专利名称：牙鲆抗病相关mhc基因标记及其辅助育种方法
技术领域：
本发明属于水产生物技术领域中的鱼类分子标记辅助育种技术，是一种能在鱼类抗病品种培育中应用的鱼类抗病相关基因标记及其辅助育种方法。
背景技术：
病害是限制水产养殖业快速发展的瓶颈，由于缺乏优良抗病品种，我国每年因病害给鱼类养殖业造成的直接经济损失高达上百亿元人民币。长期以来，由于忽视对鱼类抗病机理和抗病功能基因的研究，缺少抗病相关的基因标记和分子标记，导致鱼类抗病品种培育的研究进展缓慢，国内外有关鱼类抗病相关基因标记报道极少，也未见有关鱼类抗病优良品种培育的报道。
主要组织相容性复合体(MHC)基因编码细胞表面糖蛋白，编码的糖蛋白能与抗原多肽结合，通过与T细胞的相互作用，形成一个三元复合体，诱导和调节机体的免疫应答，激发机体特异性免疫反应。一般来说，鱼类的MHC I类分子结构和哺乳动物相似，是由α链和β2-微球蛋白非共价连接形成的异二聚体。鱼类的MHC II类分子是由α链和β链组成的异二聚体。自1990年Hashimoto et al.在硬骨鱼-鲤鱼中第一次报道了MHC基因至今，迄今已对大多数脊椎动物的MHC I、IIα、IIβ基因进行了克隆研究，如软骨鱼、硬骨鱼、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类。研究表明MHC基因是目前已知的多态性最丰富的一个基因系统，存在大量的基因座位，每个基因座位又存在着大量的等位基因，这种多态性导致了每个个体都能结合和呈递相当数量的与免疫反应有直接功能相关性的多肽，其中多态性位点主要在外显子2上。在脊椎动物的研究表明，MHC复合物在机体免疫反应中起着重要的作用，而且特殊的MHC等位基因与机体抗病力有关，这在鸡、鼠、羊和人等生物都有过相关报道。在鱼类，目前已经克隆了虹鳟(Grimholt et al.，2000)，真鲷(Chen et al.，2005)，沟鲶(Liu et al.，2004)和大菱鲆(Zhang and Chen，2005)等鱼类的MHC基因，但有关MHC基因多态性与牙鲆等海水鱼类抗病力的相互关系以及应用抗病相关MHC基因标记进行抗病分子辅助育种的研究目前国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了筛选出牙鲆抗病相关的MHC基因标记，建立牙鲆分子标记辅助育种方法，为牙鲆抗病品种培育提供基因标记和技术方法。
本发明其技术内容如下一、牙鲆抗病相关MHC基因标记，包括1、MHC II B基因的克隆；2、抗病群体和敏感群体的制备；3、抗病相关MHC基因标记的筛选；二、牙鲆抗病相关MHC基因标记辅助育种方法。
一、牙鲆抗病相关MHC基因标记，包括1、牙鲆MHC II B基因的克隆；2、抗病群体和敏感群体的制备；3、抗病相关MHC基因标记的筛选1、牙鲆MHC II B基因的克隆包括cDNA克隆、基因组DNA序列的获得、MHCIIB蛋白质序列比对。
1).cDNA的扩增和克隆利用TRIzol试剂盒从鱼类肝脏中提取总RNA，利用M-MLV反转录得到cDNA第一条链，并利用Smart RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)分别合成5’-和3’-RACE-Ready-cDNA，RACEPCR反应备用。根据不同物种MHC IIB的氨基酸序列的同源性设计简并引物，得到一段MHC II B基因的cDNA片段。根据所得片段设计特异引物进行RACE PCR。获得1182个碱基的MHCIIB全长cDNA序列，包括741个碱基的编码区，33bp的5’不翻译区和407bp的3’末端不翻译区，并且具有一个脊椎动物典型的加尾信号AATAAA和27bp的PolyA尾巴。
2).基因组DNA序列的获得根据其它亲缘关系相近鱼类的已知MHC II B外显子和内含子的分界位点设计特异引物进行内含子的扩增。结果表明牙鲆MHC II B基因组与其它脊椎动物的MHC II B基因组结构类似，包含有5个外显子和4个内含子，PCR扩增获得了全部4个内含子，其中内含子1，2，3和4的长度分别为96/84bp，392bp，85bp和109bp，而5个外显子的长度分别为85bp，279bp，274bp，114bp和430bp。测定了全部5个外显子和4个内含子的序列，因此获得了牙鲆MHC基因全长序列。
3).MHCIIB蛋白质序列比对通过DNAMAN推测得到741bp编码区所编码的246bp的蛋白质序列，其分子量为27.78KD，等电点为6.69。经MEGA2.0软件分析此蛋白质序列与已知的其它脊椎动物(大西洋鲑、鲤鱼、丽鱼、人、鼠、鲨鱼、虹鳟、真鲷、鲈鱼和斑马鱼)的MHC II B的蛋白质序列，结果表明牙鲆MHCIIB蛋白质序列与真鲷、鲈鱼和丽鱼的亲缘关系最近，与大西洋鲑、鲤鱼和虹鳟的关系次之，与鲨鱼、鼠和人的亲缘关系最远。
