专利名称：一种利用原子变构衍生dna序列多样性的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用原子变构衍生DNA序列多样性的方法，属于基因诱变研究领域。
背景技术：
为什么“种瓜得瓜、种豆得豆”？上个世纪的科学发现已做出较圆满的回答——生物的性状是由基因控制的；一个基因是一段特定序列的DNA；这种DNA是由四种核苷酸(即A、T、G、C)按一定顺序排列组成的；只要改变DNA中A、T、G、C的顺序，就能改变基因，使种出的瓜不再是原来的瓜，种出的豆也不再是原来的豆。
近十年来，基因已成为一种极富商业竞争力的资源。上个世纪90年代，孟山都公司的棉花种子进人中国市场，凭借的就是从苏云金芽孢杆菌中分离出的一段特异DNA序列。这段DNA序列转录出的mRNA能翻译出一种对鳞翅目害虫有特异毒杀效果的蛋白，将其转人棉花的基因组后就能使其成为“抗虫棉”。
目前人类之所以十分关心生物的多样性，更多的是关心其中的基因的多样性，实质上是希望更多地保护“老天”给我们创造的DNA序列的多样性。多一份独特的控制生物性状的DNA序列，就等于多一份让人类赖以生存发展的机遇，而对企业家来说就等于多一份发财的机会。
从生物中分离基因，不仅需花费很长的时间和很大的人力物力，而且还常受自然界是否具有含自己所要基因的生物类型限制。于是，人们把努力的方向瞄向了通过诱变创造生物和基因的多样性。自然条件下，各种生物虽然也在不断地产生着各种变异(称自然突变)，但发生变异的频率很低。以植物为对象进行估计，突变植株的出现率介于10-3～10-4。若以单个基因为对象来估测，基因的突变率介于10-5～10-6。采用人工诱变的方法，则可以使生物的突变率和基因的突变率提高上千倍。目前人工诱变的方法按对象分可分为两大类一、针对生物体、器官、组织的诱变(主要有两类)1、物理诱变利用特殊的射线(如γ射线、X射线、中子、β射线、离子束、激光、紫外线等)或环境条件(如太空、高压等)对种子、器官、组织等进行诱变。利用射线诱变的优点是变异率高、变异幅度较大，缺点是致死率高、有益变异率较低。利用太空、高压等进行诱变虽可不致死，有益变异率也较高，但难以作为平常方法利用。
2、化学诱变利用特殊的化学诱变剂改变DNA化学结构(如用亚硝酸和烷化剂等)、诱导DNA复制时错配(如用碱基类似物5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤等)、诱发DNA复制时发生移码(如吖啶类化合物、抗生素等)。化学诱变的优点是有一定的定向性倾向、变异率也比较高，缺点是化学诱变剂大都有致癌作用且较稳定，污染环境。
二、针对特定基因的诱变(也主要有两类)1、体外定位突变利用DNA聚合酶法(Kunkel法)和PCR法等，将突变位点设计在DNA的复制的引物中，进而获得预定位置上的预期变化。此法的优点是定位性强，缺点是仅适用于基因序列已清楚的基因，所造变异的类型受人设计能力的局限。
2、体外随机突变利用化学诱变剂、致突变菌株、易错PCR导致基因突变，或利用基因重组等产生新基因。利用化学诱变剂、致突变菌株、易错PCR诱变的优点是变异类型多，缺点是化学诱变剂有致癌危险，利用致突变菌株、易错PCR诱发，变异程度不高。利用基因重组，受人的设计、操作能力等局限。
发明内容
本发明的目的在于避免上述方法的缺陷，而提供一种利用原子变构衍生DNA序列多样性的方法，即以DNA分子为对象，采用通过原子变构诱发DNA结构变异的机制，由一段DNA衍生出大量序列不同的DNA，创造基因的多样性。
本发明要解决的技术问题是提供一种利用原子变构将一段DNA序列衍生为多种不同序列的方法，其特征在于包括以下步骤①引物设计根据源DNA的核苷酸序列(或称“母基因”，即一段被用来衍生序列多样性的DNA)，设计一对方向相反的寡核苷酸引物；②第一轮PCR扩增(聚合酶链式反应)，即α位带32P或35S的特异dNTP的引入以步骤①中源DNA为模板，在反应底物中有目的地掺入α位带32P或35S的特异dNTP，α位特异dNTP∶正常dNTP＝1∶30～1∶3，通过PCR反应将α位特异dNTP引入源DNA序列中，作为衍生DNA序列多样性的原始模板，也称为“第一轮PCR扩增产物”；③放射性衰变将步骤②中的PCR扩增产物，作为衍生DNA序列多样性的原始模板，置于低于4℃的低温条件下进行放射性衰变，时间≥1个半衰期；④第二轮PCR扩增以步骤③中衰变后的PCR产物为模板，以全部正常的dNTP为反应底物，进行第二轮PCR扩增，得到“多样性DNA序列混合物”；⑤DNA克隆将步骤④第二轮PCR扩增产物，即多样性DNA序列混合物，进行单DNA序列克隆，以获得序列发生变化的不同的“单一DNA”；⑥测序并分析对步骤⑤中的不同的“单一DNA”进行测序分析；根据测序结果，借助分子生物学软件分析DNA变异情况，预测基因变异后的功能。
