专利名称：通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法
技术领域：
本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法及应用。
背景技术：
诸自然逆境中，干旱对世界作物产量的影响占居首位，其危害相当于其它自然灾害之和。盐渍化也是影响作物产量的主要环境因素。我国约二分之一国土面积处干旱、半干旱区。即使在非干旱地区的主要农业区，也不时受到旱灾侵袭。在我国16亿亩耕地中，盐碱地有1亿多亩，中低产田约10亿亩。其中大部分中低产田也是由于干旱和盐碱所致。此外有3亿亩盐碱荒地有待开发利用；灌溉地区次生盐渍化田地还在逐年增加。在玉米、小麦主栽区，干旱和土壤盐渍化是影响玉米、小麦产量的主要因素。频繁发生的伏旱是影响我国玉米高产稳产的首要因素，在抽穗期的严重干旱可造成玉米大幅度减产或绝收。而培育玉米耐旱品种是一个长期关注而又收效不大的难题，只要有适应性好的耐旱品种，必将在农业生产中迅速推广。土壤盐渍化造成玉米、小麦播种面积减小和产量锐减，农民急需耐盐高产玉米单交种和小麦品种。随着我国淡水资源的逐年匮乏和气候变暖，采用转基因技术培育耐盐耐旱玉米、小麦具有重要的战略意义。因此，该项目产品具有广阔的市场和重大的经济效益及社会效益。
干旱和盐碱构成了对植物的渗透胁迫，导致植物缺水和脂质过氧化，引起细胞结构严重受损和正常代谢活动不能进行。盐胁迫还引起离子毒害效应。植物的耐盐性和耐旱性既相互关联又存在差异，分别是由多基因控制的复杂性状，涉及到多条代谢途径，其中部分基因在进化上高度保守。近年来植物耐盐机理的研究取得了突破性进展，已从不同生物中克隆出一批耐盐相关基因，其中一些基因转入植物后能明显提高植株耐盐性。植物耐旱基因鉴定及定位研究也取得较大进展。
采用基因工程技术提高作物耐盐耐旱性的研究目前集中在四个方面1)渗透保护与渗透调节，2)氧自由基的消除，3)离子均衡的调控，4)胞内信号传递通道的调节。离子均衡的调控机制又可分为抑制Na+的吸收；向胞外排出Na+；维持细胞K+营养；将胞质中有害Na+泵入并储存在液泡中，实现区域化分布。
作物一般都具有或大或小的渗透调节功能，以适应环境中渗透压的变化。这种功能包括细胞中的渗透调节物(脯氨酸、甜菜碱、多羟基醇类等)的积累、膜通透性的变化等。在干旱和盐胁迫下，一些植物细胞内积累甘氨酸甜菜碱类物质以维持细胞的正常膨压和减轻离子毒害。甘氨酸甜菜碱合成酶基因的高强度表达及甜菜碱积累可大幅度提高植物的耐盐耐旱性。近年的一些研究表明，一些编码渗透调节剂合成酶的基因导入到植物后能使细胞内的渗透调节剂浓度提高，使植株对胁迫表现出更好的抗性。但渗透调节剂提高的浓度均很小，不会产生明显的渗透调节作用，推测是渗透调节剂保护了细胞结构和酶活性所致。将CDH基因转入烟草(Lilius等)、将BADH(甜菜醛脱氢酶)基因转入草莓和烟草(陈受宜等)，植株的耐盐性均明显提高。糖类合成酶如甘露醇合成酶基因转入烟草等植物提高了植株的耐盐性(Tarczynski等，Liu等，Shen等)，海藻糖合成酶基因转入烟草提高了植株的耐旱性(Pilon-Smits等)。
在复杂机制控制下的多条途径参与了细胞质中Na+浓度的调节。多数盐生植物消除Na+毒害的主要机制是将吸收的Na+定位于液泡来降低胞质中Na+的浓度，即离子区域化机制尤为重要。在甜土植物中，部分物种缺乏Na+/H+antiport活性，部分物种Na+/H+antiport活性低。因此，通过遗传改良使非盐生植物在液泡中积累大量Na+已成为植物耐盐基因工程的策略。NHX1基因编码拟南芥等植物液泡膜上的Na+/H+antiport。该蛋白是细胞内离子区域化的关键酶。将带有强启动子的AtNHX1基因转入拟南芥(Apes等)和番茄(Hong-Xia Zhang等)中实现过量表达，获得了耐盐性大幅度提高的植株。
采用转基因技术提高植物耐盐耐旱性是国内外研究的热点课题，已有大量的工作。将维持细胞内离子平衡的基因、合成渗透保护物质的基因、能减轻细胞内自由基危害的基因等导入植物，提高了植物的耐盐耐旱性，为培育耐盐耐旱作物新品种开辟了一条有效途径。但多数工作是以模式植物为材料进行的，只有转AtNHX1基因的耐盐番茄和油菜具有良好的应用价值。从策略和技术上讲，采用转基因技术提高作物耐盐耐旱性已具有成熟的技术路线和必要的实施条件。
