专利名称：表达cbh2基因的酵母工程菌株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达cbh2基因的毕赤酵母工程菌株(Pichiapastoris GS-D)及构建方法(二)技术背景纤维素是一种廉价的可再生资源，是高等植物细胞壁的主要成分，其含量达植物干重的35％～55％，广泛存在于自然界。将纤维素水解成葡萄糖，再通过发酵可生产乙醇、丙酮、丁醇等有机化工原料和燃料，也可以生产饲料、食物和药物等。纤维素材料是解决人类面临的粮食问题，能源问题和环境问题的最有前景的资源。研究、开发纤维素资源有着深远的意义。纤维素酶可以将纤维素的分子链切断，使其转化为葡萄糖，除了可供发酵进一步转化为蛋白、脂肪供人们使用并作畜禽饲料外，还可作为生产酒精、丁醇、柠檬酸、谷氨酸、甘油等的碳源，这对于提高粮食利用率，节省大量粮食，具有十分重要的意义。纤维素酶的应用，目前已经进入了食品、饲料、纺织、化工、造纸、医药、石油开采等工业领域。
目前，制约纤维素酶在农业工业上应用的主要因素有(1)生产周期长，产品成本高，(2)热稳定性差，货架寿命短。(3)高温发酵需要专门的设备，这些将增加生产的成本和能耗。因此热稳定性纤维素酶的研究和开发具有重要的商业价值。当前应致力于嗜热微生物产生的热稳定酶的研究。利用嗜热菌产生的嗜热酶作为生物催化剂有许多优势(1)酶制剂的成本降低，稳定性提高，可在室温下分离提纯和包装运输，并能长久地保持活性；(2)加快了动力学反应；(3)对反应的冷却系统要求降低，因而降低了能耗，既可降低成本，又可减少冷却过程对环境造成的污染；(4)在嗜热酶催化反应的条件下(超过60℃)，很少有杂菌污染，从而减少了细菌代谢产物对产品的污染，可提高产物的纯度，简化其提纯过程；(5)生化过程在高温下进行能增加难溶物质如淀粉类、纤维素类、多芳香类和脂类等的溶解性和可利用性，降低有机化合物的黏度而利于物质的扩散和混合。
嗜热毛壳菌CT2(Chaetomium thermophilum CT2)是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌，是真核生物中生长上限温度很高的一种真菌，有可能成为真核生物中产生热稳定酶的最佳菌株。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生纤维二糖水解酶(CBH)。但要使之用于大规模的工业生产，还存在一些尚未解决的问题。如嗜热菌培养条件比较苛刻，嗜热酶的大规模发酵生产需要特殊设备，而且产酶效率低，从而造成产品成本增加，因此限制了它的应用。解决这一问题的有效途径是应用分子生物学手段，将热稳定纤维素酶基因导入中温型微生物酵母中高效表达，利用酵母生长快、易于培养等特点，使纤维素酶基因在常温和短时间内快速、超量表达，期望达到降低能耗和提高经济效益的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达纤维二糖水解酶II基因的酵母工程菌株及其构建方法。该菌成本低，大规模发酵生产方便，易于实现产业化。本发明的另一个目的是提供制备毕赤酵母菌株的方法，该方法操作简便，重复性好。
本发明所涉及的cbh2基因来自嗜热毛壳菌菌株CT2，其编码的纤维二糖水解酶II热稳定性高。嗜热毛壳菌CT2由本实验室从土壤中应用常规分离方法分离得到，cbh2基因由本实验室克隆得到，Genbank登录号为AY861348。在本发明的一个实施例中提供了一种嗜热毛壳菌CT2纤维二糖水解酶II基因的核苷酸序列及其制备方法，该方法是以嗜热毛壳菌总RNA为模板，用特异性寡核苷酸引物，经反转录PCR方法得到纤维二糖水解酶II基因cDNA。基因测序结果表明纤维二糖水解酶II成熟蛋白由1377个核苷酸组成，编码459个氨基酸。
本发明涉及的纤维二糖水解酶II蛋白分子量在66-67kDa之间，其生物化学特性还有(1)热稳定性纤维二糖水解酶在50℃保持稳定，70℃的半衰期是30分钟；(2)酶作用的最适温度为50℃；(3)最适pH值为4.0，在酸性范围内较稳定。
