专利名称：一种人体未成熟卵体外成熟培养方法
技术领域：
本发明涉及人辅助生殖技术领域，特别是有关卵丘冠颗粒细胞剥除的人体未成熟卵体外成熟培养方法。
背景技术：
在日常的体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)临床工作中，常规卵巢刺激周期获取的卵子有15％左右是未成熟卵(immature oocytes，IMOs)[见参考1]，这些IMOs不能直接用于常规的单精子卵浆内穿刺(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)辅助生殖治疗，多被旷置，任其自然退化[见参考1-3]。开发和利用这些在常规IVF/ICSI治疗工作中多被丢弃的IMOs，即卵丘冠颗粒细胞(corona-cumulus，CCs)剥除的IMOs(corona-cumulus-denuded IMOs，ccdIMOs)，不管在辅助生殖临床工作，抑或基础科学研究，皆有许多实在的意义和应用价值。例如卵巢刺激低反应(获卵数较少)的不孕患者，可考虑利用这些ccdIMOs，增加受孕机会。对捐赠的ccdIMOs，可用于卵子发育、成熟及以卵子为基础的科学研究，如胚胎干细胞的研究等。
未成熟卵的成熟过程涉及卵核成熟和卵浆成熟二部分[见参考1]。其中卵核成熟的形态学改变/标志明显，即停滞于第一次减数分裂前期的生发泡期(germinal vesicle stage，GV期)卵(以卵细胞内出现明晰的GV期核为特征)恢复第一次减数分裂，历经第一次减数分裂中期(metaphase of meiosis 1，M-I期卵，以卵细胞内GV期核消失、没有极体为特征)，直至第二次减数分裂中期(metaphase of meiosis 2，成熟卵，以卵周隙内出现第一极体为特征)，详见图1。图1是人类卵核成熟的不同阶段的特征图。由图1可见，GV期卵内有明晰的GV期核；M-I期卵内GV期核消失，没有极体；而成熟卵的卵周隙内出现第一极体。
体外成熟培养(in vitro maturation，IVM)技术可使IMOs体外成熟，随后经IVF/ICSI-ET处理可获得25％～35％左右的临床妊娠率，此治疗方案在IVF-ET临床已推广应用于卵巢过渡刺激综合症高危病例和具有IVF/ICSI-ET处理指征的月经周期正常的不孕病例[见参考1，4，5]。但是人ccdIMOs的IVM成功(成熟)率、相应成熟卵其后的发育能力皆明显低于卵丘冠颗粒细胞未剥除的IMOs[即以卵丘复合体(cumulus-oocyte-complex，COC)形式存在的未成熟卵(cocIMOs)]的相应指标[见参考6，7]。有研究报告人ccdIMOs与猴单层Vero细胞(猴肾细胞)共培养(coculture of IVM，coIVM)可明显改善人ccdIMOs相应的体外成熟率[见参考8]。另有研究报告一定比例的非自体人成熟卵泡液(mature follicle fluid，MFF)参与人cocIMOs的IVM体系，可明显改善IVM效果和相应成熟卵的受精率[见参考9，10]。但是非自体人MFF和异种动物饲养层细胞coIVM培养可能导致同种异体或异种间的疾病传播和/或交叉感染[见参考1]，因此影响其在辅助生殖临床的广泛应用和推广。
在整个卵子发育和成熟过程中，卵泡细胞的支持，包括卵巢壁层颗粒细胞(卵泡周边的卵巢颗粒细胞)和卵丘冠颗粒细胞(最贴近卵子的卵巢颗粒细胞)的支持，是必需的[见参考11-15]。另一方面，越来越多的证据表明人MFF含有多量的营养成分、促性腺激素、生长因子以及其它到目前为止尚未确认的有益于卵子成熟和胚胎发育的组分[见参考15-18]。人MFF可望成为IVM培养系统的合适培养基或有益的添加成分[见参考9，10，19]。
自体来源的MFF和卵丘颗粒细胞可在辅助生殖处理过程中(取卵和剥卵时)一并获取，用于自体ccdIMOs的coIVM没有上述同种异体或异种间疾病传播和/或交叉感染的风险，是理想的coIVM“佐剂”。
迄今为止使用自体卵巢颗粒细胞辅助ccdIMOs CoIVM专项研究报告只有两篇，在IVM促进方面皆未显示优势[见参考2，20]。没有自体MFF(autologousMFF，autoMFF)参与ccdIMOs IVM专项研究报告。更没有人自体卵丘颗粒细胞(autologous CCs，autoCCs)和autoMFF协同用于ccdIMOs共IVM培养的研究报告。
目前现有的ccdIMOs IVM存在的主要问题和缺陷是1)、单纯的IVM培养成功(成熟)率及相应成熟卵其后的发育能力不及cocIMOs的相应指标[见参考6，7]。