玉米是对土壤盐渍化中度敏感的作物，耗水量大，生长发育期易受到干旱的侵袭。玉米耐盐耐旱育种对于我国农业生产意义重大。由于种质材料缺乏和田间选择困难等原因，常规育种选育耐盐耐旱玉米品种的工作收效不大。采用基因工程技术可望在较短时间内创造出玉米耐盐耐旱自交系及单交种。由于玉米转基因技术难度大，采用转基因技术创造耐盐耐旱玉米的工作在国内外尚处起步阶段。王国英等以玉米杂交种愈伤组织为受体获得了转山梨醇-6-磷酸脱氢酶基因的植株，后者耐盐性有一定提高。迄今国内外未报道获得耐盐或/和耐旱性大幅度提高且具有实用价值的转基因玉米。
小麦作为一种主要的粮食作物，其耐盐耐旱品种的培育多年来一直受到人们的重视。传统的小麦耐盐耐旱育种方法有1)从已有品种中筛选耐盐耐旱性强的基因型；2)筛选耐盐耐旱性强的小麦野生近缘种，通过与小麦进行远缘杂交培育耐盐耐旱品种；3)将耐盐耐旱品种与普通品种进行杂交，从其后代选育耐盐品种；4)利用组织培养和理化处理(如辐射等)等措施筛选出耐盐细胞并再生植株，从其后代中选育出耐盐品种。采用这些方法已培育出一批耐盐耐旱小麦新品种。但由于可利用种质资源的限制和效率很低等问题限制了小麦耐盐耐旱育种的迅速发展，培育出的耐盐品种能耐受0.6％NaCl溶液的较长时期的浇灌，而耐旱品种产量较低，在农业生产上很难大面积推广。Sawahel等(2002)将脯氨酸合成酶基因导入小麦获得了耐盐性显著提高的转基因植株。Abebe等(2003)将甘露醇合成酶基因导入小麦得到了合成甘露醇的耐盐小麦。
玉米转基因研究在国内外均受到关注。抗虫、抗除草剂玉米已在美洲大面积推广。就转化技术而言，主要工作集中在以农杆菌为中介的遗传转化、基因枪轰击法和以原生质体为受体的遗传转化方面。在已报道的玉米转基因工作中，多数是以单交种或农艺性状不良的自交系为材料，获得的转基因植株需经过多代回交和选择才能培育出优良自交系。因此，优良转基因品种的选育周期长，风险大。若以玉米优良自交系为受体进行转化则事半功倍。申请人实验室已发展起以自交系为材料采用农杆菌中介法规模化获得转基因玉米的技术。
玉米转基因植株及其后代的遗传学及基因表达的研究报道很少。已知基因沉默的现象经常碰到，一些外源基因在玉米转基因植株及其后代中不稳定。转基因植株及其后代的遗传学和基因表达的研究在模式植物上已有较多的工作，基因沉默的现象经常碰到，一些外源基因在转基因植株及其后代中不稳定。
小麦胚性愈伤组织的诱导和植株再生普遍受到基因型的限制，适宜的转基因受体体系往往因基因型而异，通常存在着若干缺点，而且转基因过程中所涉及的组织培养、抗性愈伤组织筛选等过程耗时较长，在长期组织培养过程中容易产生体细胞无性系变异等。这些因素均限制了小麦转基因工作的快速发展。因此以栽培品种为基础，寻求不经过组织培养、不受基因型限制的小麦遗传转化受体体系十分必要，这对于小麦基因工程研究和育种实践都具有重要的价值和意义。申请人实验室建立的小麦遗传转化技术(中国发明专利)较好的解决了小麦不同基因型遗传转化的难题。
在作物育种中，急待解决的难题之一是大幅度提高优良育种材料的耐盐耐旱性，从而选育出具有重大突破的品种。要达到此目标，有赖于将多个目标基因聚合到优良材料中，充分利用细胞抗御逆境的不同代谢活动及调节机制。这方面的研究在国内外尚处在起步阶段，尚未确定最佳的技术路线和方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，在本发明中，采用基因聚合的策略，将3个具有重要农艺价值的异源基因导入玉米和小麦，可以培育出耐盐耐旱性大幅度提高的玉米自交系及单交种和小麦优良品种。
本发明的通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法是，将来自植物的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA重组到植物表达载体中，转入玉米或小麦细胞并让其高效表达，进而再生出转基因植株；从转基因植株及其后代中筛选耐盐耐旱性明显提高的转基因纯合体；通过对转基因纯合体细胞进行二次转化或使带有不同转基因的植株相互交配获得带有3个目标基因的转基因植株，再从其后代中选择耐盐耐旱性优异的个体，并进行自交纯合，进而创建出玉米、小麦耐盐耐旱育种新材料；或者直接利用转基因聚合材料生产杂交种子。
