专利名称：马蔺液泡膜Na的制作方法
技术领域：
本发明涉及马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因(IINHX2)，属于生物技术领域。
背景技术：
植物消除Na+毒害的策略包括降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的区隔化。Na+吸收是一个复杂的过程。Na+的外排和区隔化是间接的主动运输过程，主要由Na+/H+逆向转运蛋白来调节。Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+antiporter or exchanger，NHA or NHE)是细菌、酵母、藻类、动物和高等植物的膜系统上普遍存在的一种转运蛋白，参与细胞质内的pH、Na+浓度调节及细胞体积变化等生命活动。自1985年Blumwald和Plooe首先在甜菜根部贮藏组织的液泡膜上发现Na+/H+逆向转运活性以来，人们相继发现在盐生植物如滨藜、兼性CAM植物冰叶日中花、甜菜等和较耐盐的甜土植物如大麦、海滨车前、长春花、棉花、向日葵等的液泡膜上普遍存在着Na+/H+逆向转运活性。Nass等在酵母的前液泡膜(prevacuole)上也发现了一种Na+/H+逆向转运蛋白。大量实验表明Na+/H+逆向转运活性的有无和高低与植物和酵母的耐盐性密切相关，在高盐浓度下植物和酵母可以分别通过质膜和液泡膜上的Na+/H+逆向转运将Na+运出细胞和将Na+区域化在液泡内，维持细胞质内Na+稳态和Na+/K+比相对稳定，以适应盐渍环境。耐盐植物能够通过Na+/H+逆向转运蛋白将大部分Na+区域化到液泡中，因而既能避免离子胁迫，又能进行渗透调节。因此Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性中的作用已越来越受到重视。目前人们已经从细菌、酵母、动物和高等植物中相继获得了编码Na+/H+逆向转运蛋白的基因。
把编码液泡膜上Na+/H+逆向转运蛋白的基因(如拟南芥的AtNHX1与酵母的NHX1等)转化到盐敏感植物中，并使其在液泡膜上过量表达以提高植物耐盐性，是可行的植物基因工程策略。已在拟南芥、番茄、甜菜等植物获得高耐盐的转基因植株。
马蔺是一种盐生植物，马蔺最突出的特点就是能在其他高产作物不能生长的重盐碱土上种植。目前有关马蔺液泡膜上Na+/H+逆向转运蛋白2的基因及其在植物转基因工程育种中的应用还没有报道。
发明内容
针对目前还没有报道耐盐碱的马蔺NHX基因及其在植物转基因育种工程技术中得到应用的现状，本发明提供一种马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因、重组载体及植物转基因育种方法，将马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因构建在植物表达的转化质粒上，转化小麦获得转基因植株。
本发明所提供的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因(IINHX2)，具有如SEQ IDNO.1所示的序列ATGGGGTCTG GTATGGAGGA TCTGCTGGTG AGGCTGGGTG TCGTGTCGTC CACCTCCGAC 60CATGCCTCCG TGGTCTCCAT CAACCTCTTC GTAGCTCTCC TCTGCGCATG CATAGTCATC120GGACACCTCC TGGAGGAGAA TAGATGGATG AACGAGTCCA TCACCGCTCT AGCCATCGGG180TTGTGCACTG GCGTTGTGAT TCTTCTGACG ACAAATGGGA AGAGCTCTCA TATATTCGTA240TTCAGCGAAG ATCTCTTCTT CATCTACCTC CTCCCTCCAA TCATCTTCAA CGCCGGGTTT300CAAGTAAAAA AGAAACAATT TTTCCGCAAC TTCATGACAA TTATGCTGTT TGGTGCAGTT360GGGACCCTCA TCTCCTTTGT CATAATTTCT CTTGGTGCAA TTGGTTTATT CAGAAAAATG420
AACATAGGTC CACTGGAAGT TGGAGATTTT CTTGCAATTG GGGCAATCTT TTCTGCAACA 480GATTCTGTTT GCACCTTGCA GATTCTTAAC CAGGATGAAA CACCATTATT ATATAGCTTG 540GTCTTTGGTG AGGGAGTTGT CAATGATGCC ACATCAGTGG TGCTTTTCAA CGCAATACAA 600AACTTCGATC TTGAACATAT TGATGCAGGC ATTGCAGCAA AATTTATTGG AAATTTCTTT 660TATTTATTTG TCAGCAGCAC CTTCTTGGGA GCATTTGCTG GATTGCTTAG TGCGTATATC 720ATAAAAAAGT TGTATTATGG AAGGCATTCT ACTGATCGTG AAGTTGCACT CATGATGCTT 780ATGGCGTACC TTTCATATAT GCTGGCTGAG CTGTTAGATC TAAGTGGTAT CCTCACGGTT 840TTCTTCTGCG GCATAGTAAT GTCCCATTAT ACGTGGCACA ATGTGACAGA GAGTTCGAGA 900GTCACAACCA AGCATGCTTT TGCAACCTTG