2、抗病群体和敏感群体的制备采用自然选择和人工感染途径获得抗病群体和不抗病群体。在发病旺季，从养殖场收集发病后存活的个体，同时用病原菌感染收集来的鱼苗，根据对病原菌感染的抵抗能力大小获得抗病群体和不抗病群体两个基础群体。
3、抗病相关MHC基因标记的筛选总共对84个个体的411个阳性克隆进行了测序，结果表明，共有13种不同的核苷酸序列，分别编码13种不同的氨基酸序列(Paol-allele*aPaol-allele*m)。411个阳性克隆质粒中的280/268bp的外源序列，去除中间的内含子序列，共编码61个氨基酸，通过与人类MHC II B的氨基酸序列比对，确定本研究所得的MHCIIB基因的氨基酸区段对应位点为22～82，其中抗原结合位点分别为第35、37、39、56、58、60、65、66和第75位。在总的编码区内，多态性位点13个，其中多肽结合位点为6个，占多态位点的46.15％。在13种不同的氨基酸序列(Paol-allele*a-Paol-allele*m)中，Paol-allele*a-Paol-allele*f和Paol-allele*j，Paol-allele*k，Paol-allele*i，Paol-allele*m是抗病群体和感病群体所共有的。即基因型a，b，c，d，e，f，i，j，k和m同时出现于抗病群体和不抗病群体，基因型g和h只出现在抗病群体中，而基因型l只出现在感病群体中。不同等位基因在抗病群体和感病群体中的分布。因此，基因型g和h被认为是抗病相关的MHC基因标记，而基因型l则被认为可能是疾病敏感相关的MHC基因标记。
二、牙鲆抗病相关MHC基因标记辅助育种方法将只在抗病群体中出现的MHCIIB基因型作为抗病相关MHC基因标记，将携带这些抗病基因标记的鱼进行繁殖，培育后代，分离后代中的MHCIIB基因，研究MHCIIB基因的多态性，同时进行病原微生物感染实验，研究抗病MHCIIB基因标记的遗传规律及其与鱼体抗病力的关系，从中筛选出既含有抗病MHCIIB基因标记，抗病力又提高的鱼苗，进行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品种。
本发明与已有技术对比其特点是本发明采用功能基因组技术，以牙鲆为材料首次建立了我国养殖鱼类抗病相关MHC基因标记，初步建立了牙鲆抗病MHC基因标记辅助育种技术，该技术具有针对性强、选育效率高、选育周期短等特点，为鱼类抗病品种培育开辟了新的分子育种技术途径，适宜在所有养殖鱼类上推广应用，对养殖鱼类抗病品种培育具有重要意义和应用价值。
图1牙鲆MHC II B全基因序列及其推导的氨基酸序列图2牙鲆MHC II B 13种不同的基因型图3牙鲆MHC II B 13种不同的基因型在抗病群体和感病群体中的分布频率以及相应的卡方检验；
具体实施例方式下面以牙鲆抗病相关MHC基因标记的筛选及其辅助育种技术的建立为例，对本发明的技术内容进行详细说明。
一、牙鲆抗病相关MHC基因标记的筛选，包括1、牙鲆MHC II B基因的克隆；2、牙鲆抗病群体和敏感群体的制备；3、牙鲆抗病相关MHC基因标记的筛选1.牙鲆MHC II B基因的克隆包括cDNA克隆、基因组DNA序列的获得、MHCIIB蛋白质序列比对。
1)、cDNA的扩增和克隆利用TRIzol试剂盒从牙鲆肝脏中提取总RNA，利用M-MLV反转录得到cDNA第一条链，并利用Smart RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)分别合成5’-和3’-RACE-Ready-cDNA，RACEPCR反应备用。根据不同物种MHC II B的氨基酸序列的同源性设计简并引物dfMHCF(5’-GGTWTGTSGGWTACACTGA-3’)dfMHCR(5’-TCAGTGGYYGTSACATC AGA-3’)(W＝A/T；S＝G/C；Y＝C/T)，扩增得到牙鲆MHCII B基因的cDNA片段，其长度为295bp。根据所得片段设计基因特异引物GSP5’(5’-GTGACTTCCTG TCCGTCTCTTTGCCA-3’)和GSP3’(5’-GGAATCAAGAACGCTGAGAGGTGGAA-3’)，分别进行5’和3’RACE PCR，得到5’RACE约500bp的特异带和3’RACE约950bp的特异带。经Dnaman分析去除重叠序列(260bp)和接头序列后得到1182bp的全长cDNA序列，该MHC II B cDNA由741bp编码区(其分子量为27.78KD，PH为6.69)，33bp的5’UTR区和407bp的3’UTR区组成，并且具有一个脊椎动物典型的加尾信号AATAAA和27bp的PolyA尾巴。
