专利名称：抗SARS－Cov S抗原的人抗体重链和轻链可变区基因、多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗SARS-Cov S抗原片断的人抗体的重链和轻链可变区基因和多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断或治疗SARS-COV及其炎症方面药物中的应用。
背景技术：
严重呼吸窘迫综合症(SARS)常常是致命性的呼吸道疾病，该疾病由新的SARS冠状病毒引起。2002-2003年，该疾病在世界范围内流行，此后，可能是因为与携带病毒的动物接触，在我国南部持续出现散在的病例。今年，在我国出现了两个实验室感染的病例并在公众中传播，引发了大范围的病源追踪，病源接触者的隔离以防止新的流行。所以，通过主动或被动免疫以控制SARS冠状病毒感染的方法迫切需要。
被动性免疫已经被证实是对病毒性疾病有效而安全的治疗策略。研究表明SARS病人恢复期血清中存在高滴度的保护性IgG抗体，并且恢复期血清能帮助临床病人改善症状，这说明用人单抗进行被动性免疫能治疗SARS疾病。SARS病毒基因组是无节段的单链正链RNA，30kb，是最长的RNA病毒。5′端有甲基化的帽子结构，3’端有多聚(A)尾，直接有mRNA的功能，具有感染性。基因组主要编码病毒多聚酶、糖蛋白(S)、膜蛋白(M)、核蛋白(N)以及一些非结构蛋白。S蛋白(Spike protein)由两个domain组成，靠近N端的部分形成一个球状的domainS1，靠近C端的部分形成一个穿膜的棒状结构S2。对已知冠状病毒的研究已经证明，S蛋白和冠状病毒侵入细胞的过程密切相关。其中S1主要参与同宿主细胞膜受体的结合，其受体可能为血管紧张素酶2(ACE2)。S2主要参与病毒与靶细胞的膜融合。此外，S抗原也是冠状病毒主要的抗原位点。
根据SARS的病毒生命周期其治疗药物可分为1.中和性抗体，受体阻断剂主要针对病毒的结合和侵入2.反义寡核苷酸、核酶针对病毒细胞质释放和脱壳3.蛋白酶抑制剂针对蛋白加工4.解旋酶抑制剂针对RNA复制5.干扰肽、干扰蛋白质针对病毒的装配与包装6.α-葡萄糖苷酶抑制剂针对病毒粒子的成熟。靶向S蛋白主要是产生拮抗病毒侵入的中和性抗体。事实上，国外报道的保护性抗体基本上都是靶向S抗原的。
自1975年Kohler和Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体相继出现，这些单克隆抗体不仅在疾病的基础研究方面发挥了积极的作用，同时也为多种疾病的诊治带来了新的希望。但是，由于鼠源性抗体对于人体来说是一种异种蛋白，在临床长期使用后必然会在患者中引起人抗鼠抗体反应(HAMA反应)而加速单抗在血液中的消除速度，甚至危及患者的生命，为了解决这一问题，Winter等在1994创建了噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，而且不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体。该技术首先构建出囊括天然全套抗体基因的抗体文库，然后将抗体基因表达在噬菌体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛(panning)，在数日内就可筛选出阳性克隆，从而能研制任何一种具有高度特异性的抗体。
发明内容
本发明的一个目的在于提供抗SARS-Cov S抗原的人抗体的重链和轻链可变区基因及其编码的多肽，其重组后可表达出特异性识别和结合SARS-Cov S抗原的抗体活性片段。
本发明的另一目的在于所述抗体基因或多肽在诊断或治疗SARS-Cov及其炎症方面药物中的应用。
根据本发明的一个方面，本发明涉及抗SARS-Cov的重链和轻链可变区基因。本发明所述的抗SARS-Cov的重链和轻链可变区基因是从多个SARS病人恢复期血淋巴细胞所构建的抗体库中用表达的S抗原片段筛选获得。获得1株人源Fab阳性克隆，为2g7。经过序列测定和在NCBI中BLAST比较分析后，确认所述的重链可变区的核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>3所示。所述的轻链可变区基因核苷酸序列如序列表中<400>2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>4所示，上述基因经重组后可表达出特异性识别和结合SARS病毒刺突蛋白S片断的人源Fab抗体活性片段。
对于本发明人成功克隆的抗体轻、重链可变区基因，分别应用因特网上专业性的已知抗体基因序列数据库(IMGT)和(NCBI)对所得序列进行同源性比较和其胚系基因来源分析表明，所获得的基因序列的确来自人胚系基因，和现有报道的各种抗体基因序列均不完全一致。所得VH与VL基因可编码正确的人抗体可变区。
根据本发明的另一个方面，本发明还涉及所述抗体的基因及其编码的多肽在制备用于诊断和治疗SARS-Cov及其炎症药物中的应用。本发明首次运用噬菌体表面呈现技术，从多个SARS病人恢复期血中获得淋巴细胞，通过基因工程手段，构建了人源抗SARS病毒基因工程抗体文库，抗体文库的容量在6.2×107左右。用表达的S抗原对抗体文库进行筛选，成功地获得1株与SARS-CovS抗原片断结合的特异抗SARS病毒基因工程Fab抗体，能识别SARS S抗原线性位点，为SARS抗体药物研究提供了新的途径。基于上述的轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达成多种形式的小分子基因工程抗体，如Fab抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白等，制备用于诊断或治疗SARS-Cov及其炎症方面的药物。人源抗SARS病毒基因工程抗体的获得，将对SARS疾病的特异性预防，治疗和诊断提供新的途径。