其中，上述目标基因NHX1和PPase基因可以分别以融合基因形式串联插入在植物表达载体上，在玉米、小麦细胞内能高效表达；betA基因重组在另一植物表达载体上，由在植物细胞内能启动基因高效表达的启动子启动。
其中，上述NHX1和PPase基因来自盐生植物或非盐生植物。
其中，上述用于遗传转化的玉米、小麦基因型为优良自交系或品种，受体细胞有茎尖分生组织细胞、离体培养的幼胚细胞、成熟胚细胞、胚性愈伤组织细胞或原生质体。
其中，上述对转基因植株进行耐盐抗旱性测定以筛选出耐盐耐旱性明显提高的个体并进行自交或回交。
其中，上述耐盐耐旱性提高的转基因植株通过自交、转基因检测技术获得转基因纯合体。
其中，上述带有不同目标基因的转基因植株可通过再次遗传转化获得带有3个目标基因的植株，后者通过自交产生转基因纯合体。
其中，上述来自同一基因型的带有不同目标基因的转基因纯合体植株彼此交配，产生带有3个目标基因的转基因植株，后者通过2-3代自交和转基因检测获得转基因纯合体。
其中，上述对转基因纯合植株进行耐盐耐旱性检测，从中选择优异材料培育玉米、小麦耐盐耐旱新种质。
其中，上述方法可将转基因聚合植株直接应用于玉米、小麦杂交种子培育。
本发明的基本思路是，依据植物抗逆生理和植物抗逆基因工程研究的新进展，利用植物细胞中与抗逆性相关的代谢途径的调控知识，采用转基因和基因聚合技术，将能够显著提高细胞中甘氨酸甜菜碱含量并明显提高植物玉米、小麦耐盐耐旱性的betA基因、能够大幅度增强细胞Na+区隔化的液泡膜上的钠氢反向转运蛋白基因NHX1和能够提高液泡膜质子梯度增加Na+向液泡储蓄从而增加细胞吸水能力的液泡膜焦磷酸酶基因PPase导入玉米优良自交系或小麦优良品种中，实现这些基因的过表达，从而大幅度提高植株的耐盐耐旱性。由于在转基因操作中选用了对人、畜安全的除草剂抗性基因als(来自于拟南芥，编码突变型乙酰乳酸合成酶，后者是分支氨基酸合成途径中的关键酶)和bar(来自土壤细菌S.hygroscopicus，编码草丁膦乙酰基转移酶(PAT，phosphinothricinacetyltranslase，可以解除草丁膦(phosphinothricin，PPT)和Glufosinate ammonium即草丁膦铵盐的毒性。后者是商用非选择性除草剂bialaphos、Basta、Finale和Liberty等的有效成分)，因此，赋予转基因植物抗除草剂特性。
本发明所用的目标基因为来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA，来自盐芥和拟南芥的编码液泡膜上的钠氢反向转运蛋白基因NHX1、来自盐芥的编码液泡膜上焦磷酸酶基因PPase；所用的植物转基因载体有pCAMB1A1300或pCAMBIA3300派生的载体和pKROII派生的载体。这些派生的载体分别重组进betA基因、NHX1基因和PPase基因，或重组进betA基因和NHX1基因、NHX1基因和PPase基因、betA基因和PPase基因。转基因植物细胞选择标记基因分别为除草剂抗性基因bar和als突变基因。目标基因和转基因植物选择标记基因采用常规分子生物学方法通过多步骤重组插入到植物转基因表达载体中，并通过转基因植物的检测确定了这些基因能在植物中活跃表达，并提高了转基因植物的抗逆性(耐盐耐旱性、耐冷性和除草剂抗性等)。
转基因玉米、小麦采用农杆菌介导法或基因枪轰击法产生，转基因植株用PCR检测、Southern blotting验证，外源基因表达研究采用Northern blotting。植株抗逆性测定采用植物生理学和作物栽培学方法，其中转基因植株耐盐耐旱性测定采用盆栽试验-生理指标测定、盐碱地和干旱池栽培实验和田间多点实验法。转基因遗传稳定性测定采用经典的遗传学方法，结合于PCR检测和系谱分析。转基因聚合采用转基因采用杂交-自交技术和二次转化方法，并通过PCR技术辅助选择。