2)、用于coIVM的MFF和饲养层细胞多为同种异体或异种来源，有相应同种异体或异种间疾病传播和/或交叉感染的风险[见参考1]。
3)、仅有的两篇自体卵巢颗粒细胞辅助人ccdIMOs CoIVM专项研究报告，在IVM促进方面皆未显示优势[见参考2，20]。我们分析相关原因主要是自体卵巢颗粒细胞未能及时(充分)发挥其作为饲养层细胞的饲养作用；或表述为与ccdIMOs同步培养的autoCCs，其饲养作用相对滞后，尤其在IVM培养初期是如此。
4)、没有人autoMFF参与ccdIMOs IVM专项技术或研究报告。
5)、更没有人autoCCs和autoMFF协同用于ccdIMOs coIVM的专项技术或研究报告。
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发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能提高卵巢刺激周期卵丘冠颗粒细胞剥除的未成熟卵体外培养成熟率、且能提高成熟卵其后发育能力的人体未成熟卵体外培养成熟方法。
本发明的人体未成熟卵体外成熟培养方法，此未成熟卵是指卵巢刺激周期卵丘冠颗粒细胞剥除的未成熟卵。该方法包括配置和预温标准的人类体外成熟培养液(即IVM培养液)，将第一次减数分裂前期(GV期)、第一次减数分裂中期(M-I期)的未成熟卵均置于上述人类体外成熟培养液的微滴中进行培养；其特征是在所述人类体外成熟培养液中按照9∶1的体积比加入自体成熟卵泡液(AutoMFF)制成培养液A(M-I期未成熟卵专用培养液)，将M-I期未成熟卵置于所述培养液A的微滴中进行培养；在所述培养液A中加入分离、纯化的自体卵丘冠颗粒细胞(AutoCCs)沉淀，悬浮成AutoCCs密度在1～5×105/ml的培养液B(GV期未成熟卵专用培养液)，将GV期未成熟卵置于所述培养液B的微滴中进行培养。
作为本发明的人体未成熟卵体外成熟培养方法的一种改进该人类体外成熟培养液由基础培养液、体积浓度为10％人血清替代品、0.075IU/ml人促卵泡刺激素(FSH)和0.1IU/mL人绒毛膜促性腺激素(HCG)组成；然后在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内预温平衡至少4小时。
作为本发明的人体未成熟卵体外成熟培养方法的进一步改进将培养液A制成相应培养微滴后，覆盖矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内孵育至少0.5小时；再将M-I期未成熟卵置于上述孵育后的培养液A微滴中进行培养。
作为本发明的人体未成熟卵体外成熟培养方法的进一步改进将培养液B制成相应培养微滴后，覆盖矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内孵育至少0.5小时；再将GV期未成熟卵置于上述孵育后的培养液B微滴中进行培养。
作为本发明的人体未成熟卵体外成熟培养方法的进一步改进所述培养均是指在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内进行培养，以第一极体(PB1)排出为卵细胞体外培养成熟的标志。
本发明的人体未成熟卵体外成熟培养方法，解决了如下几个技术问题1)、人ccdIMOs IVM较差的成熟率。2)、人非自体MFF和饲养层细胞在IVM方面使用可能发生的同种异体或异种间疾病传播和/或交叉感染的风险。3)、AutoCCs作为饲养层细胞，其饲养作用在ccdIMOs IVM方面发挥不及时(不充分)或相对滞后问题。4)、AutoMFF在ccdIMOs IVM方面，其有益作用未很好利用问题。5)、人autoCCs和autoMFF在ccdIMOs IVM方面，其整体、协同的有益作用未很好利用问题。
图2显示在自体卵丘冠颗粒细胞(autoCCs)辅助的体外成熟培养(IVM)系统中追加(下面三幅图)或不追加(上面三幅图)自体成熟卵泡液(autoMFF)相应autoCCs在不同的培养时段(由左至右分别是20小时，44小时和72小时)的生长和增殖情况。由图2可见，追加AutoMFF可刺激AutoCCs生长。与同一来源、同期培养、没有追加AutoMFF的AutoCCs比较，追加AutoMFF的AutoCCs在显微镜下表现为可轻易辨别的明显增大的细胞体积、明显增多的细胞足突外延生长和明显增加的细胞汇合和培养液滴面积的被覆。其中左面4幅图的放大倍数是200，最右面2幅图的放大倍数是100。