本发明的一个实施例中提供了一种嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilumCT2纤维二糖水解酶II基因的制备及克隆到大肠杆菌的方法，该方法包括扩增引物合成，嗜热毛壳菌总RNA的提取，mRNA的反转录，目的基因的PCR扩增，目的基因片断的回收，目的基因片断克隆入载体，嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II基因序列的测定。
本发明的技术要点之一是表达纤维二糖水解酶II基因的毕赤酵母工程菌株的构建及诱导表达。毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种高效的真核表达系统，它具有以下优点表达量高，稳定性好，活性高，便于工业化生产。
在本发明的一个实施例中提供了一种基因工程菌株的构建，菌株为毕赤酵母Pichiapastoris GS-D。在毕赤酵母菌中表达纤维二糖水解酶II基因的方法，该方法是用pPIC9K载体在毕赤酵母中表达纤维二糖水解酶II基因，包括(1)纤维二糖水解酶II基因的PCR扩增；(2)PCR产物克隆至T载体；(3)穿梭表达质粒的构建；(4)表达纤维二糖水解酶II基因的酵母基因工程菌株的构建。
本发明的技术要点之二是基因工程纤维二糖水解酶II蛋白的诱导表达与活性测定。在毕赤酵母中有两个编码乙醇氧化酶的基因AOX1和AOX2，可以利用甲醇作为唯一碳源快速生长，毕赤酵母工程菌中，外源基因被克隆至AOX1启动子控制下，以甲醇作为诱导剂来实现外源蛋白的高效表达。
在本发明的实施例中提供了一种毕赤酵母工程菌株诱导表达的方法，可用于毕赤酵母工程菌株诱导表达的培养基包括但不仅限于下列培养基MM MD BMGYBMMY，各种培养基的配制方法为本技术领域人员非常熟悉的方法，可以通过参考相关文献获得详情。
在本发明的一个实施例中提供一种纤维二糖水解酶II的生物学活性，通过活性测定，本发明的基因工程菌株发酵的活性单位超过26U/mL，表达量达到1.5g/L，实现了外源基因在毕赤酵母中的高效表达。
图1纤维二糖水解酶基因成熟蛋白编码基因的PCR扩增结果图2重组质粒的酶切鉴定结果(EcoR I和Not I双酶切)图3重组表达载体的酶切鉴定结果泳道1为核酸高分子量电泳λ-Hind III digest DNA marker(23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125bp)泳道2为pPIC9K/cbh2 EcoR I+Not I酶切结果(9.3kb+1.4kb)泳道3为pPIC9K/cbh2 EcoR I酶切结果(10.7kb)泳道4为pPIC9K/cbh2 EcoR I+Nco I酶切结果(6.9kb+3.8kb)泳道5为DL2000 DNA marker(2000，1000，750，500，250，100bp)图4.酵母工程菌PGS-D不同诱导时间表达纤维二糖水解酶II的SDS-PAGE电泳泳道1为低分子量蛋白Marker(94kDa，67kDa，43kDa，31kDa，20kDa)泳道2-8为甲醇分别诱导24h，48h，72h 96h，120h，144h.168h的表达情况图5重组蛋白SDS-PAGE检测泳道1为蛋白低分子量Marker(94kDa，67kDa，43kDa，31kDa，20kDa)泳道2为纯化的重组基因表达蛋白泳道3为发酵得到的粗酶液
泳道4为空载体转化毕赤酵母工程菌发酵产物具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，所有实施例中的培养基及分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟悉，可以参考Sambrook等“分子克隆”(实验室手册，1989)等获得详情。
