专利名称：鱼类胚胎细胞分离与培养方法
技术领域：
本发明属于水产生物技术中鱼类细胞的培养技术，是在体外人工培养条件下，以鱼类胚胎细胞为材料获得具有无限增殖能力的胚胎细胞系的一种技术方法。
背景技术：
鱼类胚胎细胞是从鱼类囊胚期到原肠后期胚胎中分离培养出的具有无限增殖能力的细胞。在本发明做出之前，国内外还未见相关的海水养殖鱼类胚胎细胞分离与培养的专门报道。在胚胎来源的细胞培养方面，国际上主要集中在小型模式鱼类—斑马鱼和青鳉胚胎细胞培养的研究上Collodi等(2004)进行了斑马鱼胚胎细胞的分离与培养研究，他们采用的是滋养层细胞培养法，即先培养好单层的虹鳟脾细胞(RTS34st)，然后将从胚胎中分离出的细胞置于虹鳟单层脾细胞上培养，待斑马鱼胚胎细胞集落长成后，用巴斯德玻璃吸管将集落转移到试管中，消化成单个细胞，形成悬液，细胞悬液再置于单层虹鳟脾细胞上进行继代培养；Lannan CN等(1984)建立了大马哈鱼胚胎细胞系，他们采用的胚胎细胞分离方法操作复杂，不容易成功；细胞培养过程比较繁琐，而且细胞生长速度较慢；大量培养细胞难度大，不利于用细胞来做大量的实验。
发明内容
本发明的目的是建立鱼类胚胎细胞分离与培养的简易方法，使细胞保持良好的生长状态及其典型的胚胎细胞特征，为海水鱼类细胞种质库和功能基因研究提供细胞基础。
本发明是按如下技术内容实现的包括胚胎的收集、胚胎细胞(囊胚期-原肠后期)的分离、胚胎细胞的培养和传代、胚胎细胞特征鉴定——形态学鉴定、生长和增殖特性鉴定、倍性检测。
胚胎的收集将海水鱼类(牙鲆、大菱鲆等)的授精卵50ml放在装满海水的500ml量筒中，10分钟后，正常受精的卵浮在水的上层，死卵沉到水底。收集浮在水上的胚胎，待用。
胚胎细胞(囊胚期-原肠后期)的分离采集鱼类胚胎，镜检合格后在常温下培养至囊胚后期或原肠后期时使用。将胚胎分组，每组50-80个胚胎，在1×PBS溶液中反复浸洗，然后移到超净工作台上，在70％酒精中浸泡几秒钟，进行快速消毒，然后用1×PBS(pH值为7.4)溶液清洗三次。将胚胎吸取到无菌的培养皿中，吸干PBS，加入适量的完全培养基，在显微镜下用尖头镊子剥除卵膜，分离出细胞团，从中分离出胚胎细胞，用于原代培养。
胚胎细胞的培养和传代将收集的胚胎期细胞接种到24孔组织培养板中单层培养，加入完全培养基1.0ml，置于24℃培养箱中培养.培养2-3天后，更换培养基，等细胞长满培养孔，按1∶2的比例进行传代，每2-3天更换一次培养基，1周传代2-3次。完全培养基配方为DMEM基础培养基，添加4.5g/ml葡萄糖，20m mol/L Hepes(pH7.4)，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，2m mol/L谷氨酸，1m mol/L丙酮酸钠，1mmol/L非必需氨基酸，15％胎牛血清，5ng/ml成纤维生长因子，27.5μM巯基乙醇。形成稳定的胚胎细胞系后，细胞保持较快的生长和增殖速度，保持胚胎细胞的形态。
胚胎细胞特征鉴定形态学鉴定在100×和400×的相差显微镜下观察细胞的外形和细胞大小，显微照相记录细胞形态，胚胎细胞多为圆形，多角形和多边形，具有大的细胞核，一个或两个核仁，细胞的直径约为15-30μm。
生长和增殖特性鉴定胚胎细胞经多次传代培养以及建立细胞系后，仍保持快速的生长和增殖特性，细胞倍增时间为24-30小时。
倍性检测对传代至15-20代的胚胎细胞进行染色体分析，显微镜下观察染色体形态，统计二倍体细胞的比率，正常二倍体细胞所占比例一般在60％以上。
本发明与已有技术对比其特点是本发明建立了海水鱼类胚胎细胞分离与培养方法，其特点是胚胎细胞分离操作简单、培养方便、无需特定的细胞分离液、培养基配方和培养方法实用面广，可推广应用于几乎所有的鱼类。