在玉米遗传转化中，以我国新选育的优良自交系为材料，取无菌萌发的自交系种子、离体培养的丛生芽和胚性愈伤组织为受体，采用农杆菌介导法进行转化。丛生芽来自离体培养芽尖，胚性愈伤组织来自幼胚。由于用玉米优良自交系为转基因受体材料，经选择获得的转基因株系基本保持受体材料的特性，因此，依据杂种优势模式，可将携带数个目的基因的2个自交系进行交配，产生转基因聚合的单交种。也可通过二次转化实现基因聚合。
在小麦遗传转化中，以我国新选育的优良品种为材料，取无菌萌发的种子为受体，采用农杆菌介导法进行转化。转基因植株经选择基本保持原品种特性，一般通过二次转化实现基因聚合，也可将携带数个目的基因转基因植株进行人工套袋姊妹交，实现目的基因聚合。
分子标记在作物抗逆育种中越来越多地得到应用。目的基因和其启动子的部分DNA序列是理想的分子标记，利用这些标记不仅能检测到转基因是否存在于姊妹交植株的自交后代中，而且起到了辅助定向选择作用。本发明利用转基因分子标记加速转基因聚合和转基因在不同基因型间的转移。
本发明实施的具体步骤为1)将目的基因和植物转化细胞选择标记基因以不同组合(基本组合为1或2个目的基因加1个选择标记基因)的方式重组到植物表达载体中，并导入到大肠杆菌或/和农杆菌中。
2)通过转基因方法将目标基因转入玉米、小麦细胞中，获得转基因植株。通过分子检测和植株抗逆性测定选出目的基因稳定表达且植株抗性明显提高的转基因植株。后者用于转基因聚合。
3)利用入选的转基因植株或其自交结实的种子为材料，通过二次转化法或姊妹交结籽达到转基因聚合。对二次转化产生的植株和通过姊妹交获得的植株进行PCR检测，选出转基因聚合的植株。在进行二次转化中，所用的植物转基因表达载体所带的植物细胞选择标记基因必须与初次转化所用的表达载体上的植物细胞选择标记基因不同，以利于选择出二次转化体。若植物转基因表达载体不带有植物选择标记基因，虽通过PCR检测可获得转基因植株，但效率很低。
4)转基因聚合材料的抗逆性鉴定和利用。对获得的不同转基因聚合材料，根据目的基因表达产物的生理作用，进行相应的生理生化指标检测，并通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，筛选出耐盐耐旱性明显提高的转基因育种材料或杂交组合(单交种)。
具体实施例方式
以下叙述本发明的实施例。需说明的是，本发明的实施例只对本发明起说明作用而没有限制作用。
实施例1创制耐盐耐旱性优异的玉米自交系1.玉米转基因植株的获得玉米骨干自交系种子，用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上，在黑暗条件下继续萌发。待胚芽伸长至3-5厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥进行转化。
将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有除草剂抗性基因als和目的基因betA，或带有除草剂抗性基因bar和目的基因NHX1和PPase基因)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中28℃下分别震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。
将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，将剥离胚芽鞘及幼叶裸露出茎尖生长锥的无菌苗顶端浸泡在菌液中2-5分钟(AGL1 2分钟，LBA44045分钟)，并附以0.5×105Pa大气压下处理。用无菌滤纸吸干浸染后的芽尖，将根部插入改良MS培养基中于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃，然后将无菌苗放在散射光下培养2天。将照光培养后的转化植株移栽到铺有上层蛭石和下层壤土的花盆中，蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温18-23℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。待转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂绿黄隆(转基因选择标记基因为als)或除草剂Finale(转基因选择标记基因为bar)水溶液，以未转化植株为对照。喷洒量以植株掉液滴为宜。未转化植株在喷洒后3天停止生长，7-10天左右开始死亡。转化处理后的植株，一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体则持续生长，无明显变化。植株长到5叶期，将其定植到田间。