实施例1.嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II基因的PCR扩增及克隆(1)扩增引物的合成根据实验室克隆的嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II cDNA序列设计寡核苷酸引物扩增。上游引物长26个核苷酸，下游引物长27个核苷酸，引物由上海生工生物有限公司合成，经PAGE纯化。序列如下(在上下游引物中分别引入了EcoRI和Not I酶切位点，加下划线处为酶切位点)正向5’---CCGAATTCGCCCCTCTCCTTGAGGAG-----3’反向5’----GGGCGGCCGCTCAGAGCGGAGGGTTGG--3’(2)总RNA的提取从中国分离鉴定一株嗜热真菌Chaetomium thermophilum CT2，按照TRIZOL法提取总RNA收集诱导产生的菌丝，无菌水冲洗，干燥，液氮速冻，研磨。每0.2g加入1mL TRIZOL，静置5分钟，加入0.2mL三氯甲烷，剧烈振荡15s，12000g，4℃，离心15min。取上清，加入沉淀剂离心得沉淀，75％的乙醇洗沉淀两次，干燥。将沉淀溶解在50ul DEPC处理的双蒸水中。-80℃保存，待用。
(3)反转录合成eDNA第一条链按照Promega公司的Reverse TranscriptionReaction试剂盒说明书进行，以Oligo(dT)20引物合成cDNA第一链。具体操作步骤如下
将以下试剂加入一个经DEPC浸泡并灭菌处理的PCR反应管中25mM MgCl212ul；缓冲液6ul；10m M d NTP 6ul；Recombinant Rnasin RibonucleaseInhibitor 2ul；AMV反转录酶4ul；Oligo(dT)20 6ul；嗜热毛壳总RNA 15ul；灭菌双蒸水9ul。反应条件为42℃ 1小时；95℃ 5分钟；3℃ 5分钟。
(4)目的基因的PCR扩增取8ul反转录反应引物，按照Reverse Transcription Reaction试剂盒中给出的PCR反应体系参数进行PCR反应。反应组分为10X缓冲液 2.5ul25mM MgCl21.5ul10m M d NTP2ul上游引物 1ul下游引物 1ul反转录产物 5ulRT-PCR酶混合物 2ul灭菌双蒸水 10ul其反应参数为预变性94℃，4min变性94℃，1min复性55℃，1min延伸72℃，1min30s循环30个终止延伸72℃ 10minPCR产物通过1％琼脂糖电泳检测，电泳结果如附图1所示。
(5)目的片段的回收按照上海华舜生物工程公司PCR产物回收试剂盒说明书回收目的基因片断，其过程如下取30ul PCR反应产物加入1.4mL PB液(试剂盒提供)，混合物移入吸附柱中离心15秒，弃废液；在吸附柱中加入400ul PB液，静置1分钟后，离心15秒，弃废液；再加入500ul Wl液(试剂盒提供)，离心15秒，弃废液，重复一次；在吸附柱中加入300ul T1液(试剂盒提供)，静置1分钟后，离心30秒，收集离心液，贮存于-20℃。
(6)目的基因片段克隆入载体目的基因片段克隆入pMD18-T载体，该载体购自大连宝生物工程公司。反应组分如下PCR产物5ul；pMD18-T载体1ul；Ligation solution 4ul；总体积为10ul，16℃连接过夜。
感受态细胞的制备挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡3小时，待菌液OD值为0.6时，4℃ 5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1MCaCl2悬浮，再5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl2重悬，分装后置冰浴内6小时备用。
连接产物的转化取上述连接产物5ul加入100ul感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克90秒，再置冰浴2分钟，加入无氨苄青霉素的LB培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200ul菌液加入40ul 20mg/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及4ul 0.1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混匀后涂含氨苄青霉素LB平皿，37℃培养16小时，挑取白色菌落快速提取质粒进行酶切鉴定，酶切产物经1％琼脂糖电泳检测结果如图2所示，其阳性克隆命名为pMDT/cbh2。