2)、基因组DNA序列的获得根据其它亲缘关系相近鱼类的已知MHC II B外显子和内含子的分界位点设计特异引物进行了内含子的扩增。与其它脊椎动物的MHC II B基因组结构类似，牙鲆MHCIIB基因组包含有5个外显子和4个内含子。PCR扩增获得了全部4个内含子，其中内含子1，2，3和4的长度分别为96/84bp，392bp，85bp和109bp，而5个外显子的长度分别为85bp，279bp，274bp，114bp和430bp。测定了全部5个外显子和4个内含子的序列，因此获得了牙鲆MHC基因全长序列(图1)。
3)、MHCIIB基因序列比对通过DNAMAN推测得到了其中741bp编码区所编码的246bp的蛋白质序列，其分子量为27.78KD，PH为6.69。经MEGA 2.0分析此蛋白质序列与已知的其它脊椎动物(大西洋鲑、鲤鱼、丽鱼、人、鼠、鲨鱼、虹鳟、真鲷、鲈鱼和斑马鱼)的MHC II B的蛋白质序列相比，其同源性分别为57.6％，55.7％，66.4％，34.4％，34.0％，28.3％，55.3％，72.5％，72.1％和51.0％。此结果表明牙鲆的MHC II B序列与真鲷、鲈鱼和丽鱼的亲缘关系较近，与大西洋鲑、鲤鱼和虹鳟的关系次之，与鲨鱼、鼠和人的亲缘关系最远。推测的牙鲆MHC II B氨基酸与鱼类、鼠和人的MHC II B氨基酸序列比较结果，在24个与抗原多肽结合的相关氨基酸中，其中61位酪氨酸(Y)、63位酪氨酸(Y)、78位苯丙氨酸(F)、87位赖氨酸(K)、99位亮氨酸(L)、105位谷氨酸(E)、109位酪氨酸(Y)在鱼类中基本保守，113位上的天冬氨酸(N)在鱼类、鼠和人中都存在。
2.牙鲆抗病群体和敏感群体的制备采用自然选择和人工感染途径获得抗病群体和不抗病群体。在牙鲆发病旺季，从养殖场收集发病后存活的个体，同时用鳗弧菌感染收集来的鱼苗，根据对病原菌感染的抵抗能力大小获得抗病群体和不抗病群体两个基础群体。
3.牙鲆抗病相关MHC基因标记的筛选总共对来自42个抗病个体和42个不抗病个体的411个MHC基因克隆进行了测序，结果表明，共有13种不同的核苷酸序列，分别编码13种不同的氨基酸序列(Paol-allele*a Paol-allele*m)。在13种不同的核苷酸序列中，有5种不同的内含子1序列，其中有12个核苷酸插入/缺失突变，2个核苷酸转换和2个核苷酸颠换。84个个体中，有59个个体表现两种或两种以上不同序列，占总个体数的70.2％；59个个体中有5个个体表现出3个以上不同序列，占8.47％；5个个体中有1个个体表现5种不同序列，表明至少存在3个不同的MHCIIB位点。411个阳性克隆质粒中的280/268bp的外源序列，去除中间的内含子序列，共编码61个氨基酸，通过与人类MHCIIB的氨基酸序列比对，确定本研究所得的MHCIIB基因的氨基酸区段对应位点为22～82，其中抗原结合位点(PBR)分别为第35、37、39、56、58、60、65、66和第75位。280/268bp的核苷酸序列中，32个核苷酸在外显子1内，编码10个氨基酸，其中未发现有核苷酸变异；96/84bp的内含子1序列；152bp的外显子2序列，编码51个氨基酸，有25个核苷酸变异位点，其中14个颠换，10个转换，1个既有转换又有颠换。在总的编码区内，多态性位点13个，其中多肽结合位点为6个，占多态位点的46.15％。
在13种不同的氨基酸序列(Paol-allele*a Paol-allele*m)中，Paol-allele*a Paol-allele*f和Paol-allele*j，Paol-allele*k，Paol-allele*i，Paol-allele*m基因型是抗病群体和感病群体所共有。即基因型a，b，c，d，e，f，i，j，k和m同时出现于抗病群体和不抗病群体，基因型g和h只出现在抗病群体中(其序列见图2)，而基因型l只出现在感病群体中。不同等位基因在抗病群体和感病群体中的分布见图3。经Chi-square Test分析后，基因型d和l在感病群体中出现的频率明显高于在抗病群体中出现的频率，而基因型g和h在抗病群体中出现的频率明显高于在感病群体中出现的频率(表1)。因此，基因型g和h被认为是抗病相关的MHC基因标记，而基因型l则被认为可能是疾病敏感相关的MHC基因标记。
表1牙鲆MHC II B 13种基因型在抗病群体和感病群体中分布频率的卡方检验
二、牙鲆抗病相关MHC基因标记辅助育种方法将只在牙鲆抗病群体中出现的MHCIIB基因型g和h作为抗病相关基因标记，将携带这些抗病基因标记的鱼进行繁殖，培育后代，分离后代个体中的MHCIIB基因，研究MHCIIB基因的多态性，同时进行病原微生物感染实验，研究抗病相关MHCIIB基因标记的遗传规律及其与鱼体抗病力的关系，从中筛选出既含有抗病相关MHCIIB基因标记，且抗病力又提高的鱼苗，进行培育和繁殖后即可建立抗病优良品种。