图1形态学鉴定结果图，A大菱鲆16代细胞 B大菱鲆35代细胞。
图2不同温度对大菱鲆胚胎细胞生长的影响图，图3大菱鲆胚胎细胞染色体形态图，图4大菱鲆胚胎细胞染色体数目分布图，图5大菱鲆二倍体胚胎细胞核型图。
具体实施例方式本发明是在进行牙鲆和大菱鲆等鲆鲽鱼类胚胎细胞培养的研究中，建立的分离、培养鱼类胚胎细胞的方法。
下面以大菱鲆胚胎细胞的培养为例详细叙述本发明的方法内容它的方法内容包括胚胎的收集、胚胎细胞(囊胚期-原肠后期)的分离、胚胎细胞的培养和传代、胚胎细胞特征鉴定——形态学鉴定、生长和增殖特性鉴定、倍性检测。
胚胎的收集收集大菱鲆授精卵50ml，放在装满海水的500ml量筒中，静置10分钟后，正常受精的卵浮在水的上层，死卵沉到水底，保证正常受精的卵有几百枚，以备实验用。收集浮在水上的正常胚胎，转移到其他孵化容器中进行培养，待用。
胚胎细胞的分离采集授精后不久的大菱鲆胚胎，在显微镜下挑选卵裂正常、发育整齐的受精卵，在常温下培养至原肠期，每次原代培养需要胚胎50-80枚。首先将胚胎放在1×PBS溶液中反复浸洗，然后移到超净工作台上，在70％酒精中浸泡几秒钟，进行快速消毒，然后用1×PBS(pH值为7.4)溶液清洗三次。将胚胎吸取到无菌的培养皿中，吸干PBS，加入适量的完全培养基，在显微镜下用尖头镊子(经过高温消毒)剥除卵膜，分离出细胞团，将不要的卵膜转移到另外的容器中。用枪头轻轻吹打细胞团块，形成单个细胞或较小的团块，吸出培养基，装入离心管以800转/分离心5分钟，去掉上清(含有卵黄和油球)，加入完全培养基将离心管中的细胞吹打下来，制成单细胞悬液。
大菱鲆胚胎细胞的原代和传代培养将以上得到的胚胎细胞悬液接种到24孔板中，每孔加1ml完全培养基，培养箱温度设为24℃。完全培养基配方为DMEM为基础培养基，添加4.5g/ml葡萄糖，20m mol/L Hepes(pH7.4)，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，2m mol/L谷氨酸，1m mol/L丙酮酸钠，1m mol/L非必需氨基酸，15％胎牛血清，5ng/ml成纤维生长因子，27.5μM巯基乙醇，0.1％胚胎抽提物。经常在显微镜下观察细胞贴壁情况，2-3天后，待细胞长满时，以1∶2的比例进行传代，每2-3天换一次培养基，1周传代2-3次。目前，大菱鲆胚胎细胞已培养300多天，传代100多代。
大菱鲆胚胎细胞的鉴定形态学鉴定在100×或400×的相差显微镜下可观察到大菱鲆胚胎细胞的形态，胚胎细胞一般较小，呈圆形、多边形或多角形，具有大的细胞核，一个或两个核仁，细胞的直径约为15-25um。这也是胚胎细胞的重要形态特征。在胚胎细胞前期的培养过程中，成纤维细胞所占比例较多，在继续传代培养过程中，成纤维细胞逐渐减少，圆形、多边形或多角形占据主要比例，如图1所示。A为大菱鲆16代细胞，成纤维细胞所占比例较多；B为大菱鲆35代细胞，圆形、多边形或多角形占据主要比例。
生长和增殖特性大菱鲆胚胎细胞(TEC)生长迅速，增殖速度快，一般，2-3天即可传代一次。在极低密度下(103cells/ml)接种于培养瓶中，10-15天即可由一个细胞形成单克隆集落。细胞倍增时间为24-30小时。生长速度快、增殖快速也是胚胎细胞与其他体细胞的重要区别之一。实验表明，大菱鲆胚胎细胞生长温度范围较广，在24℃时生长速度最快，如图2所示。
