专利名称：血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及生化技术领域，具体的说涉及一种血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法。
背景技术：
血管紧张素转化酶(ACE)可分为组织ACE和血浆ACE，ACE的基本作用是转化血管紧张素I和降解缓激肽。非活性的10肽血管紧张素I，经由ACE的作用，通过脱去C端His-Leu二肽，由血管紧张素I转化成为有生物活性的血管紧张素II，而血管紧张素II是已知最强的升压活性物质。利用ACE抑制剂可以抑制血管紧张素II的生成，可以减少缓激肽的失活，因此可以有效地控制高血压。
目前，国内已报导了一些食物蛋白质来源的ACE抑制肽的制备方法吴建平、丁霄霖(1998)以大豆蛋白为材料，利用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶等12种蛋白酶进行ACEIP的单酶和双酶酶解制备，筛选出一种能产生较高ACEI活性的酶E，得到酶解产物上清液的半抑制浓度为1.20mg/mL。
广州轻工业研究所从利用牛奶蛋白制备ACE抑制肽，体外ACE抑制实验表明IC50＜40ug/mL；动物实验表明，无论单次或连续给样(口服)，对肾血管狭窄型高血压大鼠(RVHR)均有显著降压作用，对正常大鼠的血压无明显影响(于江虹，2000)。
辛志宏、马海乐、吴守一等(2003)用碱性蛋白酶水解小麦胚芽蛋白得到的水解物对ACE有强的抑制活性(IC50＝0.014mg/ml)，对产物分离纯化得到序列为Ala-Met-Tyr的小分子肽，其IC50＝0.014mg/ml。
于娅、杨瑞金和王璋(2004)以新鲜无壳牡蛎为原料酶法制备牡蛎短肽，浓度为0.4mg/mL的牡蛎功能短肽的ACE抑制率为51.4％。
许庆陵、曾庆祝和崔铁军等(2004)以鲢鱼头为原料，利用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和复合风味蛋白酶制备ACE抑制肽，结果认为胃蛋白酶为酶解鲢头制备ACE抑制肽的理想蛋白酶；其最佳酶解工艺条件为温度37℃、pH＝2.0、酶解时间3h、酶的质量分数为14％、底物浓度w(原料)∶w(水)＝1∶3，在该条件下得到的产物对ACE的抑制率达到83.58％。
范俊峰、李里特和张艳艳(2004)等报道了2种工业化酶ProteaseA和OrientaseB的大豆蛋白水解物的高活性ACEI肽的筛选工作，其中OrientaseB水解大豆蛋白10h，其产物的ACE抑制活性最高达到95％，ProteaseA的最高也可达到91.33％。ProteaseA水解4～10h的产物以及OrientaseB水解6～10h的产物，是由2～5个氨基酸组成的寡肽，ACE的抑制活性高，且苦味轻微或没有。
现有的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法大多存在酶解时间长，酶解过程和时间难以控制，产物对AE的抑制率低等问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法存在的问题，提供一种新的血管紧张素转化酶抑制肽制备方法。
本发明的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法是采用Trypsin、Alcalase2.4L、Protamex中的两种酶酶解罗非鱼片加工后鱼骨上的残肉制备得到。
具体地是采用Trypsin与Alcalase2.4L、Alcalase2.4L与Protamex、或Trypsin与Protamex两种酶酶解所述残肉制备得到。
本发明方法更具体地包括如下步骤(1)将所述残肉与水按质量比1∶2混合，匀浆，沸水加热；(2)调节浆液的pH至8.0-8.5，温度为35-45℃，加入Trypsin，酶解1～2小时；(3)调节浆液的pH＝6.5-7.5，温度为45-45℃，加入Protamex，酶解4～5小时；(4)加热、过滤。
本发明也可以采用如下步骤(1)所述残肉与水按质量比1∶2混合，匀浆，沸水加热；(2)调节浆液的pH＝8.0-8.5，温度为55-65℃，加入Alcalase2.4L，酶解1～2小时；(3)调节浆液的pH＝6.5-7.5，温度为45-55℃，加入Protamex，酶解4～5小时；(4)加热、过滤。
本发明还可以采用如下步骤(1)所述残肉与水按质量比1∶2混合，匀浆，沸水加热；(2)调节浆液的pH＝8.0-8.5，温度为35-45℃，加入Trypsin，酶解1～2小时；(3)调节浆液的pH＝7.5-8.5，温度为55-65℃，加入Alcalase2.4L，酶解4～5小时；(4)加热、过滤。
本发明酶解得到的产物经Sephadex G-15分离，并测定各分离组分的IC50值，其中Trypsin与Alcalase2.4酶解产物经分离得到的3G组分抑制效果较好；3G组分经Sephadex G-15再次分离和测定各分离组分的抑制率，其中3GIII组分抑制率高且含量高；3GIII组分经RP-HPLC分离和测定各分离组分的抑制率，最后得到组分3GIII8经MS(电喷雾质谱)分析，其中多肽的分子量范围主要为200-450之间，经MS-MS(电喷雾串联质谱)分析其中含有Thr-Cys、Asp-Trp、Glu-Met、分子量为315的三肽和分子量为432的四肽。
本发明的有益效果在水产加工过程中存在大量下脚料，没有得到充分的利用，造成大量优良蛋白质资源的浪费，本发明以该水产加工下脚料罗非鱼残肉为原料，选用具有特定作用位点，水解能力强的蛋白内切酶和肽链内切酶进行ACE抑制肽的制备；本发明的制备方法充分利用了水产下脚料罗非鱼残肉作为原料，实现水产生物资源的高效增值利用，节约了成本；对内切酶与肽链内切的分步使用，实现对酶解过程和时间的控制，提高了产物对ACE的抑制率。Trypsin与Alcalasa2.4L、Trypsin与Protamex及Alcalase2.4L与Protamex分别分步控制酶解的产物经处理后稀释40倍后对ACE的最大抑制率可达到82.9％、82.9％和91.91％。