本发明首次运用噬菌体表面呈现技术，从多个SARS病人恢复期血中获得淋巴细胞，通过基因工程手段，构建了人源抗SARS病毒基因工程抗体文库，抗体文库的容量在6.2×107左右。用表达的S抗原对抗体文库进行筛选，成功地获得1株与SARS-Cov S抗原片断结合的特异抗SARS病毒基因工程Fab抗体，能识别SARS S抗原线性位点，为SARS抗体药物研究提供了新的途径。基于上述的轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达成多种形式的小分子基因工程抗体，如Fab抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白等，制备用于诊断或治疗SARS-Cov及其炎症方面的药物。人源抗SARS病毒基因工程抗体的获得，将对SARS疾病的特异性预防，治疗和诊断提供新的途径。
图1Western blot检测阳性Fab抗体与抗原结合图2抗SARS-Cov S抗原人Fab抗体2g7重链可变区基因的测序图谱图3抗SARS-Cov S抗原人Fab抗体2g7轻链可变区基因的测序图谱图4抗SARS-Cov S抗原人Fab抗体2g7抑制S抗原与ACE2的结合具体实施方式
(一)抗SARS-COV S抗原人Fab抗体2g7的筛选1.人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建人外周血取自曾患SARS的健康人血中，分离淋巴细胞，用Trizol(Gibco)提取细胞总RNA。用美国Gibco-BRL公司的第一链合成试剂盒进行cDNA合成。使用特异性的重链Fd引物(25对)和轻链(L)引物(λ链20对、κ链6对)(如表1、表2)进行扩增。PCR扩增条件为94℃ 5min，94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 2min，35个循环后，72℃ 10min。构建成库容量为6.2×107的免疫Fab噬菌体抗体库，经酶切鉴定重组率为75％。
重链Fd引物5’端引物IgHV1/35’G(C)AG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGIgHV2 5’CAG GTC ACC CTC GAG GAG TCT GGIgHV4 5’CAG GTG CAG GTG CGC GAG TCG GGIgHV5-75’G(C)AG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGIgHV6 5’CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG3’端引物IgM 5’GG ACT AGT GGC AAT CAC TGG AAG AGG CACIgG15’GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGGIgG25’CTC GAC ACT AGT TTT GCG CTC AAC TGT CTTIgG35’TGT GTG ACT AGT GTC ACC AAG TGG GGT TTTIgG45’GCA TGA ACT AGT CGG GGG ACC ATA TTT GGA表1重链Fd引物轻链(L)引物5’端引物IgKV1/4 5’GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CC
IgKV2A 5’GAT ATT GAG CTC ACC CAG ACT CCAIgKV2B 5’CAT GTT GAG CTC ACT CAG CTC CCIgKV3A/55’GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCAIgKV3B/65’GAA ATT GAC CTC ACA CAG TCT CCAIgKVC 5’A GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CIgLV1A 5’CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCIgLV1B 5’CAG TCT GAG CTC ACT CAG CCA CCIgLV2 5’GG GCC CAG TCT GAG CTC ACT CAG CCIgLV3A 5’TCC TAT GAG CTC ACT CAG CCA CIgLV3B 5’TCT TCT GAG CTC ACT CAG GAC CCIgLV4A 5’GG GCC CAG TCT GAG CTC ACT CAA GCIgLV4B/55’CAG CCT GAG CTC ACT CAG CCG TCIgLV5 5’CAG CCT GAG CTC ACT CAG CCA CCIgLV6 5’AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CACIgLV7/8/9/10/115’CAG GCT GAG CTC ACT CAG GAG CC3’端引物IgK 5’T CCT TCT AGA TTA CTA ACA CTC TCC CCT GGT GAA GCT CTT TGTGAC GGG CGA ACT CIgL15’G GTC TAG AAC CTA TGA ACA TTC TGT AGG GGIgL25’G GTC TAG AAC CTA AGA GCA TTC TGC AGG GG表2轻链(L)引物2.人源抗SARS病毒抗体库的富集筛选筛选抗原为原核表达的S抗原片断，用pH8.6碳酸盐缓冲液稀释，包被96孔酶标板。经3轮富集筛选后，用Phage-ELISA的方法筛选阳性克隆。用原核表达并纯化的S抗原对抗体库进行筛选，经3轮筛选后随机挑取288个克隆，行Phage-ELISA检测。