由此，不难理解，在既往autoCCs辅助的coIVM系统内同时追加autoMFF，既可及时发挥autoMFF对ccdIMOs IVM的直接有益作用，弥补autoCCs在coIVM初期(24小时内)--饲养层形成阶段相对有限的饲养作用，又可通过刺激autoCCs生长(具体见图2)，间接发挥其对ccdIMOs IVM的有益作用。
我们的研究发现AutoMFF和AutoCCs参与的coIVM液滴培养多能在确认需要时2小时内(相当于取卵后6～8小时内)建立。AutoCCs的生长多能在培养20小时内(相当于取卵后24～28小时内)达到滋养层的程度，即贴壁生长、相互汇合(confluence)被覆60～70％的液滴底表面积。培养液不置换的AutoCCs生长多在培养36～60小时达到鼎盛时期，其后AutoCCs生长趋缓，出现萎陷、退化征象。追加AutoMFF可促进AutoCCs液滴培养和生长。与同一来源、同期培养、没有追加AutoMFF的AutoCCs比较，追加AutoMFF的AutoCCs在显微镜下表现为可轻易辨别的明显增大的细胞体积、明显增多的细胞足突外延生长和明显增加的细胞汇合和培养液滴面积的被覆。(具体见图2)受到AutoMFF刺激的AutoCCs，作为ccdIMOs coIVM系统的饲养层细胞，可在coIVM24小时内达到滋养层的程度，与GV期卵的ccdIMOs IVM需求基本同步，及时并充分地发挥其相应的饲养作用。
上述人autoCCs和autoMFF在ccdIMOs coIVM系统的组合和协同作用，较充分地展示(利用)了两者在ccdIMOs IVM方面整体、协同的有益作用。
图3显示本发明的两种卵丘冠颗粒细胞剥除的未成熟卵(ccdIMOs)体外培养成熟技术(IVM)。由图3可见，单纯自体成熟卵泡液(autoMFF)辅助的IVM(AutoMFF-coIVM)，没有自体卵丘冠颗粒细胞(autoCC)的参与，适合时程较短的M-I期ccdIMOs的IVM。而autoMFF和autoCCs共同辅助的coIVM培养系统(AutoMFF&CCs-coIVM)，有autoCCs的参与，用于GV期ccdIMOs的IVM。
由于M-I期ccdIMOs的IVM时程较短，我们的研究观察显示68.8％M-I期ccdIMOs可在IVM 12小时内成熟，所以对时程较短的M-I期ccdIMOs的IVM，我们在标准的IVM培养系统内仅追加10.0(v/v)％autoMFF，构建所谓的autoMFF辅助的coIVM培养系统(AutoMFF-coIVM)，用于M-I期ccdIMOs的IVM。(具体见图3。)由于GV期ccdIMOs的IVM时程相对较长，我们的研究观察显示只有25.5％GV期ccdIMOs在IVM 24小时内成熟，多数需36-48小时的IVM方能成熟。所以对时程较长的GV期ccdIMOs的IVM，我们在标准的IVM培养系统内不仅追加10.0(v/v)％autoMFF，而且追加1～5×105/ml autoCCs，构建所谓的autoMFF和autoCC共同辅助的coIVM培养系统(AutoMFF&CCs-coIVM)，用于GV期ccdIMOs的IVM。(具体见图3。)GV期ccdIMOs的常规IVM培养系统追加autoCCs共培养有其实际的需求和autoCCs发挥饲养作用的时限跨度。如前所述的AutoMFF的直接参与以及对autoCCs生长的刺激，使该GV期ccdIMOs的coIVM培养系统趋于完善，相应IVM效果更为保证。
本发明的人体未成熟卵体外成熟培养方法，具有如下优点1)、较好的利用了autoCCs和autoMFF在ccdIMOs IVM方面整体、协同的有益作用，又没有同种异体或异种间疾病传播和/或交叉感染的忧虑或风险，体现发明方法明显的处理个体化、扬长避短、医疗安全更有保障的特点。
2)、autoCCs和autoMFF取材在取卵和剥卵时一并进行，对病者没有额外的身心负荷。因此本发明方法技术简便、快捷，没有额外的设备要求，没有明显的物品损耗或费用增加，体现本发明方法明显的可行性、可接受性和实用性特点。
3)、AutoMFF&CCs-coIVM培养系统内追加autoMFF可促进autoCCs体外培养和生长，相应培养系统的autoCCs体外培养和生长可在24小时内达到饲养层的程度(参见图2)，解决了既往autoCCs辅助IVM或饲养作用相对滞后、与相应IVM的实际需求不同步、相应IVM辅助效用不显著的问题。体现本发明方法相应同步需求明显改善、IVM辅助效用显著的特点。
4)、AutoMFF-coIVM培养系统和AutoMFF&CCs-coIVM培养系统分别用于M-I期和GV期ccdIMOs的IVM，可以明显促进和改善相应期别未成熟卵的IVM，提高单位时程的成熟(成功)率，加速未成熟卵的IVM进程。(参见表1、图4和图5。)-AutoMFF-coIVM培养系统适合时程较短的M-I期ccdIMOs的IVM；-AutoMFF&CCs-coIVM适合时程较长的GV期ccdIMOs的IVM。
