专利名称：转基因物种的荧光相关光谱检测方法及其装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因检测技术，更详细的是一种用于转基因植物、转基因粮食和转基因食品检测的转基因物种的荧光相关光谱检测方法及其装置。
背景技术：
目前，基因检测的方法主要有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析；聚合酶链式反应-单链构象多态性分析；荧光能量传递技术(Taqman探针技术，LightCycler探针技术，Amplisensor探针技术，复合探针技术)；分子灯塔技术；基因探针技术等。但是，这些技术都存在各自的不足有假阳性，灵敏度低，放射性元素，检测时有荧光背景，操作繁琐，检测时间长等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高灵敏度、安全、快速、准确的转基因物种的荧光相关光谱检测方法，用于转基因植物、转基因粮食和转基因食品的检测。待测样品可以不需要进行PCR扩增，直接利用荧光互相关谱技术检测。
本发明的目的还在于提供实现所述方法使用的装置。
本发明转基因物种的荧光相关光谱检测方法包括以下步骤(1)用两种限制性内切酶对样品DNA进行酶切；(2)在(1)得到的酶切产物中加入DNA Marker混匀，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段；(3)根据DNA Marker指示的分子量，切下包含特定长度的CaMV35S启动子或终止子片段在内的凝胶；(4)用DNA凝胶回收试剂盒将(3)中切下的凝胶纯化回收包含CaMV35S启动子或终止子片段在内的特定长度DNA片段；(5)用两条荧光染料标记的寡核苷酸探针与纯化DNA片段进行杂交；(6)用荧光互相关谱检测杂交产物。
在第(1)步中，利用两种限制性内切酶特异性地切割转基因物种中的CaMV35S启动子或终止子。
在第(2)步中，将DNA Marker与酶切产物混合后再做电泳，其中DNAMarker的分子量与第(1)步中得到的酶切产物分子量相等。
在第(3)步中，将DNA Marker所在位置的凝胶切下用于回收CaMV35S启动子或终止子片段。
在第(5)步中，设计两条荧光染料标记的寡核苷酸探针，同时与CaMV35S启动子或终止子片段特异性地杂交。
在第(6)步中，利用荧光互相关谱来检测同时杂交了两条荧光探针的CaMV35S启动子或终止子片段。
实现所述方法的装置主要包括激光器、滤光片、分色镜、针孔、显微镜物镜、检测样品池、光纤、雪崩二极管、相关卡、计算机，其中入射激光经过主分色镜反射，然后通过一高数值孔径的物镜聚焦后激发待检测样品，再利用同一物镜收集荧光，经过第二级分色镜分束后，不同波长的荧光分别经过滤光片过滤和小孔限制后，进入收集光纤，光纤与雪崩二极管连接，经过相关卡做互相关处理，结果在计算机上输出。
本发明的基本原理为根据绝大多数转基因植物种都采用了CaMV35S启动子或终止子，针对其设计两条寡核苷酸探针进行检测，例如，其中一条标记罗丹明绿(Rhodamine Green)，另一条标记Cy5。提取转基因物种基因组DNA，经过两种限制性内切酶，例如可以用Fok I和BsrD I两种限制性内切酶对CaMV35S启动子进行酶切并回收目的片断，加入两种探针与目的片断杂交。最终使只有同时杂交上两种荧光标记探针的目标序列才能被检测到。在荧光互相关谱技术中[1]，针对两种荧光探针选择两种合适的激光波长和功率，并设定测量时间，然后激发样品，同一个探测区域中不同波长的荧光分别被两个通道探测器同时记录，最后对这两个通道的信号做互相关函数分析。如果两种荧光分子的混合物没有发生相互作用，它们将分别独立做扩散运动，互相关函数的幅值将为零；相反，当一个粒子同时标记两种荧光分子，它将同时发出两种荧光波长，对荧光信号做互相关运算后，函数的幅值将不为零，利用这种方法，最终使只有同时杂交上两种荧光标记探针的目标序列才能被检测到。
本发明与现有技术相比具有如下优点(1)荧光互相关谱技术可以对待测样品进行准确的检测。
(2)两条荧光标记探针与待测样品进行杂交，不仅可以提高检测的灵敏度，而且可以提高检测的特异性。
(3)荧光互相关谱技术检测灵敏度很高，可实现单分子的测量，并且可以有效地去除PCR中假阳结果对检测结果的干扰。
(4)非PCR检测待测样品，可以排除PCR操作的复杂性。
(5)该技术操作方便，安全，没有同位素等有害物质的使用。
(6)该技术检测样品所需时间少，大约10秒一个样品，可实现高通量转基因物品检测。
图1是本发明装置结构图；图2是图1装置的激发体积校准图，其中图2-1为Rhodamine G荧光染料溶液的自相关函数曲线，图2-2为Cy5荧光染料溶液的自相关函数曲线；图3是图1装置的灵敏度测试图；图4是实施例中用本发明方法检测转基因烟草中CaMV35S启动子和非转基因烟草的荧光互相关信号对照图，其中图4-1中的样品为转基因烟草(K306-2)，图4-2中的样品为非转基因烟草(花叶青))。
具体实施例方式