抗除草剂转化植株生长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，对PCR阳性植株进行Southern blotting检测。约30％的抗除草剂植株为转基因个体。
2.转基因植株的管理和抗性检测转基因植株开花后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，植株长到4-6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因。取转基因阳性植株进行抗逆性测定。
对于转betA基因的小苗在干旱或高盐处理前后取叶片测定甘氨酸甜菜碱含量，筛选目的基因表达高的植株套袋自交结籽。同时，对同一株系的植株进行耐盐性测定和干旱胁迫处理，以及农艺性状的观测，测定与植株耐盐耐旱性相关的生理生化指标，确定植株耐盐耐旱的最高级别。综合植株农艺性状、甘氨酸甜菜碱含量和其它生理生化测定指标、和盆栽干旱和盐胁迫处理的结果等，选择出耐盐耐旱性优良的材料用于转基因聚合。
对于转NHX1和PPase基因的小苗用高盐(NaCl)溶液进行胁迫处理，在处理前后取叶片测细胞Na+、K+和Ca2+离子含量，并观测不同NaCl浓度处理下植株的生长势、存活率和受害情况，对苗期表现出优良耐盐性的植株取来自同一转化体的后代种子播种在花盆或盐碱地，进行全生育期耐盐耐旱测定。综合植株农艺性状、叶细胞Na+、K+和Ca2+离子含量测定结果及叶片水势变化和其它生理生化测定指标、盆栽和盐碱地实验结果等，选择出耐盐耐旱性优良的材料用于转基因聚合。
3.转基因聚合和耐盐耐旱植株的利用转基因聚合可通过三条途径进行第一条途径为，以转基因纯合的转betA基因(或NHX1和PPase基因)的植株自交种子为材料，按照本实例“玉米转基因植株的获得”部分所介绍的方法将NHX1和PPase基因(或betA基因)转入，经自交纯合、耐盐耐旱性检测和农艺性状选择等步骤，获得综合性状好的耐盐耐旱性状优异的自交系。
第二条途径为，以来自同一自交系的分别转betA基因和NHX1及PPase基因的植株互为父、母本，进行交配，产生聚合有3个目的基因的后代。由于玉米雌雄穗分开，该途径具有效率高，成本低，易操作等优点。
第三条途径为，直接利用A自交系的转betA基因的纯合植株与B自交系的转NHX1和PPase基因的植株进行杂交，产生杂种种子。该杂种携带来自双亲的3个目标基因。为了使该杂交种有生产上利用价值，A自交系和B自交系间必须有很好的杂种优势。这样可直接获得可用于农业生产的耐盐耐旱单交种。
对于转基因聚合材料，一般通过和本实例“转基因植株的管理和抗性检测”部分阐述的方法和程序进行耐旱耐盐性测定及综合性状选择，对获得的优异材料用于玉米育种或生产实践。
实施例2创制耐盐耐旱性优异的小麦育种材料1.小麦转基因植株的获得选择优良品种如济南17、稳千一号等进行农杆菌为中介的遗传转化。(1)将无菌小麦黄化苗的须根全部切除，用解剖针和解剖刀剥除胚芽鞘及1-2片幼叶，暴露出茎尖生长锥，然后用解剖针刺伤茎尖生长锥。(2)倾斜4.5cm直径的无菌培养皿，倒入加有乙酰丁香酮的LBA4404菌(Mini-Ti质粒带有除草剂抗性基因bar和目的基因betA和NHX1，或带有除草剂抗性基因bar和目的基因PPase基因)液(OD600＝0.8)，将裸露出茎尖生长锥的无菌种子浸泡在菌液中6-8min，在此期间用0.5×105Pa大气压下处理以促进农杆菌渗入。(3)用无菌滤纸吸干小麦种子腹面沾染的菌液，然后腹面向下放在萌发培养基上，露出浸染过的茎尖，在25℃暗培养2-3天。(4)将转化小苗移栽到上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖小芽顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-25℃，夜温15-20℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。(5)转化小苗成活后用除草剂Finale筛选(0.1％浓度)，成活小苗长至3-4叶时移栽到大田越冬。(6)用PCR方法检测移栽成活的植株，并用Southern杂交验证PCR阳性植株，获得转基因植株。转基因植株返青后生长发育正常，植株形态和生育期等和未转基因植株相比无明显差异。
