，如权利要求7所述的毛细管电泳酶微反应器的制备方法，其特征是所述的缓冲液是硼酸盐、磷酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷或N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸的缓冲液。
10，一种如权利要求1所述的毛细管电泳酶微反应器的用途，其特征是用于酶抑制剂的高通量筛选、临床诊断、酶学及蛋白质组学方面的分析。
全文摘要
本发明涉及一种毛细管电泳酶微反应器、制备方法和用途。其由毛细管、涂于毛细管内壁的聚电解质和与聚电解质发生自组装的酶组成。运用离子键合的酶固载化方法，通过酶和聚电解质二者之间的自组装来实现毛细管电泳酶微反应器的制备，方法简便。该反应器可用于药物高通量筛选、临床诊断、以及酶学和蛋白质组学等方面的分析。
文档编号C12Q1/00GK1737561SQ200510028048
公开日2006年2月22日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者康经武, 唐忠美 申请人:中国科学院上海有机化学研究所