所述一种利用原子变构衍生DNA序列多样性的方法，其特征在于步骤⑤DNA克隆操作时，最好是先用PCR产物纯化试剂盒或通过电泳对第二轮PCR产物进行纯化，然后再克隆于DNA载体上。
本发明的有益效果是1、高效，诱发变异的类型多、变异的频率高；2、定位的倾向性高，通过调整掺入反应底物中的α位特异dNTP的种类，可以有意识地提高或降低DNA中碱基GC的含量，这对调节基因的功能和表达非常重要。3、生物安全性高，因使用的核素少，不仅放射性弱，而且易在较短的时间内彻底衰变成非放射性物质，故不会像碱基类似物形成长期隐患。本发明适用于对任何基因进行诱变。
图1所示磷酸二酯键在DNA结构中占有的地位图2所示α-32P-dNTP(三磷酸脱氧核苷酸)图3所示S取代双共价氧的dNTP图4所示S取代羟基氧的dNTP本发明的技术原理是DNA中的磷酸二酯键在DNA结构中占有非常重要的地位，该位置发生的任何变化会对DNA构型产生重要影响如图1所示。
32P衰变后不再是P，而是变成硫(S)。用某种α-32P-dNTP如图2所示做DNA复制的底物，通过PCR将其引入某一DNA链中，待P衰变成S后再以全都正常的dNTP为底物复制(扩增)该DNA片段，就会在变成S的位置产生错配。我们的实验表明，若引入α-32P-dATP，会有碱基转换发生，即A→G、T→C；若引入α-32P-dCTP，会导致C→T、G→A。
35S衰变后不再是S，而是变成氯(Cl)。S可替换三磷酸脱氧核苷酸α位上的双共价氧和羟基氧如图3、4所示，引入α-35S-三磷酸脱氧核苷酸，在35S衰变之前就会因S与O的原子半径不同而导致配对的不准，进而产生序列变异；而当35S衰变成Cl后，就会导致更大的DNA结构变异，进而诱发序列的变异。我们的实验也表明，引入α-35S-三磷酸脱氧核苷酸，也可出现预期位置上的碱基转换结果。
32P的半衰期约为14天、35S的半衰期约为87天，既能为喂入操作提供充裕的时间，又能较快地获得衰变后的变构体。因喂入的原料是α位上带32P或35S的特异dNTP，在DNA复制时利用率相对较高。另外，因使用的核素少，不仅放射性弱，而且易在较短的时间内彻底衰变成非放射性物质，故不会形成长期隐患。
具体实施例方式
实施例1以洋葱Ace-AMP1基因(357bp)为模板，引入α-32P-dATP①引物设计将洋葱Ace-AMP1基因克隆在pUC19质粒载体上，根据其序列设计出PCR引物——上游引物为5’-TAA GGT ACC ATG GTTCGC GTT GTA TC-3’(含限制性酶切位点NcoI)、下游引物为5’-TCC TGCCGC ATTGAA TTCTTG G-3’(含限制性酶切位点EcoRI)，理论扩增DNA片段长度为357bp；②α-32P-dATP的引入(即第一轮PCR)以步骤①中源DNA为模板，在反应底物dNTP中掺入α-32P-dATP，使α-32P-dATP∶正常dATP＝1∶15，按94℃1min、55℃0.5min、72℃1min进行35个循环，完成第一轮PCR反应；③放射性衰变将步骤②中的PCR扩增产物置于-20℃衰变7个半衰期；④第二轮PCR以步骤③中衰变后的PCR产物为模板，以正常dNTP为反应底物进行第二轮PCR扩增；
⑤DNA克隆将步骤④第二轮PCR产物经乙醇沉淀进行纯化，然后经酶切产生有关连接接头，通过电泳分离收获所需DNA片段，克隆于质粒载体；⑥测序并分析随机选取步骤⑤中的21个单克隆送交赛百盛公司测序分析。DNA序列分析结果表明21个克隆中有20个发生了碱基变异，其中，有1个克隆发生了8个位置的变异，2个发生了7个位置的变异，3个发生了6个位置的变异，2个发生了5个位置的变异，3个发生了4个位置的变异，2个克隆发生了3个位置的变异，5个克隆发生了2个位置的变异，1个克隆发生了2个位置的变异和1个碱基缺失，1个克隆发生1个位置的变异。没有引入同位素的PCR克隆的碱基错配率为0。变构衍生DNA序列变异主要发生在碱基A或T位置上，并以A→G、T→C碱基转换为主(见序列表1)。
实施例2以小麦特定DNA序列(301bp)为模板，引入α-32P-dATP①引物设计将一段来自小麦的特定DNA序列克隆在pGEM-T质粒载体上，根据其序列设计出PCR引物——正向引物E-AG为5’-CCCGGG CAG GTA ATT CAG-3’、互补链引物M-CG为5’-TCG CGG CCG AGG TTAACA-3’，理论扩增DNA片段长度为301bp；②α-32P-dATP的引入(即第一轮PCR)以步骤①中源DNA为模板，在反应底物dNTP中掺入α-32P-dATP，使α-32P-dATP∶正常dATP＝1∶15，按94℃1min、62℃1min、72℃1min进行35个循环，完成第一轮PCR反应；