图1给出了对转基因物种非PCR扩增直接检测的方法及装置，所述装置包括激光器1、主分色镜2、显微镜物镜3、检测样品池4、二级分色镜5、滤光片6、透镜7、针孔8、光纤9、雪崩二极管10、相关卡11、计算机12等，其中入射激光经过主分色镜反射，然后通过一高数值孔径的物镜聚焦后激发待检测样品，再利用同一物镜收集荧光，经过第二级分色镜分束，不同波长的荧光分别经过滤光片过滤和小孔限制后，进入收集光纤，光纤与雪崩二极管连接，最后经过相关卡做互相关处理，结果在计算机上输出。
实施例将上述装置应用于转基因烟草的检测转基因烟草中都含有CaMV35S启动子。
(1)提取非转基因烟草(花叶青)，转基因烟草DNA(K306-2)。
(2)用Fok I和BsrD I两种限制性内切酶对样品DNA进行酶切。
(3)在(2)得到的酶切产物中，加入DNA Marker混匀，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段；(4)根据DNA Marker指示的分子量，切下169bp附近的凝胶；(5)用DNA凝胶回收试剂盒将(4)中切下的凝胶纯化回收169bp的DNA片段；(6)用一条标记有罗丹明绿(Rhodamine Green)荧光染料和一条标记有Cy5荧光染料的寡核苷酸探针与纯化DNA片段进行杂交，非转基因样品DNA里面不含有169bp特异性序列，不能与探针杂交。
(7)收集杂交反应后的样品并转入检测样品池中；(8)利用荧光互相关谱检测收集到的杂交样品选取两种合适的激光波长和功率大小，激发样品，测量时间设为10秒钟，对收集到的两种不同波长的发射荧光光强做互相关处理；(9)根据测量结果对待测序列进行定量分析。
如图2所示，图2-1为Rhodamine G荧光染料溶液的自相关函数曲线，图2-2为Cy5荧光染料溶液的自相关函数曲线，根据这两个曲线，可以确定本发明装置采用488nm和633nm波长激光激发时的有效激发体积分别为0.159fL和0.567fL，均小于1fL。
如图3所示，采用荧光相关谱技术对Rhodamine G标记的26bp核酸片段测量，结果表明可以超灵敏地实现单分子探测，测得的平均粒子数为0.553。
如图4所示，根据荧光互相关信号的有无，可以很容易地判断是否为转基因物品。图4-1中互相关函数的拟合幅值为1.125，图4-2中互相关函数的拟合幅值为零。
权利要求
1.一种转基因物种的荧光相关光谱检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)用两种限制性内切酶对样品DNA进行酶切；(2)在(1)得到的酶切产物中加入DNA Marker混匀，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段；(3)根据DNA Marker指示的分子量，切下包含特定长度的CaMV35S启动子或终止子片段在内的凝胶；(4)用DNA凝胶回收试剂盒将(3)中切下的凝胶纯化回收包含CaMV35S启动子或终止子片段在内的特定长度DNA片段；(5)用两条荧光染料标记的寡核苷酸探针与纯化DNA片段进行杂交；(6)用荧光互相关谱检测杂交产物。
2.根据权利要求1所述的转基因物种的荧光相关光谱检测方法，其特征在于在第(1)步中，利用两种限制性内切酶FokI和BsrDI特异性地切割转基因物种中的CaMV35S启动子或终止子。
3.根据权利要求1或2所述的转基因物种的荧光相关光谱检测方法，其特征在于在第(2)步中，将DNA Marker与酶切产物混合后再做电泳，其中DNA Marker的分子量与第(1)步中得到的酶切产物分子量相等。
4.根据权利要求1或2所述的转基因物种的荧光相关光谱检测方法，其特征在于在第(3)步中，将DNA Marker所在位置的凝胶切下用于回收CaMV35S启动子或终止子片段。
5.根据权利要求1或2所述的转基因物种的荧光相关光谱检测方法，其特征在于在第(5)步中，设计两条荧光染料标记的寡核苷酸探针，同时与CaMV35S启动子或终止子片段特异性地杂交。
6.根据权利要求1或2所述的转基因物种的荧光相关光谱检测方法，其特征在于在第(6)步中，利用荧光互相关谱来检测同时杂交了两条荧光探针的CaMV35S启动子或终止子片段。
7.实现权利要求1所述方法的装置，其特征在于主要包括激光器、滤光片、分色镜、针孔、显微镜物镜、检测样品池、光纤、雪崩二极管、相关卡、计算机，其中入射激光经过主分色镜反射，然后通过一高数值孔径的物镜聚焦后激发待检测样品，再利用同一物镜收集荧光，经过第二级分色镜分束后，不同波长的荧光分别经过滤光片过滤和小孔限制后，进入收集光纤，光纤与雪崩二极管连接，经过相关卡做互相关处理，结果在计算机上输出。
全文摘要
本发明涉及用于转基因植物、转基因粮食和转基因食品检测的转基因物种的荧光相关光谱检测方法及其装置。所述方法是利用双基因荧光探针，对转基因物种非PCR扩增直接检测，特点是待测样品不需经过PCR扩增，双基因荧光探针直接与原始DNA样品中的目标片段进行杂交，然后进行荧光相关谱检测，判断待测样品是否含有转基因成分。所述装置包括激光器、滤光片、分色镜、针孔、显微镜物镜、检测样品池、光纤、雪崩二极管、相关卡、计算机等。本发明方法和装置检测灵敏度高、安全、快速、准确、操作简便。
文档编号C12Q1/68GK1657916SQ20051003335
公开日2005年8月24日 申请日期2005年3月3日 优先权日2005年3月3日
发明者邢达, 李军锋, 陈同生 申请人:华南师范大学