TCATTTATTT CGGAGATATT CCTCTTCCTT 960TATGTTGGCA TGGATGCATT AGACATTGAA AAGTGGAGAT TTGTCAGCGA CAGTCCTGGG 1020AAATCAATTG GTGTTAGCGC AATCATAATT GGTTTAGTTT TGATTGGAAG AGCAGCTTTC 1080GTCTTCCCGC TGTCTTTCCT ATCCAACTTA GCTAAGAAGT CCCCTAATGA AAAAATCACC 1140TTCAACCAGC AAGTTACCAT ATGGTGGGCA GGTTTGATGA GAGGTGCTGT ATCAATTGCA 1200CTTGCTTACA ATCAGTTCAC AAGAGCTGGT CATACTCAAC TTCCAGGGAA TGCAATGATG 1260ATCACCAGTA CCATCACAGT TGTGCTATTT AGCACTGTGG TATTCGGATT ATTGACAAAG 1320CCTTTGATAA GGCTCCTGTT GCCTCCTAGT ACAAAGCATC TTACCGGCAG TTGCAGTTTC 1380AACTCTGAGC CCTCTACCCC AAAATTTTA TCCGCTGCAC TACTAGAAAA TATTCCAGGA 1440TTTGAAGCAG AAGGAGGAAC AACAAACCTT GGGGCTCGGC CTTCAAGCCT TCGAATGCTC 1500CTTATGAAGC CAACTCACAC GGTTCATTAC TATTGGCGCA AGTTTGATGA TGCTTTCATG 1560CGTCCAATGT TTGGAGGGCG AGGCTTTGTT CCTTTTGTTC CCGGTTCACC TACTGAACAA 1620AGTGTTCATG GATGGGAATG A1641其中，包括与SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％相同性的序列。
马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因(IINHX2)氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示MGSGMEDLLV RLGVVSSTSD HASVVSINLF VALLCACIVI GHLLEENRWM NESITALAIG 60LCTGVVILLT TNGKSSHIFV FSEDLFFIYL LPPIIFNAGF QVKKKQFFRN FMTIMLFGAV 120GTLISFVIIS LGAIGLFRKM NIGPLEVGDF LAIGAIFSAT DSVCTLQILN QDETPLLYSL 180VFGEGVVNDA TSVVLFNAIQ NFDLEHIDAG IAAKFIGNFF YLFVSSTFLG AFAGLLSAYI 240IKKLYYGRHS TDREVALMML MAYLSYMLAE LLDLSGILTV FFCGIVMSHY TWHNVTESSR 300VTTKHAFATL SFISEIFLFL YVGMDALDIE KWRFVSDSPG KSIGVSAIII GLVLIGRAAF 360VFPLSFLSNL AKKSPNEKIT FNQQVTIWWA GLMRGAVSIA LAYNQFTRAG HTQLPGNAMM 420ITSTITVVLF STVVFGLLTK PLIRLLLPPS TKHLTGSCSF NSEPSTPKFL SAALLENIPG 480FEAEGGTTNL GARPSSLRML LMKPTHTVHY YWRKFDDAFM RPMFGGRGFV PFVPGSPTEQ 540SVHGWE 546其中，包括与SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％相同性的序列。
上述马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以构建到原核表达载体中，通过本领域公知的研究方法将马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因导入原核生物，通过诱导，大量表达出马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2。其中，原核表达载体优选原核表达载体pET-24a。
所述马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2可用于研究马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2的结构、功能以及抗体制备。
所述马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以通过微注射、基因枪、农杆菌介导、花粉管通道方法将马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因转入作物和牧草，培育出抗盐品质优良的品种/系。
所述马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以构建到任何基于Ti-质粒双元载体中，通过本领域公知的研究方法将马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因导入农杆菌中，进行农杆菌转化。