3.Phage-ELISA随机挑选288经4次富集筛选后的单菌落，37℃振摇过夜。次日1∶100转接于新的200ul 2YT(Amp、Tet)培养基中，37℃振摇2.5小时，用M13K07超感染，3500转，离心10min，用200ul 2YT(Glu、Amp、Kan)重悬细菌沉淀，30℃振摇过夜，次日11000转离心15min，取上清进行鉴定。以原核表达的S抗原片断包被ELISA板，加入上清，以HRP标记羊抗pVIII蛋白抗体(Pharmacia)为二抗，TMB显色，M13K07做阴性对照，SARS病人恢复期血清做阳性对照。
对抗体库进行筛选获得1株人源Fab阳性克隆，为2g7。上述微生物菌种经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No1273，筛选检测结果见表2。
clone OD值(450nm)2g7 1.135negtive control 0.446positive control2.216表2 Phage-ELISA检测阳性Fab抗体与抗原结合4.人源Fab抗体的表达将阳性克隆37℃培养过夜，次日以1∶50的比例转接至3ml 2YT(Amp、Tet)培养基，37℃培养至OD600＝0.2～0.3时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，30℃诱导表达10h～12h。4℃4000r/min离心菌体15min，用1/10菌液体积的20mmol/L PBS(pH7.4)重悬菌体，反复冻融3次，4℃ 1000r/min离心20min，上清用ELISA，Western blot进行和抗原结合的检测。
5.ELISA检测Fab抗体与SARS-cov S抗原结合活性用0.1mol/L NaHCO3(pH9.6)溶液包被纯化的SARS-cov S蛋白片断(5μg/ml，每孔100μl)，4℃过夜；4％脱脂奶封闭，37℃1h，加入表达的Fab抗体，37℃1h；加入酶标抗人Fab二抗(Sigma公司，1∶4000稀释使用)，37℃1h；TMB显色液显色，2mol/L H2SO4终止反应，酶标仪检测吸光度A值。并检测其于OVA、BSA、胃蛋白酶、HBsAg等蛋白有无交叉反应，XL1-blue菌裂解液为阴性对照，PBS为空白对照，SARS病人恢复期血清做阳性对照。
对9株人源Fab抗体阳性克隆进行鉴定。结果显示，这9株克隆对抗原均有较好的结合(表3)，与OVA，BSA、胃蛋白酶、HBsAg无交叉。
胃蛋白clone S HBSAg 酶 BSA OVA
2g7 1.0860.0180.0160.0320.022细菌裂解液 0.0460.0140.0230.0430.045阳性血清 2.0040.0220.0150.0320.024PBS 0.0260.0120.0150.0120.021表3间接酶联免疫检测阳性Fab抗体与抗原结合6.Western blot检测抗原为纯化的SARS-cov S蛋白片断。抗原进行SDS-PAGE电泳，将蛋白质电转移到NC膜上。用5％脱脂奶室温封闭NC膜2h。一抗选用Fab表达产物，室温反应1h。1×PBST洗涤3次后，与HPR标记的抗人Fab(Sigma公司，1∶1000使用)室温反应1h。1×TBST洗涤3次后，用ECL化学发光试剂盒(Pierce)检测。
结果显示2g7人源Fab抗体能与S抗原结合，而XL1-blue细菌裂解物与S抗原不结合(图1)。
7.对阳性克隆进行测序，结果如图2、38.进一步对所克隆的抗SARS-cov S抗原人轻、重链可变区基因进行序列分析如下分别应用下列二个数据库http//imgt.cines.fr8104/cgi-bin/IMGTdnap.jvhttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi对所得序列与现有已报道的其它各种抗体基因进行同源性比较，并分析其胚系基因来源，结果如下(1)2g7重链<400>1的胚系基因来源V-GENEM99660 IGHV3-23*01D-GENEIGHD4-17*01J-GENEX86355 IGHJ4*02通过FR-IMGT and CDR-IMGT分析显示CDR1GGA TTC ACC TTT AGC AGC TAT GCCCDR2ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACACDR3GCG AAA GCA ACT ACG GTG ACT ACT TAC TTT GAC TAC