序列表<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所<120>牙鲆抗病相关MHC基因标记及其辅助育种方法<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1864<212>DNA<213>牙鲆(Paralichthys olivaceus)<400>1acgcggggag tgttcgtcaa gtgaacagag gaacatggct tcattcatcc tcagcttctc 60cctcttcttc atcacggtct gcacagcagg taggatcaga acactgatca ctgatcaata120cactgatcaa tacactgatc aatacatgga tcattctctg actcgttttc ttgtctgctc180ttcagatgga tttctgcatt atacggtgac agactgtgag tttaactcct cgaagctgaa240cgacatcgag tacacacagt cttactatta caacaaactg gagatcgtca ggttcagcag300cagtgtgggg aagtacgttg gatacactga gtttggaatc aagaacgctg agaggtggaa360caatggtcca gaggtgatct ctagaagagg tgagaaggag agctactgct ttcacaacgt420tggaatcttc acagaatctg ctctgacgaa gtcaggtgag tgtgtgtgtg ttgtatgtgt480gtgagtgtgt gttgtatgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtttgga ttgtatgtgt540gagtgtgtgt tgtatgtgtt gtatgtgtgt gtgttgtgtg tgttcttcat gttccagatg600aaattcataa agaatctgat gagtcaaact tttatttatt gtctttgttt cctggaaata660gactcagctc ggtgtcacca cctgctggtc acacgctgta actacagccg ctgacactga720agcttctctt tgcttcttta tgaaataaaa taaaggatga aacaatcctc tgatgttttc780agttgatcaa tcgaaccaca gactaagatc cagttcacac ctgacgtgac caacatctgt840cttccagcca aaccctacgt caggcttaac tctgtggcgc ccccagctgg caaacatgcc900atgttggtct gcagcgtctt tgacttctac cccaaacgga tcaaagtgag ctggcaaaga960gacggacagg aagtcacctc tgatgtcact tccactgatg agctggcaga cggtgattgg 1020tactaccaga tccactccca cctggagtac atgcccaagt ctggagagaa gatttcctgt 1080gtggtggaac atgccagcct gagtaaacct ctgatcactg actggggtaa atacctgtct 1140
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85 90 95Val Gly Ile Phe Thr Glu Ser Ala Leu Thr Lys Ser Ala Lys Pro Tyr100 105 110Val Arg Leu Asn Ser Val Ala Pro Pro Ala Gly Lys His Ala Met Leu115 120 125Val Cys Ser Val Phe Asp Phe Tyr Pro Lys Arg Ile Lys Val Ser Trp130 135 140Gln Arg Asp Gly Gln Glu Val Thr Ser Asp Val Thr Ser Thr Asp Glu145 150 155 160Leu Ala Asp Gly Asp Trp Tyr Tyr Gln Ile His Ser His Leu Glu Tyr165 