专利名称：一种高效壳聚糖降解菌芽孢杆菌及其产生的壳聚糖酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选得到的一株高效壳聚糖降解菌——芽孢杆菌，该菌分泌一种壳聚糖酶，降解壳聚糖得到壳聚二糖和壳聚三糖。
背景技术：
壳聚糖为葡萄糖胺以β-1，4糖苷键连接而成的直链聚合物。它可以看作是几丁质脱乙酰的衍生物。广泛存在于接合菌和植物病原菌的细胞壁中，在绿藻和真菌以及一些人体病原菌的细胞壁中也有少量存在。壳聚糖酶(EC3.2.1.99)能够降解壳聚糖的β-1，4糖苷键，可分为内切酶和外切酶。壳聚糖内切酶能够随机切割多糖链(n≥4)得到分子量不同的壳聚寡糖。许多微生物能够分泌壳聚糖酶，降解壳聚糖为生长提供所需的碳源和氮源。
壳聚糖主要是指脱乙酰度大于80％的几丁质衍生物或即乙酰化低于20％的多糖胺链。研究发现低聚壳聚多糖具有增强植物病原抵抗力和诱导上皮细胞生成等多种功效；而最近的研究表明壳聚六糖具有很强的抗肿瘤作用。目前，低聚糖的生产主要采用水力切割和酸水解等物理化学方法。这些方法具有生产力低下，产物为多种混合物等不易克服的缺点。
发明内容
本发明的目的在于筛选得到一株高效壳聚糖降解菌——芽孢杆菌，该菌株所分泌的壳聚糖酶能够降解壳聚糖得到壳聚二糖和壳聚三糖。
我们从东太平洋深海沉积物中，分离得到一株具有较高的壳聚糖酶活性的芽孢杆菌。经鉴定该菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。经研究，该菌株的盐度适应范围为0-8％，最适培养基为没有添加NaCl的2216E培养基，其最适的生长温度为30℃。该菌株已提供给中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC NOM205103。
该菌株具有非诱导产酶的特点，低浓度(0.005％)的壳聚糖并不影响其产酶效率，但当培养基中的壳聚糖浓度增加到0.1％时，能够使得该菌株的产酶时间延迟，以及其产酶量具有较为明显的下降。
图1TLC分析。M为Marker。不同反应时间在图的上方标识图2MS图a，5分钟；b，60分钟；c，2天
具体实施例方式实施例1细菌的筛选壳聚糖酶平板的制备通过含有0.1％壳聚糖的基本培养基的平板上不同菌落周围的出圈情况筛选所需的菌株。并通过16S rDNA进行初步的鉴定。
细菌产酶情况的研究将所筛得的细菌接入到含0.1％壳聚糖的基本培养液中，30℃摇培过夜。浓缩上清以及破碎细胞，并将浓缩后的上清液和细胞破碎液加入含0.01％壳聚糖的McIlvaine缓冲液中，37℃反应2小时并用DNS的方法测定反应体系中还原糖的含量。
实施例2产酶性质的研究通过在添加有壳聚糖和不加壳聚糖的基本培养液两种不同条件下菌株的生长情况，以及将发酵上清浓缩后作为粗酶进行酶活性验证，其结果显示该菌株为非诱导产酶。
实施例3酶活力测定将发酵上清浓缩后作为粗酶，通过不同的PH梯度酶解产物即还原糖产生量的测定得出该酶的最适反应PH为PH6.5；再通过不同的温度梯度还原糖的产生效率得出该酶最适合的反应温度为60℃。
实施例4酶解产物的分析通过TLC纸层析的方法，对不同时间段酶解产物进行展层分析。结果显示反应时间为5分钟时，反应体系中以多糖为主，随着反应的进行，多糖的含量逐渐减少，直至反应时间为60分钟后，反应体系中只有二糖、三糖和四糖；在酶反应持续两天后，体系中只剩下二糖和三糖，并且随着酶反应时间的增加，反应产物并不发生改变。
另一方面，通过不同酶反应时间产物的质谱分析显示的结果与TLC的结果一致。因此，可以得出该酶最终的反应产物为壳聚二糖和壳聚三糖，最小的识别底物为壳聚四糖，但降解的效率较低。
权利要求
1.一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)，保藏号为CCTCC NOM205103.
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其特征在于能够分泌胞外壳聚糖酶，降解壳聚糖得到二糖和三糖。
3.如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其特征在于能够非诱导性分泌胞外壳聚糖酶。
4.如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其特征在于该酶的反应温度和PH分别为65℃和PH6.0。
5.一种降解壳聚糖生产二糖和三糖的方法，其特征在于利用生物壳聚糖酶降解壳聚糖。
6.一种以内切的方式降解壳聚糖最终产生壳聚二糖和壳聚三糖。
7.一种对大分子底物的降解效率高于低分子底物降解效率的壳聚糖酶。
8.一种最小的酶解底物为壳聚四糖的内切式壳聚糖酶。
全文摘要
本发明公开得到了－株壳聚糖降解菌—芽孢杆菌(Bacillus sp.)，该菌株能够非诱导性分泌一种胞外壳聚糖酶。经过对该菌株的发酵上清进行酶活性测定，该酶的最适反应温度为65℃，最适pH为6.0，纸层析和质谱分析结果显示该酶的最终酶解产物为壳聚二糖和壳聚三糖。
文档编号C12P19/12GK1995325SQ20051004837
公开日2007年7月11日 申请日期2005年12月31日 优先权日2005年12月31日
发明者肖湘, 王凤平, 汤熙翔, 游志勇 申请人:国家海洋局第三海洋研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会