所述马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因作为目的基因，构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pBIUbiGFP上；其中有LB和RB的T-DNA25bp重复序列，胭脂碱合成酶基因的启动子P-nos和终止子T-nos，还有在真核生物中作为选择标记使用的nptII，用于选择的抗生素是卡那霉素和G418；在pBIUbiGFP中还有玉米泛素超强启动子Ubi和绿色荧光蛋白GFP基因；马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因插入在pBIUbiGFP质粒的Ubiquitin启动子和GFP基因之间的多克隆位点上，并且与GFP基因形成融合基因，表达一个N末端连有GFP蛋白的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2。
本发明所提供的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因的Ti-质粒双元载体转基因育种方法为1)构建的双元转化重组载体质粒pBIUbiGFPIINHX2转化于农杆菌中，通过农杆菌苗端转化法侵染植物，从而获得转基因植株。优选双元转化重组载体pBIUbiGFPIINHX2转化于农杆菌AGL1中，通过农杆菌苗端转化法侵染小麦，从而获得转基因小麦。其中，根癌土壤农杆菌AGL1是公知公用菌株。
2)转基因株系的检测方法用PCR和SOUTHERN印迹杂交法检测转基因植株叶片中IINHX2基因。
本发明提供了一种马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因及其应用，突破了IINHX2基因还没有在植物转基因工程育种中得到应用的现状，首次将IINHX2基因构建在植物表达的转化质粒，以Ti-质粒双元载体pBIUbiGFPIINHX2转化小麦并且获得了转基因植株，经鉴定转基因植株的耐盐性明显的得到提高。IINHX2基因转基因小麦的T1代植株表现出明显的抗盐性，不同株系的T1代植株在170mM NaCl上的成活率为66％-83％，高于对照中国春(44％)，在170mM NaCl上的成活率为27％-38％，高于对照中国春(0％)。
本方明的转基因重组载体可作为商业用途的品种、品系或作为基因资源在生产上直接使用或进行农业生物育种和转基因植物以提高作物的抗盐性。
图1、马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因Ti-质粒双元载体构建2、马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因简并引物扩增结果其中，1，2分别是不同的模板浓度，M为λDNA的EcoRI+HindIII双切Maker图3、马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因的3’RACE其中，M为100bp Lader，1，2，3代表不同的重复图4、马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因的5’RACE其中，M为100bp Lader，1，2代表不同的重复图5、马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因全长cDNA扩增其中，M为100bp Lader，1，2代表不同的重复图6、转基因T1代的Southern杂交结果其中，MλDNA(HindIII+EcoRI)，B53，B59转基因植株，wt野生型中国春，+质粒pBIUbiGFPIINHX具体实施方式
1.马蔺Na+/H+逆向转运蛋白2基因部分片断的克隆Trizol法提取萌发2周左右的马蔺幼苗的总RNA，PowerScriptTM逆转录酶反转录合成第一链cDNA，用兼并引物P15｀-GAT TCT GTW TGC ACM YTR CAG GT-｀3，P25｀-CAT KAG MCC AGC CCA CCA WAT-｀3进行PCR扩增，获得一扩增片断，克隆测序。
按照下述条件扩增目的基因片段反应体系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA模板250ng，LA GC Taq酶1μl，加水补足到50μl。
反应程序为94℃预变性3min，然后进行36个循环，每一个循环包括94℃变性40s，59℃复性1min，72℃延伸1min。最后保持在72℃下延伸10min。
2.马蔺Na+/H+逆向转运蛋白2基因3｀末端的获得根据马蔺Na+/H+逆向转运蛋白2基因部分片段的序列，设计3’RACE基因特异引物P15’-ACA ATG TGA CAG AGA GTT CG-3’，巢式引物P25’-CTT ATGAAG CCA ACT CAC ACG-3’。先使用引物P1和引物Olig(dT)18以反转录的cDNA为模板扩增，产物稀释50倍，以巢式引物P2和Olig(dT)18经过巢式PCR，获得一扩增片断，克隆测序。
按照下述条件扩增目的基因片段反应体系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水补足到50μl。
反应程序为94℃预变性3min，然后进行36个循环，每一个循环包括94℃变性40s，55℃复性1min，72℃延伸2min。最后保持在72℃下延伸10min。