170 175Met Pro Lys Ser Gly Glu Lys Ile Ser Cys Val Val Glu His Ala Ser180 185 190Leu Ser Lys Pro Leu Ile Thr Asp Trp Asp Pro Ser Met Pro Glu Ser195 200 205Glu Arg Asn Lys Ile Ala Ile Gly Thr Ser Gly Leu Ile Leu Gly Leu210 215 220Thr Leu Ser Leu Ala Gly Phe Ile Tyr Tyr Lys Arg Lys Ala Gln Gly225 230 235 240Arg Asp Pro Gly Ser His24权利要求
1.一种牙鲆抗病相关MHC基因标记，其特征在在于它的技术内容包括如下三个方面1)、牙鲆MHC II B基因的克隆；2)、抗病群体和敏感群体的制备；3)、抗病相关MHC基因标记的筛选；1)、牙鲆MHC II B基因的克隆利用TRIzol试剂盒从鱼类肝脏中提取总RNA，利用M-MLV反转录得到cDNA第一条链，并利用Smart RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)分别合成5’-和3’-RACE-Ready-cDNA，RACE PCR反应备用；根据不同物种MHC II B的氨基酸序列的同源性设计简并引物，得到一段MHC II B基因的cDNA片段；根据所得片段设计特异引物进行RACEPCR；获得1182个碱基的MHCIIB全长cDNA序列，包括741个碱基的编码区，33bp的5’不翻译区和407bp的3’末端不翻译区，并且具有一个脊椎动物典型的加尾信号AATAAA和27bp的PolyA尾巴；根据其它亲缘关系相近鱼类的已知MHC II B外显子和内含子的分界位点设计特异引物进行内含子扩增；结果表明牙鲆MHC II B基因组与其它脊椎动物的MHC II B基因组结构类似，包含有5个外显子和4个内含子，其中5个外显子的长度分别为85bp，279bp，274bp，114bp和430bp，而内含子1，2，3和4的长度分别为96/84bp，392bp，85bp和109bp；测定了全部5个外显子和4个内含子的序列，获得了牙鲆MHCIIB全基因序列；牙鲆MHCIIB基因及其推导的氨基酸序列1 ACGCGGGGAGTGTTCGTCAAGTGAACAGAGGAAC35 ATGGCTTCATTCATCCTCAGCTTCTCCCTCTTCTTCATCACGGTCTGCACAGcaggtaggatcagaacactgatcactgatcaatacact1M A S F I L S F S L F F I T V C T125 gatcaatacactgatcaatacatggatcattctctgactcgttttcttgtctgctcttCAGATGGATTTCTGCATTATACGGTGACAGAC18A D G F L H Y T V T D215 TGTGAGTTTAACTCCTCGAAGCTGAACGACATCGAGTACACACAGTCTTACTATTACAACAAACTGGAGATCGTCAGGTTCAGCAGCAGT29 C E F N S S K L N D I E Y T Q S Y Y Y N K L E I V R F S S S305 GTGGGGAAGTACGTTGGATACACTGAGTTTGGAATCAAGAACGCTGAGAGGTGGAACAATGGTCCAGAGGTGATCTCTAGAAGAGGTGAG59 V G K Y V G Y T E F G I K N A E R W N N G P E V I S R R G E395 AAGGAGAGCTACTGCTTTCACAACGTTGGAATCTTCACAGAATCTGCTCTGACGAAGTCAGgtgagtgtgtgtgtgttgtatgtgtgtga89 K E S Y C F H N V G I F T E S A L T K S485 gtgtgtgttgtatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtttggattgtatgtgtgagtgtgtgttgtatgtgttgtatgtgtgtgtgt575 tgtgtgtgttcttcatgttccagatgaaattcataaagaatctgatgagtcaaacttttatttattgtctttgtttcctggaaatagact665 cagctcggtgtcaccacctgctggtcacacgctgtaactacagccgctgacactgaagcttctctttgcttctttatgaaataaaataaa755 