(7)嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II成熟蛋白编码基因的序列测定提取质粒DNA双脱氧法测定核苷酸序列，序列测定由上海生物工程有限公司完成，序列引物为M13启动子引物。嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II基因核苷酸序列测定结果嗜热毛壳菌成熟蛋白编码基因序列长1377个核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为A-265、C-478、G-340、T-294。编码459个氨基酸。该蛋白质成熟蛋白终止密码子位于基因第1378位，终止密码子为TGA。
5’端至3’端序列为1 GCCCCTCTCC TTGAGGAGCG CCAGAGCTGC TCCTCCGTCT GGGGTCAATG CGGTGGCATC61AATTACAACG GCCCGACCTG CTGCCAGTCC GGCAGTGTTT GCACTTACCT GAATGACTGG121 TACAGCCAGT GCATTCCCGG TCAGGCTCAG CCCGGCACGA CTAGCACCAC GGCTCGGACC181 ACCAGCACCA GCACCACCAG CACTTCGTCG GTCCGCCCGA CCACCTCGAA TACCCCTGTG241 ACGACTGCTC CGCCGACGAC CACCATCCCG GGCGGCGCCT CGAGCACGGC CAGCTACAAC301 GGCAACCCGT TCTCGGGTGT CCAACTTTGG GCCAACACCT ACTACTCGTC CGAGGTGCAC361 ACTTTGGCCA TCCCCAGCTT GTCTCCTGAG CTGGCTGCCA AGGCCGCCAA GGTCGCTGAG421 GTTCCCAGCT TCCAGTGGCT CGACCGCAAT GTGACTGTTG ACACTCTCTT CTCCGGCACT481 CTTGCCGAAA TCCGCGCCGC CAACCAGCGC GGTGCCAACC CGCCTTATGC CGGCATTTTC541 GTGGTTTATG ACTTACCAGA CCGTGATTGC GCGGCTGCTG CTTCGAACGG CGAGTGGTCT601 ATCGCCAACA ATGGTGCCAA CAACTACAAG CGCTACATCG ACCGGATCCG TGAGCTCCTT661 ATCCAGTACT CCGATATCCG CACTATTCTG GTCATTGAAC CTGATTCCCT GGCCAACATG721 GTCACCAACA TGAACGTCCA GAAGTGCTCG AACGCTGCCT CCACTTACAA GGAGCTTACT781 GTCTATGCCC TCAAACAGCT CAATCTTCCT CACGTTGCCA TGTACATGGA TGCTGGCCAC841 GCTGGCTGGC TTGGCTGGCC CGCCAACATC CAGCCTGCTG CTGAGCTCTT TGCTCAAATC901 TACCGCGACG CTGGCAGGCC CGCTGCTGTC CGCGGTCTTG CGACCAACGT TGCCAACTAC961 AATGCTTGGT CGATCGCCAG CCCTCCGTCC TACACCTCTC CTAACCCGAA CTACGACGAG1021 AAGCACTATA TTGAGGCCTT TGCTCCTCTT CTCCGCAACC AGGGCTTCGA CGCAAAGTTC1081 ATCGTCGACA CCGGCCGTAA CGGCAAGCAG CCCACTGGCC AGCTTGAATG GGGTCACTGG1141 TGCAATGTCA AGGGAACTGG CTTCGGTGTG CGCCCTACTG CTAACACTGG GCATGAACTT1201 GTTGATGCTT TCGTGTGGGT CAAGCCCGGT GGCGAGTCCG ACGGCACCAG CGACACCAGC1261 GCTGCTCGTT