具体实施例方式
实施例1以水产加工过程中的罗非鱼肉残为原料，按质量比1∶2加入水，匀浆，沸水加热；调节浆液的pH＝8.0，温度为40℃，加入Trypsin，酶解2小时；调节浆液的pH＝7.0，温度为50℃，加入Protamex，酶解4小时。Trypsin与Protamex双酶分步酶解I值随酶解的进行起伏比较大，酶解后1小时，酶解产物I值达到最大82.9％。经加热灭酶冷却后，高速离心(14000转/min)得到上清液，取上清液15mL，加入7mL经水饱和的正己烷，充分摇匀混和静置萃取，收集下层液，经离心(12000r/min)取上清液10mL冻干，得到的样品标为1号。
1号样品经Sephadex G-15分离，得到下列组分
实施例2以水产加工过程中的罗非鱼残肉为原料，按质量比1∶2加入水，匀浆，沸水加热；调节浆液的pH＝8.0，温度为60℃，加入Alcalase2.4L，酶解2小时；调节浆液的pH＝7.0，温度为50℃，加入Protamex，酶解4小时。Alcalase2.4L与Protamex双酶分步酶解酶解2小时，酶解产物的I值为70.45％；酶解6小时，酶解产物的I值为91.91％，达到最大。经加热灭酶冷却后，高速离心(14000转/min)得到上清液，取上清液15mL，加入7mL经水饱和的正己烷，充分摇匀混和静置萃取，收集下层液，经离心(12000r/min)取上清液10mL冻干，得到的样品标为2号。
2号样品经Sephadex G-15分离，得到下列组分
实施例3以水产加工过程中的罗非鱼残肉为原料，按质量比1∶2加入水，匀浆，沸水加热；调节浆液的pH＝8.0，温度为40℃，加入Trypsin，酶解2小时；然后调节浆液的pH＝8.0，温度为60℃，加入Alcalase2.4L，酶解4小时。Trypsin与Alcalase2.4L双酶分步酶解酶解后1小时达到75.6％，随着酶解的进行产物的I值有起伏。酶解后4小时，酶解产物I值达到最大82.9％。加热灭酶冷却后，高速离心(14000转/min)得到上清液，取上清液15mL，加入7mL经水饱和的正己烷，充分摇匀混和静置萃取，收集下层液，经离心(12000r/min)取上清液10mL冻干，得到的样品标为3号。
3号样品经Sephadex G-15分离，得到下列组分
从Trypsin与Alcalase双酶分酶解液中分离得到IC50值为0.05249mg/mL的3G组分，再经Sephadex G-15分离后得到下列组分。
其中3GIII组分对ACE的抑制率最高。3GIII经RP-HPLC分离，其中出峰时间为20.025min的组分3GIII8的抑制率(27.9％)比较高。经MS(电喷雾质谱)分析，其中多肽的分子量范围主要为200-450之间，经MS-MS(电喷雾质谱串联质谱)分析其中含有Thr-Cys、Asp-Trp、Glu-Met、分子量为315的三肽和分子量为432的四肽。
权利要求
1.一种血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于采用Trypsin、Alcalase2.4L、Protamex中的两种酶酶解罗非鱼片加工后鱼骨上的残肉制备得到。
2.根据权利要求1所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于采用Trypsin与Alcalase2.4L、Alcalase2.4L与Protamex、或Trypsin与Protamex两种酶酶解所述残肉制备得到。
3.根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将所述残肉与水按质量比1∶2混合，匀浆，沸水加热；(2)调节浆液的pH至8.0-8.5，温度为35-45℃，加入Trypsin，酶解1～2小时；(3)调节浆液的pH＝6.5-7.5，温度为45-45℃，加入Protamex，酶解4～5小时；(4)加热、过滤。
4.根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其具体步骤如下所示(1)所述残肉与水按质量比1∶2混合，匀浆，沸水加热；(2)调节浆液的pH＝8.0-8.5，温度为55-65℃，加入Alcalase2.4L，酶解1～2小时；(3)调节浆液的pH＝6.5-7.5，温度为45-55℃，加入Protamex，酶解4～5小时；(4)加热、过滤。
5.根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)所述残肉与水按质量比1∶2混合，匀浆，沸水加热；(2)调节浆液的pH＝8.0-8.5，温度为35-45℃，加入Trypsin，酶解1～2小时；(3)调节浆液的pH＝7.5-8.5，温度为55-65℃，加入Alcalase2.4L，酶解4～5小时；(4)加热、过滤。
全文摘要
本发明公开了一种血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，是以水产罗非鱼片加工后鱼骨上的残肉为原料，选用具有特定作用位点，水解能力强的蛋白内切酶和肽链内切酶进行酶解制备；本发明实现了水产生物资源的高效增值利用，降低了成本，实现了对酶解过程的控制，提高了产物对血管紧张素转化酶的抑制率。
文档编号C12P21/02GK1680580SQ20051003264
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月4日 优先权日2005年1月4日
发明者曾庆孝, 朱志伟, 林奕封, 阮征, 张立彦 申请人:华南理工大学