③放射性衰变将将步骤②中的PCR扩增产物置于-20℃衰变7个半衰期；④第二轮PCR以步骤③中衰变后的PCR产物为模板，以正常dNTP为反应底物进行第二轮PCR扩增；⑤DNA克隆将步骤④第二轮PCR产物经纯化试剂盒进行纯化后，克隆到pGEM-T载体上；⑥测序并分析随机选取步骤⑤中的9个克隆送宝生物公司测序分析。结果表明9个克隆均发生了变异，其中1个发生了11个位置的错配，1个发生了10个位置的错配和1个位置的碱基缺失，2个发生了10个不同位置的错配，1个发生了8个位置的错配，1个发生了7个位置的错配；2个发生了6个不同位置的错配，1个发生5个位置的错配。对照无任何位置的错配发生。碱基错配的位置为A和T，错配规律为A错配成G、T错配成C，即发生A→G、T→C的碱基转换(见序列表2)。
实施例3以小麦特定DNA序列(301bp)为模板，引入α-32P-dCTP步骤②中在反应底物dNTP中掺入的是α-32P-dCTP，其它步骤同实施例2；步骤⑥测序并分析为随机选取步骤⑤中的10个克隆送宝生物公司测序分析。结果表明10个克隆有9个发生了预期位置的错配，其中1个发生了5个位置的错配；1个发生了4个位置的错配；2个发生了2个不同位置的错配和1个碱基的缺失；5个发生了1个不同位置的错配。对照无任何位置的错配。复制错配发生的位置为碱基C和G，错配的规律为C错配成T、G错配成A，即发生G→A、C→T的碱基转换(见序列表3)。
实施例4以小麦特定DNA序列(301bp)为模板，引入α-35S-dATP步骤②中在反应底物dNTP中掺入的是α-35S-dATP，步骤③放射性衰变为1个半衰期，其它步骤同实施例2；步骤⑥测序并分析为随机选取步骤⑤中的16个克隆送宝生物公司测序分析。结果表明16个克隆中有8个发生变化，其中1个发生了2次错配，7个只发生1次错配。
序列表1洋葱DNA引入α-32P-dATP后变异ace-ampl为原始DNA序列，hb01和hbw20为诱变DNA序列ace-amp1 ccatggttcgcgttgtatctttacttgcagcatcgaccttcatactgttgattatgataahb01 ccatggttcgcgttgtatctttacttgcagcatcgaccttcatactgttgattacggtaahbw20 ccatggttcgcgttgtatctctacttgcagcatcggccttcatactgttgattatgataa*********************************** ****************** * ***ace-amp1 tcagcagtccgtatgcaaatagtcagaacatatgcccaagggttaatcgaattgtgacachb01 tcagcagcccgtatgcaaatagtcagcacatatgcccaagggttaatcgaattgtgacachbw20 tcagcagtccgtacgcaaacagtcagaacatatgcccaagggttaatcgaattgtgacac******* ***** ***** ****** *********************************ace-amp1 cctgtgtggcctacggactcggaagggcaccaatcgccccatgctgcagagccctgaacghb01 cctgtgtggcctacggactcggaagggcaccagtcgccccatgctgcagagccctgaacghbw20 cctgtgtggcctacggactcggaagggcaccaatcgccccatgccgcagagccctgaacg******************************** *********** ***************ace-amp1 atctacggtttgtgaatactagaaacctacgacgtgctgcatgccgctgcctcgtagggghb01 atctacggtttgtgaatactagaaacctacgacgtgctgcatgccgctgcctcgtagggghbw20 atctacggtttgtgaatactaggaacctacgacgtgctgcatgccgctgcctcgtagggg********************** *************************************ace-amp1 