ATGACTATCA CTGCGGCCTT TCCGACGCAC TGACTCCGGC GCCTGAGGCT1321 GGCCAATGGT TCCAGGCTTA TTTCGAACAG CTGCTCATCA ATGCCAACCC TCCGTTCTGA嗜热毛壳菌纤维二糖II基因成熟肽氨基酸序列1 APLLEERQSC SSVWGQCGGI NYNGPTCCQS GSVCTYLNDW YSQCIPGQAQ PGTTSTTART61TSTSTTSTSS VRPTTSNTPV TTAPPTTTIP GGASSTASYN GNPFSGVQLW ANTYYSSEVH
121 TLAIPSLSPE LAAKAAKVAE VPSFQWLDRN VTVDTLFSGT LAEIRAANQR GANPPYAGIF181 VVYDLPDRDC AAAASNGEWS IANNGANNYK RYIDRIRELL IQYSDIRTIL VIEPDSLANM241 VTNMNVQKCS NAASTYKELT VYALKQLNLP HVAMYMDAGH AGWLGWPANI QPAAELFAQI301 YRDAGRPAAV RGLATNVANY NAWSIASPPS YTSPNPNYDE KHYIEAFAPL LRNQGFDAKF361 IVDTGRNGKQ TGQLEWGHWC NVKGTGFGVR PTANTGHELV DAFVWVKPGG ESDGTSDTSA421 ARYDYHCGLS DALTPAPEAG QWFQAYFEQL LINANPPF实施例2.表达纤维二糖水解酶II基因的毕赤酵母基因工程菌株的构建(1)穿梭表达质粒的构建提取重组载体，用EcoR I和Not I双酶切以得到目的片段cbh2；同样酶切pPIC9K空载体并在CIAP作用下使之去磷酸化。将去磷酸化后的线性化的pPIC9K空载体与双酶切后得到的CBH II在T4DNA连接酶的作用下4℃下过夜，以得到重组表达载体pPIC9K-CBH II，将该重组载体转入大肠杆菌JM109中进行扩增。挑取白色单菌落快速提取质粒进行酶切鉴定(图3)。
(2)表达纤维二糖水解酶II基因的酵母工程菌株的构建a.穿梭表达质粒的线性化提取重组质粒pPIC9K/CBH II，用Nco I酶切成线性，同样酶切空质粒pPIC9K作为对照。
b.转化毕赤酵母Gs115过程如下(a).YPD培养基过夜培养酵母Pichia pastoris Gs115，接种至新鲜的培养基中，培养至OD600值为1.5，(b).1500rpm/min离心收集菌体，先后用500、250mL预冷的无菌水洗菌体，4℃下3000rpm/min离心去上清液，(c).用20mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮，取80μL加入5-10ng线性化的重组质粒(Nco I切)，冰浴5min，电击仪电击，电击参数为1.5kV、25μF。
(d).电击结束后迅速加入1mL预冷后的1mol/L山梨醇，取200μL于固体MD培养基上涂板，30℃培养直至单个转化子出现。
(3)筛选阳性转化子用灭菌牙签挑取转化子对应点种到筛选培养基MM和MD平板上，30℃培养2d，在MD上生长正常而在MM上生长缓慢或不生长的转化子为阳性转化子。对筛选得到的阳性转化子用载体引物扩增鉴定。
实施例3.基因工程菌纤维二糖水解酶II蛋白的诱导表达(1)挑选一单菌落，置于装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，于28-30℃/250-300rpm培养至0D600＝2-6(大约16-18h)；(2)室温下1500-3000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600＝1.0左右(约200mL)；(3)将步骤2所得的菌液置于1L摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30℃/250-300rpm的摇床上继续生长；(4)每隔24h向培养基添加100％甲醇至终浓度为0.5％(约1mL)；(5)在第24、48、72、96、120、144、168小时取样检测cbh2基因在酵母中的表达情况。