NCBI中同源性比较结果显示RID1098944896-19848-156574034938.BLASTQ4Query＝(684 letters)DatabaseAll GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，environmental samples or phase 0，1 or 2 HTGS sequences)2,655,401 sequences；12,045,272,748 total letters>gi|11275299|dbj|AB027433.1|Homo sapiens mRNA for anti TNF-alphaantibody heavy-chain Fab fragment，partial cds，clone1D5-mk29HLength＝669Score＝781bits(394)，Expect＝0.0Identities＝476/500(95％)，Gaps＝5/500(1％)Strand＝Plus/Plus(2)2g7轻链<400>3的胚系基因来源V-GENEX63403 IGKV2-30*01J-GENEZ70260 IGKJ2*02通过FR-IMGT and CDR-IMGT分析显示CDR1CAA GGC CTC GTA TAC AGT GAT GGA AGA ACT TACCDR2GAG GTT TCTCDR3ATG CAA GGT ACA CAC TGG CCG TAC ACCNCBI中同源性比较结果显示RID1098942365-28440-80052642193.BLASTQ4Query＝(669 letters)DatabaseAll GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，environmental samples or phase 0，1 or 2 HTGS sequences)2,655,401 sequences；12,045,272,748 total lettersgi|21669408|dbj|AB064101.1|Homo sapiens IGK mRNA for immunoglobulinkappa light chain VLJregion，partial cds，cloneK60Length＝829Score＝1057bits(533)，Expect＝0.0
Identities＝622/652(95％)，Gaps＝6/652(0％)Strand＝Plus/Plus上述分析结果表明所获得的单抗2g7基因序列的确来自人胚系基因，和现有报道的各种其它已知抗体基因均不完全一致，是属于一种新的有功能的针对SARS-COV的抗体基因。
(二)抗SARS-Cov人单抗2g7轻、重链可变区基因及其编码的多肽产物在制备用于诊断或治疗SARS-Cov炎症方面药物中的应用。
有文献报道血管紧张素转换酶2(ACE2)为SARS病毒S抗原的受体，我们使用抗体2g7可以抑制ACE2与S抗原的结合，从而证实2g7有潜在的抑制病毒入侵宿主细胞的作用，结果如图4所示。具体方法为将重组的ACE2以2ug/ml包被ELISA板过夜，5％脱脂奶粉封闭，加入S抗原及倍比稀释的2g7抗体(起始浓度为1mg/ml)，37℃ 1h，加入抗S抗原末端his标签的抗体，37℃ 1h后，TMB显色，阳性对照为SARS病人恢复期血清，阴性对照为无关抗体。
以本发明所述的轻、重链可变区基因出发，可以重构并表达成多种形式的蛋白药物，可直接用于抗SARS-Cov炎症的诊断及治疗。例如小分子抗体。主要有由VH-CH1和VL-C1组成Fab抗体、用一多肽(GLy4Ser)3接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等；多价微型抗体。主要有双链抗体、(ScFv)2、Flex微型抗体、LD微型抗体、F(ab’)2、F(ab’)3、(ScFv)4等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，既能穿透组织，亦在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值；双特异性抗体。是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体；重组抗体融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有把特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白；重组免疫毒素。将编码抗体和毒素的基因重组而产生，特点是高效，非特异毒性低，体内稳定性好；人源性全抗。主要有由VH-CH和VL-C1组成完整抗体。
序列表<110>陈志南<120>抗SARS-Cov S抗原的人抗体重链和轻链可变区基因、多肽及其应用<160>4<210>1<211>357<212>DNA<213>人<220>
<221>V_region<222>(1)...(357)<400>1GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG 48TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC AGC TAT 96GCC ACG ACC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC 144TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG 192AAG GGC CGG TTC ACC ATC CCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT 240CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TGC TGT 288GCG AAA GCA ACT ACG GTG ACT ACT TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA 336ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 357<210>2<211>119
