专利名称：量子点－转铁蛋白探针标记肿瘤细胞的方法
技术领域：
本发明公开了一种利用量子点-转铁蛋白探针标记肿瘤细胞的方法。
背景技术：
1998年美国科学家S.Nie及其合作者在《Science》杂志(281卷，2016-2018页)上提出了利用荧光纳米量子点(Quantum dots)标记生物分子的方法。他们在ZnS包裹CdSe的量子点表面上修饰转铁蛋白，制得量子点-转铁蛋白探针，然后他们证实可以应用量子点-转铁蛋白探针在肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体作用下来标记肿瘤细胞。他们的标记方法主要是将培养好的细胞投入量子点-转铁蛋白探针中过夜，经过洗脱没有标记上的量子点后将细胞移出培养皿，然后在盖玻片上进行成像检测。
结果他们标记以后的细胞，量子点在细胞里面出现打团(aggregate或者cluster)的现象，造成量子点所发荧光都集中在一起，不能充分反映细胞表面和内部分子的功能。究其原因，是因为他们在标记细胞的时候采取将细胞和量子点-转铁蛋白探针共同孵育过夜，然后对细胞进行涮洗然后成像的方法。由于量子点本身的特性使得其在离开其本来缓冲体系的细胞培养基中时间过长的时候，容易出现自身打团的现象，量子点打团以后，量子点-转铁蛋白探针与细胞表面受体结合的活性点将大幅度减少，量子点-转铁蛋白探针不能够与细胞表面的受体分子进行充分接触，探针进入细胞以后的可移动性下降，更加剧了其出现打团的现象。
实践中，对细胞实现分散的单分子标记是细胞标记的根本目的，也只有这样科学家才能搞清楚分子与细胞表面受体的相互作用和在细胞内的运动情况，只有这样才能反映细胞表面及内部分子的分布和功能情况，也只有这样才能发挥量子点标记的最大长处。所以，他们的标记方法和过程仍然有待改进。
发明内容
本发明的目的就是公开一种量子点-转铁蛋白探针标记肿瘤细胞的方法，在量子点-转铁蛋白探针对细胞标记以后在细胞内均匀分布，获取被标记肿瘤细胞的纳米结构十分便利。
本发明的肿瘤细胞量子点-转铁蛋白探针标记及纳米结构的获取方法是通过如下技术方案下实现的先利用链霉亲和素化的ZnS包裹CdSe的量子点与生物素化的转铁蛋白制备好探针，然后将HepG2肝肿瘤细胞经过细胞培育，植入培养板，再加入制备好的探针进行标记，而后在一定的标记时间点进行共聚焦显微镜成像。
本发明的肿瘤细胞量子点-转铁蛋白探针标记方法，由于在标记细胞时控制了标记反应时间，既避免了量子点由于本身特性造成的在细胞培养基里出现打团的情况，同时又能够使得量子点-转铁蛋白探针充分与细胞表面受体作用，然后在细胞表面受体介导下进入细胞，实现对细胞的标记，使探针标记后能在细胞内均匀分布，取得肿瘤细胞的纳米结构十分方便。
图1是用现有技术的量子点-转铁蛋白探针标记肿瘤细胞方法标记后的细胞结构成像照片；图2是用本发明的量子点-转铁蛋白探针标记肿瘤细胞方法标记后的肿瘤细胞结构成像照片。
具体实施例下面结合实施例就本发明作进一步的描述。本发明可以选择所需的如下试剂及器材1、肿瘤细胞选用广州中山大学医学院细胞冻藏中心提供的HepG2肝肿瘤细胞。
2、细胞培养试剂培养基RPMI 1640(Roswell Park Memorial Instute1640，RPMI 1640，美国GibcoBRL公司)、新生牛血清(Newborn Bovine Serum，NBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)。细胞培养在美国Forma公司生产的3111型CO2培养箱中进行，CO2浓度为5％，温度为37℃。
3、量子点和转铁蛋白链霉亲和素化的ZnS包裹CdSe的量子点(发射光605nm，购自美国量子点公司)，生物素化的转铁蛋白购自美国Molecular Probes公司。
4、共聚焦显微镜为美国BIO-RAD生产的MRC600型显微镜。
具体的实施步骤为1、量子点—转铁蛋白探针的制备链霉亲和素化的ZnS包裹CdSe的量子点与生物素化的转铁蛋白藕联孵育后制成量子点探针将47ng/ml的转铁蛋白400μl与20nmol的400μl链霉亲和素化的ZnS包裹CdSe的量子点(QDs)，在4℃下避光孵育30分钟以上，制得量子点—转铁蛋白探针探针。