tagtgaaccggaaccccggtctgagacgaaaccctagatttcagaacattcctcgtgatthb01 tagtgaaccggaaccccggtctgggacgaaaccctggatttcggaacattcctcgtgatthbw20 tagtgaaccggaaccccggtctgagacgaaaccctagatttcagaacattcctcgcgatt*********************** *********** ****** ************ ****ace-amp1 gtcgcaacacctttgttcgtcccttctggtggcgtccaagaattchb01 gtcgcaacacctttgttcgtcccttctggtggcgtccaagaattchbw20 gtcgcaacacctttgttcgtcccttctggtggcgtccaagaattc*********************************************
序列表2小麦DNA引入α-32P-dATP后变异hhs019为原始DNA序列，hhs107和hhs108为诱变DNA序列hhs019cccgggcaggtaattcagagaaagagcccccacagatgatagggtatgcggaggaaaacahhs107cccgggcaggtaattcagagaaagagcccccacagatgataggatatgtggaggagaacahhs108cccgggcaggtaattcagagaaagagcccccacaggtgatagggtatgcggaggaaaaca*********************************** ******* **** ****** ****hhs019atgcggtgttcttcgggacggtcgacgctgactacatggtccatcttgagtcattgcagthhs107atgcggtgttcttcgggacggtcgacgttgactacatggtccatcttgagtcattgcagthhs108atgcggtgttcttcgggacggtcgacgctgactacatggtccatcttgggtcattgcagt*************************** ******************** ***********hhs019tcaggaaacttcccaagacaaccatcggttcttactatcatccattcgaagctgtctatghhs107tcaggaaacttcccaagacaactatcggttcttactatcatccattcgaagctgtctatghhs108tcaggaaacttctcaagacaaccatcggttcttactatcatccattcgaagctgtctatg************ ********* *************************************hhs019ctccaggtactagaatgccttttacattgtggatatatataacaaaaaccgagttttttchhs107ctccaggtactagaatgccttttacattgtggatatatataacaaaaaccgagttttttchhs108ctccaggtactagaatgccttttacattgtggatatatataacaaaaaccgagttttttc************************************************************hhs019ttcttacataattggcttattatatgttgttcacattctttcgtgttaacctcggccgcghhs107ttcttacataattggcttattatatattgttcacattctttcgtgttaacctcggccgcghhs108ttcttacataattggcttattatatgttgtttacattctttcgtgttaacctcggccgcg************************* ***** ****************************