<212>PRT<213>人<220>
<221>V_segment<222>(1)...(119)<400>2Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 16Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 32Ala Thr Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 48Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 64Lys Gly Arg Phe Thr Ile Pro Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Cys Cys 96Ala Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 112Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 119<210>3<211>336<212>DNA<213>人<220>
<221>V_region<222>(1)...(336)<400>3GCG GCC GAG CTC ACT CAG TCT CCA CTC TCC CTG CCC GTC ACC CTT GGA 48CAG TCG GCC TCC ATC TCC TGC AGG TCC AGT CAA GGC CTC GTA TAC AGT 96
GAT GGA AGA ACT TAC ATG AGT TGG TAT CAG CAG AGG CCA GGC CAA TCT 144CCT AGG CGC CTA ATT TAT GAG GTT TCT AAT CGG GGC TCT GGG GTC CCA 192GAC AGA TTC AGC GGC GGT GGA TCA GGC ACT GAT TTC ACA CTG AAA ATC 240AGC AGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GCA ACT TAT TAC TGC ATG CAA GGT 288ACA CAC TGG CCG TAC ACC TTT GGC CAG GGG ACC AGG TTG GAG ATC AAA 336<210>4<211>112<212>PRT<213>人<220>
<221>V_segment<400>4Ala Ala Glu Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly16Gln Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Gly Leu Val Tyr Ser32Asp Gly Arg Thr Tyr Met Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser48Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro64Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Gly96Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 11权利要求
1.抗SARS-CovS抗原片断的人抗体重链可变区基因，其具有序列表<400>1的序列，轻链可变区基因，其具有序列表<400>3的序列。
2.由权利要求1所述的基因编码的多肽，其具有序列表<400>2和<400>4的序列。
3.权利要求1所述的基因在制备用于诊断或治疗SARS-Cov及其炎症方面药物中的应用。
4.权利要求2所述的多肽在制备用于诊断或治疗SARS-Cov及其炎症方面药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及抗SARS－Cov S抗原片断的人抗体的重链和轻链可变区基因、多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断或治疗SARS－Cov及其炎症方面药物中的应用。所述的重链可变区基因，其具有序列表<400>1的序列，轻链可变区基因，其具有序列表<400>3的序列。上述基因编码的多肽，其具有序列表<400>2和<400>4的序列。本发明运用噬菌体表面呈现技术，成功地获得1株人源Fab2g7的轻重链基因。基于上述的轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达成多种形式的小分子基因工程抗体，如Fab抗体、F(ab)
文档编号C12N15/13GK1664100SQ200510041680
公开日2005年9月7日 申请日期2005年2月4日 优先权日2005年2月4日
发明者陈志南, 李郁, 姚西英, 宋斐, 张思河, 包国强, 蒋建利 申请人:陈志南