2、量子点-转铁蛋白探针标记细胞(1)细胞的培养将HepG2肝肿瘤细胞用含10％新生牛血清的RPMI1640培养液培养2~3天后(HepG2肝肿瘤细胞在培养液中的密度保持约1×105个/ml)，再用0.25％的胰酶消化1~3分钟后，再用无血清的RPMI1640培养液调整HepG 2肝肿瘤细胞密度至1×105个/ml，用于量子点标记；(2)细胞的量子点标记取出步骤1中制得的细胞悬液加入在六孔板中，然后加入上述量子点—转铁蛋白探针，其中每毫升细胞悬液加入200μl量子点—转铁蛋白探针，于37℃、5％CO2环境中培养约150分钟，完成标记；3、标记后肿瘤细胞纳米结构的观测(1)将探针标记150分钟后的细胞取出，进行初步3000转/分离心3至5分钟，去除培养基；然后将4％的多聚甲醛(甲醛)溶液50μl加入1ml细胞中，制备细胞悬液；(2)将步骤(1)中制备的细胞多聚甲醛(甲醛)悬液再次进行3000转/分离心3分钟，进一步去除培养基和非特异性结合的蛋白和量子点；
(3)将步骤(2)中离心好的细胞悬液滴加到盖玻片上，在氮气下或空气中烘干至表面无水分为止；(4)将步骤(3)中得到的固定好的样品直接在共聚焦显微镜下观察，获取标记以后细胞的荧光图像。
实验结果从图1、图2中可见，图1中的亮点尺寸大，表明量子点标记之后在细胞中有一定程度的成团，对细胞纳米结构的标记效果较差，不利于对细胞进行纳米结构观测分析。图2中的标记荧光十分均匀地分部在所标记的细胞部位，从而能十分清晰地显现该部位的纳米结构图像。由于使用本发明的肿瘤细胞标记方法，较好地控制了标记时间，尽可能地避免量子点自身的打团但又保证了充足的探针与细胞的作用时间。同时控制探针的浓度、细胞的密度、以及探针与细胞的浓度比，不会使得探针出现过量或者量不够的情况，使得探针能够充分与细胞表面受体反应，使其在细胞表面受体的介导下进入细胞，实现对细胞的均匀标记。
共聚焦显微镜观察表明，通过本发明的量子点-转铁蛋白探针标记肿瘤细胞的方法标记的细胞的结果，不会出现量子点在细胞内打团的现象，量子点发光分布较为均匀分布。量子点的发光在细胞内部呈现中间较亮周围较淡的情况，这是因为量子点-转铁蛋白探针被细胞内吞进入细胞中部的所造成的，这个结果是跟肿瘤细胞的转铁蛋白受体的功能相吻合的，这证实了标记的结果是可靠的。同时发现，这种方法甚至可以实现对直径非常小的细胞伪足的标记而不出现量子点打团的现象，可见量子点与细胞表面的受体分散结合得非常好，充分体现了量子点在纳米水平上标记的优势。
由于链霉亲和素和生物素天然的高亲和力和高稳定性结合，所以制得的量子点-转铁蛋白探针非常稳定。由于这一反应不用引入外界其他化学物质，因此没有一些额外的化学物质对细胞产生污染，对细胞非常友好。
本发明的量子点-转铁蛋白探针，探针有制备只涉及调节两种反应物的浓度和反应时间和反应温度等简单的参数，在制备探针的时候可以实现快速制作，甚至可以即制即用，非常方便生物学家们的工作。
权利要求
1.一种量子点-转铁蛋白探针标记肿瘤细胞的方法，其特征是所述的标记方法的具体步骤为(1)量子点-转铁蛋白探针的制备将47ng/ml的转铁蛋白400μl与20nmol的400μl链霉亲和素化的ZnS包裹CdSe的量子点，在4℃下避光孵育30分钟以上，制得量子点-转铁蛋白探针探针；(2)细胞的培养将HepG2肝肿瘤细胞用含10％新生牛血清的RPMI1640培养液培养2~3天后，再用0.25％的胰酶消化1~3分钟后，用无血清的RPMI1640培养液调整HepG 2肝肿瘤细胞密度至1×105个/ml，用于量子点标记；(3)细胞的量子点标记取出步骤1中制得的细胞悬液加入在六孔板中，然后加入上述量子点-转铁蛋白探针，其中每毫升细胞悬液加入200μl量子点-转铁蛋白探针，于37℃、5％CO2环境中培养约150分钟，完成标记。
全文摘要
本发明公开了一种量子点－转铁蛋白探针标记肿瘤细胞的方法。包括链霉亲和素化的ZnS包裹CdSe的量子点与生物素化的转铁蛋白的藕联孵育制作探针、细胞培养、探针标记等步骤。用链霉亲和素化的量子点和生物素化的转铁蛋白的高度特异性结合能力，可以实现探针的方便快速稳定制作，无其它化学物质对细胞产生污染，量子点在细胞内部发光均匀分散，获取图像便利。
文档编号C12Q1/04GK1699593SQ20051003397
公开日2005年11月23日 申请日期2005年4月6日 优先权日2005年4月6日
发明者蔡继业, 曾谷城, 潘运龙, 严林 申请人:暨南大学