3.马蔺Na+/H+逆向转运蛋白2基因5｀末端的获得根据马蔺Na+/H+逆向转运蛋白2基因部分片段的序列设计5’RACE基因特异引物.P15’-GAA AGA CAG CGG GAA GAC GAA AG-3’，巢式引物P25’-CCAACA TAA AGG AAG AGG AAT-3’。先使用引物P1和引物UMP，以反转录的cDNA为模板扩增，产物稀释50倍，以引物巢式引物P2和NUMP经过巢式PCR，获得一扩增片断，克隆测序。
按照下述条件扩增目的基因片段反应体系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水补足到50μl。
反应程序为94℃预变性3min，然后进行36个循环，每一个循环包括94℃变性40s，55℃复性1min，72℃延伸3min。最后保持在72℃下延伸10min。
4.马蔺Na+/H+逆向转运蛋白2基因全长cDNA的获得根据5｀Race和3｀Race的结果，设计了引物对P15’-ACC GGT ATG GGG TCTGGT ATG GA-3’，P25’-CCA TGG ATT CCC ATC CAT GAA CAC-3’，扩增cDNA模板获得全长片断，克隆测序。
按照下述条件扩增目的基因片段反应体系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水补足到50μl。
反应程序为94℃预变性3min，然后进行36个循环，每一个循环包括94℃变性40s，51℃复性1min，72℃延伸2min。最后保持在72℃下延伸10min。
5.马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因测序用克隆载体构建将PCR扩增产物电泳后分离相应大小的条带回收后与pUCm-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，并通过PCR法、酶切质粒法等进行验证克隆产物是否正确，然后进行测序证明此基因已经成功的以克隆质粒的形式存储在大肠杆菌DH10B中。
6.马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因的Ti-质粒双元载体构建用于构建双元转化-表达载体的质粒是由pBI121改造而来。首先将pBI121内的GUS基因用BamH I和Sac I去除，然后与pIRES-EGFP质粒上用BamH I和Sac I酶切的GFP基因连接，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，并通过酶切质粒法等进行验证此新载体(命名为pBIGFP)以正确的形式存储在大肠杆菌DH10B中。
将载体pBIGFP内的花椰菜花叶病毒的启动子35S(p35S)，用HindIII和BamH I去除，然后与pAL76质粒上用HindIII和BamH I酶切的玉米泛素超强启动子Ubi连接，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，并通过酶切质粒法等进行验证此新载体(命名为pBIUbiGFP)以正确的形式存储在大肠杆菌DH10B中。
作为目的基因使用的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因插入在pBIUbiGFP质粒的Ubiquitin启动子和GFP基因之间的多克隆位点上并且与GFP基因形成融合基因，表达一个N末端连有GFP蛋白的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2，使用的内切酶是AgeI和NcoI。将连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，并通过酶切质粒法等进行验证此新载体(命名为pBIUbiGFPIINHX2)以正确的形式存储在大肠杆菌DH10B中。
7.马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因Ti-质粒双元载体的转基因育种取中国春的种子，升汞灭菌10min，蒸馏水洗涤3次，整齐置于9cm培养皿中，25℃下露白。在4℃，黑暗条件下春化1个月以上。用双面刀片切出生长点，并滴加1-2滴的含有pBIUbiGFPIINHX2质粒的农杆菌AGL1菌液，继续在培养皿中培养至新叶长出，移栽。用PCR筛选出转基因植株，将转基因植株加代。
选取两个转基因株系的T1代，提取萌发长势旺盛时期叶片的总DNA，用马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因全长序列作为探针，进行Southern杂交，表明马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因在转基因株系B53和B59基因组中存在。
选取四个转基因株系的T1代幼苗分别在添加170mM和300mM的NaCl的MS营养液培养5天后，全部的转基因株系表现出比野生型中国春更高的成活率。其中两个转基因株系在300mM的成活率分别达到50％和38％，而野生型中国春全部萎蔫死亡。(见表1)表1转基因株系T1代在不同盐浓度下的成活率比较
序列表SEQ ID NO.1<110>山东大学<120>马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因及应用<141>2005-5-13<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1641<212>DNA<213>马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因<400>