倍性检测大菱鲆胚胎细胞生长至对数期，在培养基中添加秋水仙素使终浓度为0.5μg/ml，4小时后收获细胞，75mmol/L KCl溶液低渗处理25分钟，31甲醇、冰醋酸固定细胞3次，每次15分钟，冷滴片，空气干燥，5％Giemsa染色20分钟。显微镜下观察染色体形态(参见图3)，计数染色体数目(参见图4)，做出核型(参见图5)。选取100个中期分裂相，计数二倍体细胞的比例，统计表明具有44条染色体的二倍体细胞的比例为70％以上，核型公式为2n＝4m+12st+28t，与大菱鲆鱼体细胞染色体数和核型相同。一般来说，体外培养的胚胎细胞中的二倍体细胞比率(65％以上)较培养的普通体细胞中的二倍体细胞比率(不足50％)高。
权利要求
1.一种鱼类胚胎细胞分离与培养方法，其特征在于它的操作程序是鱼类胚胎细胞的分离；胚胎细胞的原代和传代培养；胚胎细胞的鉴定包括形态学鉴定、生长和增殖特性鉴定和倍性检测；胚胎细胞在囊胚期-原肠后期的分离采集鱼类胚胎，镜检合格后在常温下培养至囊胚后期或原肠后期时使用；先将胚胎放在1×PBS溶液中反复浸洗，然后在70％酒精中浸泡消毒，最后用1×PBS(pH值为7.4)溶液清洗三次；再将胚胎放到少量完全培养基中，在解剖镜下用尖头镊子剥除卵膜，分离出细胞团，从中分离出胚胎细胞，离心后用完全培养基重悬，制成细胞悬液；胚胎细胞的原代和传代培养将制备好的胚胎细胞接种到24孔组织培养板中培养，加入完全培养基1.0ml，置于24℃培养箱中培养.培养2-3天后，更换培养基，等细胞长满培养孔，按1∶2的比例进行传代，每2-3天更换一次培养基；完全培养基配方为DMEM基础培养基，添加4.5g/ml葡萄糖，20m mol/L HepespH 7.4，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，2mmol/L谷氨酸，1mmol/L丙酮酸钠，1mmol/L非必需氨基酸，15％胎牛血清，5ng/ml成纤维生长因子，27.5μM巯基乙醇。形成稳定的胚胎细胞系后，细胞保持较快的生长和增殖速度，保持胚胎细胞的形态；胚胎细胞的鉴定形态学鉴定在100×和400×的相差显微镜下观察细胞的外形和细胞大小，胚胎细胞多为圆形，多角形和多边形，具有大的细胞核，一个或两个核仁，细胞的直径约为15-30μm；生长和增殖特性鉴定胚胎细胞经多次传代培养以及建立细胞系后，仍保持快速的生长和增殖特性，一般2-3天传代一次，细胞倍增时间为24-30小时；倍性检测大菱鲆胚胎细胞生长至对数期，在培养基中添加秋水仙素使终浓度为0.5μg/ml，4小时后收获细胞，75mmol/L KCl溶液低渗处理25分钟，3∶1甲醇、冰醋酸固定细胞3次，每次15分钟，冷滴片，空气干燥，5％Giemsa染色20分钟。显微镜下观察染色体形态，统计二倍体细胞的比率，正常二倍体细胞所占比例一般在60％以上。
全文摘要
一种鱼类胚胎细胞分离与培养方法，其操作程序是鱼类胚胎的收集；胚胎(囊胚－原肠后期)细胞分离；胚胎细胞的原代和传代培养；胚胎细胞特征的鉴定，包括形态学、增殖特性、染色体核型的鉴定。胚胎的消毒采用70％酒精浸泡灭菌法，细胞从胚胎中的分离采用撕裂法，胚胎细胞的分离与培养都在完全培养基中进行，细胞培养在普通培养箱中进行，培养温度为24℃，每周传代2－3次。以此方法培养的海水鱼类胚胎细胞具有细胞小、呈圆形或多角形、生长稳定、增殖快速、二倍体细胞比率高等特征。本发明技术操作简单，使用方便，可推广应用于几乎所有鱼类胚胎细胞的分离与培养。
文档编号C12N5/06GK1766092SQ200510044628
公开日2006年5月3日 申请日期2005年9月5日 优先权日2005年9月5日
发明者陈松林, 任国诚, 沙珍霞 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所