ggatgaaacaatcctctgatgttttcagttgatcaatcgaaccacagactaagatccagttcacacctgacgtgaccaacatctgtcttc845 cagCCAAACCCTACGTCAGGCTTAACTCTGTGGCGCCCCCAGCTGGCAaaCATGCCATGTTGGTCTGCAGCGTCTTTGACTTCTACCCCA109A K P Y V R L N S V A P P A G K H A M L V C S V F D F Y P935 AACGGATCAAAGTGAGCTGGCAAAGAGACGGACAGGAAGTCACCTCTGATGTCACTTCCACTGATGAGCTGGCAGACGGTGATTGGTACT138 K R I K V S W Q R D G Q E V T S D V T S T D E L A D G D W Y1025ACCAGATCCACTCCCACCTGGAGTACATGCCCAAGTCTGGAGAGAAGATTTCCTGTGTGGTGGAACATGCCAGCCTGAGTAAACCTCTGA168 Y Q I H S H L E Y M P K S G E K I S C V V E H A S L S K P L1115TCACTGACTGGGAgtaaatacctgtctgtcacttgtctgtctgccccctcgtctgtgtgctcacctgctcagctgtctttctccctttct198 I T D W D1205gtgctcagTCCATCCATGCCTGAGTCAGAAAGAAACAAGATCGCTATTGGGACCTCAGGACTGATCCTGGGTCTGACCTTATCTCTGGCT203 P S M P E S E R N K I A I G T S G L I L G L T L S L A1295GGATTCATCTACTACAAGAGGAAGGCCCAAGgtcagagccagaaacccatttcacaccagtttatacagaccaaatccagtttagaccag230 G F I Y Y K R K A Q1385ttttaatggtgtgtatttgttttgacccttgtctcttctctttaaaccagGACGGGATCCTGGTTCCCACTAACTGAGTCTTGTCCTGGA240 G R D P G S H *1475CCTGGACTTGGTCCTGGATCTATTTCTGTTTTCCTGATGGAAGTAAAATTAGCTGCTGCTTCAACCTGCTTTCTGTTTTCAGTCCAGCAG1565ACTCAGCGCTGCCACCTGCTGGACTTGCTGAACACCAAATTCTCTGATGGTCTGTGCTGGTCTGAACCTGATCTAGAACCAGTCCTGTTC1655TCACTGTGGATCCAGACTCTGGTACATCAGCTGGATCACAAACACCTGATTTGTTGCTTCACGGTGTGAAATCTATATTTTTTTTCTCAT1745CCTCCTGTTGTTAAACAGTTTTAAATCCTCTTTGATTCAGATCTCAGGTGTCTATACTTTTACTGTTTTCTAATCAAAATAAACTTTGAA1835CCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。2)、抗病群体和敏感群体的制备采用自然选择和人工感染途径获得抗病群体和不抗病群体；在发病旺季，从养殖场收集发病后存活的个体，同时用病原菌感染收集来的鱼苗，根据对病原菌感染的抵抗能力大小获得抗病群体和不抗病群体两个基础群体；3)、牙鲆抗病相关MHC基因标记的筛选对42个抗病个体和42个感病个体的411个MHCIIB克隆进行了测序，发现了13种不同的核苷酸序列，分别编码13种不同的氨基酸序列，命名为13种不同的基因型(Paol-allele*a Paol-allele*m)；411个阳性克隆质粒中的280/268bp的外源序列，去除中间的内含子序列，共编码61个氨基酸，通过与人类MHCIIB的氨基酸序列比对，确定本研究所得的MHCIIB基因的氨基酸区段对应位点为22～82，其中抗原结合位点分别为第35、37、39、56、58、60、65、66和第75位；在总的编码区内，多态性位点13个，其中多肽结合位点为6个，占多态位点的46.15％；在13种不同的氨基酸序列(Paol-allele*a-Paol-allele*m)中，Paol-allele*a-Paol-allele*f和Paol-allele*j，Paol-allele*k，Paol-allele*i，Paol-allele*m是抗病群体和感病群体所共有的；即基因型a，b，c，d，e，f，i，j，k和m同时出现于抗病群体和不抗病群体，基因型g和h只出现在抗病群体中，而基因型l只出现在感病群体中；不同等位基因在抗病群体和感病群体中的分布。因此，基因型g和h被认为是抗病相关的MHC基因标记，而基因型l则被认为可能是疾病敏感相关的MHC基因标记。