本实例中，农杆菌培养同实施例1，但农杆菌中的Mini-Ti质粒或带有除草剂抗性基因bar和目的基因betA、NHX1，或带有除草剂抗性基因bar和目的基因PPase。前一Mini-Ti质粒的bar基因由组成型启动子启动，在转基因细胞中可持续表达。后一Mini-Ti质粒的bar基因由乙醇诱导型启动子启动，当不用乙醇处理细胞时bar基因不表达，因此转基因细胞仍对除草剂Finale敏感。因此，当用携带后一质粒的农杆菌转化细胞后，可用乙醇水溶液处理转化小苗，3-4小时后再用除草剂Finale溶液处理小苗。在用乙醇水溶液和除草剂Finale溶液处理一次后，植株恢复3天，再用乙醇水溶液和除草剂Finale溶液处理一次。本工作中，所用除草剂为水剂，小麦大田喷施浓度为3.6mlFinale/L水溶液。因移栽到蛭石中的小苗很小，可用Finale水溶液浸泡的脱脂棉块覆盖小苗顶部的方法进行抗除草剂植株的筛选，一般用脱脂棉块覆盖24小时以上。经除草剂筛选后，大部分转化植株死亡，存活植株仍继续生长。
2.转基因植株的管理和抗性检测存活植株长到4-5叶期时移栽到田间，按照常规管理方法进行管理。单穗收获种子供遗传稳定性分析和耐盐耐旱性鉴定等。
(1)转betA和NHX1基因小麦的耐盐性测定转betA和NHX1小麦的T1代种子种在沙盆中，用1.5或2.0％NaCl(因供体品种基因型定)水溶液浇灌15天，然后再浇灌含1.5或2.0％NaCl的Hogland溶液，播种45天后，统计耐盐种子萌发率和小苗成活率。耐盐植株移栽至大田，并对其进行PCR检测和目的基因表达强度的检测。
若将转betA基因的济南17种子(T1代)和对照种子(济南17)播种后用2.0％盐水浇灌，对照种子吸涨后发育很慢或停止发育，只有少数种子在23天后露出胚根，一个月后产生单叶小苗，然后逐渐死亡，45天时无存活小苗；多数转基因植株的种子耐盐性强，一些种子在播种7天时已开始萌发，10天左右出苗。在用1.5％NaCl水溶液浇灌15天后，改用含2.0％NaCl的Hoagland溶液浇灌，多数T1代小苗随着盐水浇灌时间延长长势变差，逐渐死亡。45天后存活小苗一般叶片肥厚。将存活小苗移栽到大田，植株生长变快，叶片变薄，在4-6片叶时进行PCR和PCR-Southern检测，表明多数植株含有外源基因。
(2)转betA和NHX1基因小麦的盐碱地种植由于小麦对盐害的敏感期为出苗和越冬后的返青期，在起身后耐盐性较强。为了获得具有应用价值的数据，将筛选出的耐盐植株产生的种子播种在盐碱地中，统计出苗率、越冬前单株分蘖数、返青后存活率、单株成穗数、单株子粒数和千粒重等。结果表明转基因植株比未转基因的对照有显著提高的耐盐性。小麦通常只在含盐量0.3％以下的土地中种植，而获得的转基因小麦具有优异的耐盐性，可含盐量0.4-0.6％土地上丰产。
3.转基因聚合和耐盐植株的利用转基因聚合可通过二条途径进行第一条途径为，以转基因纯合的转betA和NHX1基因(或PPase基因)的植株种子为材料，按照本实例“小麦转基因植株的获得”部分所介绍的方法将PPase基因(或betA和NHX1基因)转入，经自交纯合、耐盐耐旱性检测和农艺性状选择等步骤，获得综合性状好的耐盐耐旱性状优异的转基因纯合体。
第二条途径为，以来自同一自交系的分别转betA及NHX1基因和PPase基因的植株互为父、母本，进行人工去雄、授粉，进行姊妹交配，产生聚合有3个目的基因的后代。该途径具有成本低，易操作等优点。
对于转基因聚合材料，一般按照本实例中“转基因植株的管理和抗性检测”部分阐述的方法和程序进行耐盐性测定及综合性状选择，对获得的优异材料用于小麦育种。
权利要求