序列表3小麦DNA引入α-32P-dCTP后变异t2为原始DNA序列，hhs028和hhs025为诱变DNA序列t2(ck)cccgggcaggtaattcagagaaagagcccccacagatgatagggtatgcggaggaaaacahhs028cccgggcaggtaattcagagaaagagcccccacagatgatagggtatgcggaggaaaacahhs025cccgggcaggtaattcagaaaaagagcccccacagatgatagggtatgcggaggaaaaca******************* ****************************************t2(ck)atgcggtgttcttcgggacggtcgacgctgactacatggtccatcttgagtcattgcagthhs028atgcggtgctcttcgggacggtcgacgctgactacatggtccatcttgagtcattgcagthhs025atgcggtattcttagggacggtcgacgctgactacatggtccatcttgggtcattgcagt*********** ********************************** ***********t2(ck)tcaggaaacttcccaagacaaccatcggttcttactatcatccattcgaagctgtctatghhs028ttaggaaacttcccaagacaaccatcggttcttactatcatccattcgaagctgtctatghhs025tcaggaaacttcccaagacaaccatcggttcttactatcatccattcgaagctgtctatg* **********************************************************t2(ck)ctccaggtactagaatgccttttacattgtggatatatataacaaaaaccgagttttttchhs028ctccaggtactagaatgccttttacattgtggatatatataacgaaaaccgagttttttchhs025ctccaggtactagaatgtcttttacattgtggatatatataacaaaaaccgagttttttc***************** ************************* ****************t2(ck)ttcttacataattggcttattatatgttgttcacattctttcgtgttaacctcggccgcghhs028ttcttacataattggcttattatatgttgttctcattctttcgtgttaacctcggccgcghhs025ttcttacataattggcttattatatgttgttcacattctttcgtgttaacctcggccgcg******************************** ***************************
权利要求
1.一种利用原子变构衍生DNA序列多样性的方法，其特征在于包括以下步骤①引物设计根据源DNA的核苷酸序列设计一对方向相反的寡核苷酸引物；②第一轮PCR扩增(聚合酶链式反应)，即α位带32P或35S的特异三磷酸脱氧核苷酸的引入以步骤①中源DNA为模板，在反应底物中有目的地掺入α位带32P或35S的特异三磷酸脱氧核苷酸，α位特异三磷酸脱氧核苷酸∶正常三磷酸脱氧核苷酸＝1∶30～1∶3，通过PCR反应将α位特异三磷酸脱氧核苷酸引入源DNA序列中，作为衍生DNA序列多样性的原始模板；③放射性衰变将步骤②中的PCR扩增产物，作为衍生DNA序列多样性的原始模板，置于低于4℃的低温条件下进行放射性衰变，时间≥1个半衰期；④第二轮PCR扩增以步骤③中衰变后的PCR产物为模板，以全部正常的三磷酸脱氧核苷酸为反应底物，进行第二轮PCR，得到“多样性DNA序列混合物”；⑤DNA克隆将步骤④第二轮PCR扩增产物，进行单DNA序列克隆，以获得序列发生变化的不同的“单一DNA”；⑥测序并分析对步骤⑤中的不同的“单一DNA”进行测序分析；根据测序结果，借助分子生物学软件分析DNA变异情况，预测基因变异后的功能。
2.根据权利要求1中所述一种利用原子变构衍生DNA序列多样性的方法，其特征在于步骤⑤DNA克隆操作时，先用PCR产物纯化试剂盒或通过电泳对第二轮PCR产物进行纯化，然后再克隆于DNA载体上。
全文摘要
本发明涉及一种利用原子变构衍生DNA序列多样性的方法。其特征在于包括以下步骤引物设计、α位带
文档编号C12N15/11GK1916180SQ200510048240
公开日2007年2月21日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年12月28日
发明者王海波, 赵和, 吕孟雨, 柴建芳, 吴志明, 马民强, 张春义 申请人:河北省农林科学院遗传生理研究所