atggggtctg gtatggagga tctgctggtg aggctgggtg tcgtgtcgtc cacctccgac60catgcctccg tggtctccat caacctcttc gtagctctcc tctgcgcatg catagtcatc 120ggacacctcc tggaggagaa tagatggatg aacgagtcca tcaccgctct agccatcggg 180ttgtgcactg gcgttgtgat tcttctgacg acaaatggga agagctctca tatattcgta 240ttcagcgaag atctcttctt catctacctc ctccctccaa tcatcttcaa cgccgggttt 300caagtaaaaa agaaacaatt tttccgcaac ttcatgacaa ttatgctgtt tggtgcagtt 360gggaccctca tctcctttgt cataatttct cttggtgcaa ttggtttatt cagaaaaatg 420aacataggtc cactggaagt tggagatttt cttgcaattg gggcaatctt ttctgcaaca 480gattctgttt gcaccttgca gattcttaac caggatgaaa caccattatt atatagcttg 540gtctttggtg agggagttgt caatgatgcc acatcagtgg tgcttttcaa cgcaatacaa 600aacttcgatc ttgaacatat tgatgcaggc attgcagcaa aatttattgg aaatttcttt 660tatttatttg tcagcagcac cttcttggga gcatttgctg gattgcttag tgcgtatatc 720ataaaaaagt tgtattatgg aaggcattct actgatcgtg aagttgcact catgatgctt 780atggcgtacc tttcatatat gctggctgag ctgttagatc taagtggtat cctcacggtt 840ttcttctgcg gcatagtaat gtcccattat acgtggcaca atgtgacaga gagttcgaga 900gtcacaacca agcatgcttt tgcaaccttg tcatttattt cggagatatt cctcttcctt 960tatgttggca tggatgcatt agacattgaa aagtggagat ttgtcagcga cagtcctggg 1020aaatcaattg gtgttagcgc aatcataatt ggtttagttt tgattggaag agcagctttc 1080gtcttcccgc tgtctttcct atccaactta gctaagaagt cccctaatga aaaaatcacc 1140ttcaaccagc aagttaccat atggtgggca ggtttgatga gaggtgctgt atcaattgca 1200cttgcttaca atcagttcac aagagctggt catactcaac ttccagggaa tgcaatgatg 1260atcaccagta ccatcacagt tgtgctattt agcactgtgg tattcggatt attgacaaag 1320cctttgataa ggctcctgtt gcctcctagt acaaagcatc ttaccggcag ttgcagtttc 1380aactctgagc cctctacccc aaaattttta tccgctgcac tactagaaaa tattccagga 1440tttgaagcag aaggaggaac aacaaacctt ggggctcggc cttcaagcc ttcgaatgctc 1500cttatgaagc caactcacac ggttcattac tattggcgca agtttgatga tgctttcatg 1560cgtccaatgt ttggagggcg aggctttgtt ccttttgttc ccggttcacc tactgaacaa 1620agtgttcatg gatgggaatg a 1641
SEQ ID NO.2<110>山东大学<120>马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因及应用<141>2005-5-13<170>PatentIn Version 2.1<210>2<211>546<212>PRT<213>马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因氨基酸序列<400>