1.一种通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，其特征是，将来自植物的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA重组到植物表达载体中，转入玉米或小麦细胞并让其高效表达，进而再生出转基因植株；从转基因植株及其后代中筛选耐盐耐旱性明显提高的转基因纯合体；通过对转基因纯合体细胞进行二次转化或使带有不同转基因的植株相互交配获得带有3个目标基因的转基因植株，再从其后代中选择耐盐耐旱性优异的个体，并进行自交纯合，进而创建出玉米、小麦耐盐耐旱育种新材料；或者直接利用转基因聚合材料生产杂交种子。
2.如权利要求1所述的通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，其特征是，目标基因NHX1和PPase基因可以分别以融合基因形式串联插入在植物表达载体上，在玉米、小麦细胞内能高效表达；betA基因重组在另一植物表达载体上，由在植物细胞内能启动基因高效表达的启动子启动。
3.如权利要求2所述的通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，其特征是，NHX1和PPase基因来自盐生植物或非盐生植物。
4.如权利要求1所述的通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，其特征是，用于遗传转化的玉米、小麦基因型为优良自交系或品种，受体细胞有茎尖分生组织细胞、离体培养的幼胚细胞、成熟胚细胞、胚性愈伤组织细胞或原生质体。
5.如权利要求1所述的通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，其特征是，对转基因植株进行耐盐抗旱性测定以筛选出耐盐耐旱性明显提高的个体并进行自交或回交。
6.如权利要求1所述的通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，其特征是，耐盐耐旱性提高的转基因植株通过自交、转基因检测技术获得转基因纯合体。
7.如权利要求1所述的通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，其特征是，带有不同目标基因的转基因植株可通过再次遗传转化获得带有3个目标基因的植株，后者通过自交产生转基因纯合体。
8.如权利要求1所述的通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，其特征是，来自同一基因型的带有不同目标基因的转基因纯合体植株彼此交配，产生带有3个目标基因的转基因植株，后者通过2-3代自交和转基因检测获得转基因纯合体。
9.如权利要求1、7或8所述的通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，其特征是，对转基因纯合植株进行耐盐耐旱性检测，从中选择优异材料培育玉米、小麦耐盐耐旱新种质。
10.如权利要求1所述的通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，其特征是，可将转基因聚合植株直接应用于玉米、小麦杂交种子培育。
全文摘要
本发明公开一种通过转基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麦耐盐耐旱性的方法，是将来自植物的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA重组到植物表达载体中，转入玉米或小麦细胞并让其高效表达，进而再生出转基因植株；从转基因植株及其后代中筛选耐盐耐旱性明显提高的转基因纯合体；通过对转基因纯合体细胞进行二次转化或使带有不同转基因的植株相互交配获得带有3个目标基因的转基因植株，再从其后代中选择耐盐耐旱性优异的个体，并进行自交纯合，进而创建出玉米、小麦耐盐耐旱育种新材料；或者直接利用转基因聚合材料生产杂交种子。
文档编号C12N15/53GK1769463SQ20051004479
公开日2006年5月10日 申请日期2005年9月22日 优先权日2005年9月22日
发明者张举仁, 杨爱芳, 谷晓峰, 张可炜, 尹小燕 申请人:山东大学