实施例4.酵母基因工程蛋白的提取方法(1)、蛋白分离方法a.诱导培养150h后离心收集上清液b.用70％饱和硫酸铵沉淀3h后，5000r/min离心10min，收集沉淀c.小心收集沉淀，将其用适量(一般为50ml左右)的Tris-HCl缓冲液(pH8.0，50mmol/L)充分溶解d.装入透析袋中在相同缓冲液(1000ml)中透析24h，透析时用磁力搅拌器不停的搅拌透析液，其间每隔6h更换一次缓冲液，以便于达到透析完全的效果
e.将透析袋中的溶液收集，低温下离心5min(10,000rpm，4℃)，取上清液。长期贮存时，将其分成小份于液氮中快速冷冻，-80℃贮存；(2)、SDS-PAGE电泳分析cbh2基因的表达情况a.凝胶的灌制将配制好的12％的分离胶溶液混合均匀后，将凝胶溶液迅速倾入制胶玻璃板中，至胶液面距玻璃板凹槽3cm左右，然后在胶面上轻轻铺注1cm高的水层，垂直放置胶板，约20-30min后，胶即可凝聚。然后吸出胶面上的水。将配制好的3％浓缩胶迅速注入到分离胶的上层，至液面与玻璃板的凹槽平齐，而后插入梳子，在室温下放置20-30min，使其凝聚。小心拔出梳子并灌入电极缓冲液。
b.上样及电泳在酵母诱导发酵液中加等体积的加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性，按顺序加样，以100V电泳至溴酚蓝进分离胶，提高电压至150V，当溴酚蓝到达底部前约1cm处结束电泳；c.染色和脱色将电泳完毕的胶板取出，用去离子水冲洗干净后，置于约100ml染色液中染色，室温下，在平台摇床上染色至少20min。弃去染色液，冲洗后置于100-200ml高甲醇脱色液中脱色。当脱色液的颜色与胶的颜色一样深时更换脱色液。如此约3-4次，通常至大部分蓝色褪尽为止。凝胶置于约100ml标准(低甲醇)脱色液中4-6h或过夜，使之完全脱色。至此，胶板的本底基本清洁。脱色后，将胶板保存于室温，去离子水中。
d.电泳结果得到cbh2基因在酵母表达载体中的表达情况(图4，5)。
实施例5.基因工程纤维二糖水解酶II蛋白的活性测定称取4mg脱脂棉，加入0.1mL适当稀释的酶液、0.1mL 50mmol/L pH 5.0醋酸缓冲液混合后，50℃下保温24h，加入0.1mL DNS试剂测还原糖量。一个酶活力单位(U)定义为每分钟水解纤维素产生1μmol葡萄糖所需酶蛋白量。
权利要求
1.一种表达cbh2基因编码蛋白的酵母基因工程菌株，其特征是该菌株为一种毕赤酵母，名称为Pichia pastoris GS-D，该工程菌能够高效表达纤维二糖水解酶II，表达蛋白具有较高的热稳定性，酶活性可达26U/mL。
2.根据权利要求1所述的一种表达cbh2基因编码蛋白的酵母工程菌株，其特征在于根据毛壳菌cbh2基因序列，应用PCR方法以嗜热毛壳菌CT2的总RNA反转录产物为模板，扩增出cbh2的成熟蛋白编码基因片段，克隆到下一载体pMD18-T上，测序证实后，再将克隆到的CT2纤维二糖水解酶II基因插入到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K的多克隆位点，再通过电转化导入毕赤酵母宿主Gs115中，再从中筛选出高效表达纤维二糖水解酶II的酵母基因工程菌。
全文摘要
本发明提出一种酵母基因工程菌Pichia pastorisGS－D是通过PCR方法，从毛壳属菌株—嗜热毛壳菌CT2中筛选获得纤维二糖水解酶II基因，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体中，然后将得到的纤维二糖水解酶II基因表达载体导入到毕赤酵母中，再从中筛选出一种高效表达纤维二糖水解酶II的酵母基因工程菌，表达量超过1.5g/L。用该酵母基因工程菌制备的纤维二糖水解酶II，具有较高的热稳定性，其酶活性可达26U/mL以上。通过酵母基因工程菌株发酵，大量生产具有生物活性的cbh2蛋白，用于转化纤维废料及其它工业领域，具有非常显著的经济价值和社会价值。
文档编号C12N15/56GK1757709SQ20051004407
公开日2006年4月12日 申请日期2005年7月15日 优先权日2005年7月15日
发明者李多川, 刘守安 申请人:山东农业大学