MGSGMEDLLV RLGVVSSTSD HASVVSINLF VALLCACIVI GHLLEENRWM NES ITALAIG 60LCTGVVILLT TNGKSSHIFV FSEDLFFIYL LPPIIFNAGF QVKKKQFFRN FMTIMLFGAV120GTLISFVIIS LGAIGLFRKM NIGPLEVGDF LAIGAIFSAT DSVCTLQILN QDETPLLYSL180VFGEGVVNDA TSVVLFNAIQ NFDLEHIDAG IAAKFIGNFF YLFVSSTFLG AFAGLLSAYI240IKKLYYGRHS TDREVALMML MAYLSYMLAE LLDLSGILTV FFCGIVMSHY TWHNVTESSR300VTTKHAFATL SFISEIFLFL YVGMDALDIE KWRFVSDSPG KSIGVSAIII GLVLIGRAAF360VFPLSFLSNL AKKSPNEKIT FNQQVTIWWA GLMRGAVSIA LAYNQFTRAG HTQLPGNAMM420ITSTITVVLF STVVFGLLTK PLIRLLLPPS TKHLTGSCSF NSEPSTPKFL SAALLENIPG480FEAEGGTTNL GARPSSLRML LMKPTHTVHY YWRKFDDAFM RPMFGGRGFV PFVPGSPTEQ540SVHGWE 54权利要求
1.马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征在于具有如SEQ ID NO.1所示的序列ATGGGGTCTG GTATGGAGGA TCTGCTGGTG AGGCTGGGTG TCGTGTCGTC CACCTCCGAC60CATGCCTCCG TGGTCTCCAT CAACCTCTTC GTAGCTCTCC TCTGCGCATG CATAGTCATC 120GGACACCTCC TGGAGGAGAA TAGATGGATG AACGAGTCCA TCACCGCTCT AGCCATCGGG 180TTGTGCACTG GCGTTGTGAT TCTTCTGACG ACAAATGGGA AGAGCTCTCA TATATTCGTA 240TTCAGCGAAG ATCTCTTCTT CATCTACCTC CTCCCTCCAA TCATCTTCAA CGCCGGGTTT 300CAAGTAAAAA AGAAACAATT TTTCCGCAAC TTCATGACAA TTATGCTGTT TGGTGCAGTT 360GGGACCCTCA TCTCCTTTGT CATAATTTCT CTTGGTGCAA TTGGTTTATT CAGAAAAATG 420AACATAGGTC CACTGGAAGT TGGAGATTTT CTTGCAATTG GGGCAATCTT TTCTGCAACA 480GATTCTGTTT GCACCTTGCA GATTCTTAAC CAGGATGAAA CACCATTATT ATATAGCTTG 540GTCTTTGGTG AGGGAGTTGT CAATGATGCC ACATCAGTGG TGCTTTTCAA CGCAATACAA 600AACTTCGATC TTGAACATAT TGATGCAGGC ATTGCAGCAA AATTTATTGG AAATTTCTTT 660TATTTATTTG TCAGCAGCAC CTTCTTGGGA GCATTTGCTG GATTGCTTAG TGCGTATATC 720ATAAAAAAGT TGTATTATGG AAGGCATTCT ACTGATCGTG AAGTTGCACT CATGATGCTT 780ATGGCGTACC TTTCATATAT GCTGGCTGAG CTGTTAGATC TAAGTGGTAT CCTCACGGTT 840TTCTTCTGCG GCATAGTAAT GTCCCATTAT ACGTGGCACA ATGTGACAGA GAGTTCGAGA 900GTCACAACCA AGCATGCTTT TGCAACCTTG TCATTTATTT CGGAGATATT CCTCTTCCTT 960TATGTTGGCA TGGATGCATT AGACATTGAA AAGTGGAGAT TTGTCAGCGA CAGTCCTGGG 1020AAATCAATTG GTGTTAGCGC AATCATAATT GGTTTAGTTT TGATTGGAAG AGCAGCTTTC 1080GTCTTCCCGC TGTCTTTCCT ATCCAACTTA GCTAAGAAGT CCCCTAATGA AAAAATCACC 1140TTCAACCAGC AAGTTACCAT ATGGTGGGCA GGTTTGATGA GAGGTGCTGT ATCAATTGCA 1200CTTGCTTACA ATCAGTTCAC AAGAGCTGGT CATACTCAAC TTCCAGGGAA TGCAATGATG 1260ATCACCAGTA CCATCACAGT TGTGCTATTT AGCACTGTGG TATTCGGATT ATTGACAAAG 1320CCTTTGATAA GGCTCCTGTT GCCTCCTAGT ACAAAGCATC TTACCGGCAG TTGCAGTTTC 1380AACTCTGAGC CCTCTACCCC AAAATTTTTA TCCGCTGCAC TACTAGAAAA TATTCCAGGA 1440TTTGAAGCAG AAGGAGGAAC AACAAACCTT GGGGCTCGGC CTTCAAGCCT TCGAATGCTC 1500CTTATGAAGC CAACTCACAC GGTTCATTAC TATTGGCGCA AGTTTGATGA TGCTTTCATG 1560CGTCCAATGT TTGGAGGGCG AGGCTTTGTT CCTTTTGTTC CCGGTTCACC TACTGAACAA 1620AGTGTTCATG GATGGGAATG A1641其中，包括与SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％相同性的序列。