2.根据权利要求1所述的牙鲆抗病相关MHC基因标记，其特征在于所述的MHCIIB 13种不同的基因型，其氨基酸序列为182838485868Paol-allele*aSLFFITVCTADGFRYYMVADCEFNSSKLNDIEFTLSFYYNKLEFIRFSSSVGKYVGYTEFGPaol-allele*b..............H...T.............Y.Q.Y......Y.................Paol-allele*c..............H...T.................Y......Y.........F.......Paol-allele*d..............H.T.T.............Y.E.Y.....KIV........F.......Paol-allele*e .............LH.V.T.............Y.E.Y......I.........F.......Paol-allele*f ..............H.V.NN............Y...Y......I.........F.......Paol-allele*g .............LH.T.NS..............Q.Y......IV................Paol-allele*h ..............H.T.GS............Y.E.Y.....KIV........F.......Paol-allele*i .............LH.V.DS............YIY.H......Y.........F.......Paol-allele*j ..............F.V.T.............YIY.H......Y.................Paol-allele*k ..............H.T.DS............YIY.H......YV................Paol-allele*l .............LH.A.NS............Y.Q.Y......IV................PBR * * ** * ****Polymorphic pp p ppppp p pppp。
3.一种MHC基因标记辅助育种方法，其特征在于它的方法是将只在抗病群体中出现的MHCIIB基因型作为抗病相关MHC基因标记，将携带这些抗病基因标记的鱼进行繁殖，培育后代，分离后代中的MHCIIB基因，研究MHCIIB基因的多态性，同时进行病原微生物感染实验，研究抗病MHCIIB基因标记的遗传规律及其与鱼体抗病力的关系，从中筛选出既含有抗病MHCIIB基因标记，抗病力又提高的鱼苗，进行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品种。
全文摘要
一种牙鲆抗病相关MHC基因标记及其辅助育种方法，它的方法是MHCIIB基因的克隆，抗病和感病群体的制备，抗病相关MHCIIB基因标记的筛选，基因标记辅助育种技术的建立。本发明克隆了牙鲆MHCIIB全基因，并从牙鲆抗病和感病群体中鉴定出13种不同的MHCIIB基因型，其中10个基因型(a，b，c，d，e，f，i，j，k，m)在抗病和感病群体中都存在，2个基因型(g和h)只在抗病群体中存在；另有1个基因型(1)只在感病群体中存在。将基因型g和h作为抗病相关MHC基因标记，建立了抗病相关基因标记辅助育种方法。本发明首次克隆了牙鲆MHCIIB全基因并筛选到抗病相关的MHC基因标记，建立了抗病基因标记辅助育种方法。本发明方法具有针对性强、选育效率高的特点，适用于各种鱼类抗病相关标记的筛选和抗病品种选育。
文档编号C12N15/65GK1810972SQ20051004555
公开日2006年8月2日 申请日期2005年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者陈松林, 张玉喜, 刘云国, 沙珍霞, 田永胜, 邓寒 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所