2.马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征在于具有如序列表SEQ IDNO.2所示氨基酸序列MGSGMEDLLV RLGVVSSTSD HASVVSINLF VALLCACIVI GHLLEENRWM NESITALAIG60LCTGVVILLT TNGKSSHIFV FSEDLFFIYL LPPIIFNAGF QVKKKQFFRN FMTIMLFGAV 120GTLISFVIIS LGAIGLFRKM NIGPLEVGDF LAIGAIFSAT DSVCTLQILN QDETPLLYSL 180VFGEGVVNDA TSVVLFNAIQ NFDLEHIDAG IAAKFIGNFF YLFVSSTFLG AFAGLLSAYI 240IKKLYYGRHS TDREVALMML MAYLSYMLAE LLDLSGILTV FFCGIVMSHY TWHNVTESSR 300VTTKHAFATL SFISEIFLFL YVGMDALDIE KWRFVSDSPG KSIGVSAIII GLVLIGRAAF 360VFPLSFLSNL AKKSPNEKIT FNQQVTIWWA GLMRGAVSIA LAYNQFTRAG HTQLPGNAMM 420ITSTITVVLF STVVFGLLTK PLIRLLLPPS TKHLTGSCSF NSEPSTPKFL SAALLENIPG 480FEAEGGTTNL GARPSSLRML LMKPTHTVHY YWRKFDDAFM RPMFGGRGFV PFVPGSPTEQ 540SVHGWE 546其中，包括与SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％相同性的序列。
3.根据权利要求1所述的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，所述马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以构建到原核表达载体中，通过本领域公知的研究方法将马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因导入原核生物，通过诱导，大量表达出马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2。
4.根据权利要求1或3所述的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，所述马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2可用于研究马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2的结构、功能以及抗体制备。
5.根据权利要求1所述的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，所述马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以通过微注射、基因枪、农杆菌介导、花粉管通道方法将马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因转入作物和牧草，培育出抗盐品质优良的品种/系。
6.根据权利要求1或5所述的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，所述马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因可以构建到任何基于Ti-质粒双元载体中，通过本领域公知的研究方法将马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因导入农杆菌中，进行农杆菌转化。
7.根据权利要求6所述的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，将所述马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因作为目的基因，构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pBIUbiGFP上；其中有LB和RB的T-DNA25bp重复序列，胭脂碱合成酶基因的启动子P-nos和终止子T-nos，还有在真核生物中作为选择标记使用的nptII，用于选择的抗生素是卡那霉素和G418；在pBIUbiGFP中还有玉米泛素超强启动子Ubi和绿色荧光蛋白GFP基因；马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因插入在pBIUbiGFP质粒的Ubiquitin启动子和GFP基因之间的多克隆位点上，并且与GFP基因形成融合基因，表达一个N末端连有GFP蛋白的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2。
8.根据权利要求7所述的马蔺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因，其特征是，所述的双元转化重组载体pBIUbiGFPI1NHX2可转化于农杆菌AGL1中，通过农杆菌苗端转化法侵染小麦，从而获得转基因小麦。
全文摘要
本发明公开了一种马蔺液泡膜Na
文档编号C12N15/29GK1706951SQ20051004351
公开日2005年12月14日 申请日期2005年5月13日 优先权日2005年5月13日
发明者夏光敏, 刘恒, 薛哲勇 申请人:山东大学