表1不同IVM方案不同时段GV期和M-I期ccdIMOs成熟率及比较
a与GV期ccdIMOs相应IVM时段比较，x2检验，x2＞6.635，P＜0.01b与同类别ccdIMOs使用IVM标准方案比较，x2检验，x2＞3.381，P＜0.05IVMin vitro maturation(体外成熟培养)M1-stagemetaphase of meiosis 1(第一次减数分裂中期)GV-stagegerminal vesicle stage of meiosis(第一次减数分裂前期/生发泡期)ccdIMOscorona-cumuIus denuded immature oocytes(卵丘冠颗粒细胞剥除的未成孰卵)
AutoMFF IVMautologous matured follicular fluid-assisted IVM protocol(自体成熟卵泡液辅助的体外成熟培养)AutoMFF&CCs colVMautologous matured follicular fluid and autologous corona-cumulus-assisted IVMcoculture protocol(自体成熟卵泡液和自体卵丘冠颗粒细胞共同辅助的体外成熟培养)图4显示卵丘冠颗粒细胞剥除的M-I期未成熟卵(M1期ccdIMOs)不同IVM方案不同时段相应IVM效果及比较。由图4可见，M-I期ccdIMOs使用本发明的自体成熟卵泡液辅助的IVM方案(AutoMFF-coIVM)，其各个IVM时段的成熟率皆高于IVM标准方案相应时段的成熟率，在IVM 24小时和IVM36小时的相应成熟率差异具有统计学上的显著意义(P＜0.05)。
图5显示卵丘冠颗粒细胞剥除的GV期未成熟卵(GV期ccdIMOs)不同IVM方案不同时段相应IVM效果及比较。由图5可见，GV期ccdIMOs诸IVM方案的相应IVM成熟率差异在IVM 36小时时开始显现。本发明的自体成熟卵泡液和自体卵丘冠颗粒细胞共同辅助的IVM方案(AutoMFF&CCs-coIVM)，相应IVM成熟率明显高于IVM标准方案，coIVM48小时的成熟率达到85.7％，差异具有统计学上的显著意义(P＜0.05)。
综上所述，本发明的人体未成熟卵体外成熟培养方法，即用于卵巢刺激周期卵丘冠颗粒细胞剥除的未成熟卵的IVM，是用一定比例的人自体成熟卵泡液(AutoMFF)和自体卵丘冠颗粒细胞(AutoCCs)辅助标准的IVM培养系统，建立同步和个体化的IVM共培养系统(coIVM)，提供autoMFF和autoCCs对卵巢刺激周期卵丘冠颗粒细胞剥除的未成熟卵IVM的有益支持，同时避免非自体成熟卵泡液和饲养层细胞在IVM方面的使用可能导致的同种异体或异种间疾病传播和/或交叉感染的风险。
图1是人类卵核成熟的不同阶段的特征图；图2是IVM培养基内追加(下图)或不追加(上图)自体成熟卵泡液、自体卵丘冠颗粒细胞在不同培养时段的饲养层样生长图；图3是卵丘冠颗粒细胞剥除的未成熟卵体外成熟共培养图；图4是M-I期ccdIMOs不同IVM方案在不同IVM时段的成熟率对比图；图5是GV期ccdIMOs不同IVM方案在不同IVM时段的成熟率对比图。
具体实施例方式
1、配制标准的IVM培养液标准的IVM培养液由基础培养液、10(v/v)％人血清替代品、0.075IU/ml人促卵泡刺激素(FSH)和0.1IU/mL人绒毛膜促性腺激素(HCG)组成。培养箱内(37℃，5％CO2，饱和湿度)预温平衡至少4小时待用。
基础培养液可选用MediCult IVM系统的基础培养液(Cat#82214010，MediCult公司，丹麦)或Irvine Scientific公司的HTF培养液(Cat#90125，IrvineScientific公司，美国)。
10(v/v)％人血清替代品可选用Irvine Scientific公司的Serum substitutesupplement(Cat#99113，IrvineScientific公司，美国)。
FSH可选用Serono公司的Gonal-F(Cat#S20030041/L1938801B，Serono公司，瑞士)。
HCG可选用Serono公司的Profasi(Cat#H20030198/L4778801C，Serono公司，瑞士)。
2、配制自体成熟卵泡液(autoMFF)辅助的培养液A(M-I期未成熟卵专用培养液)先行制备上述标准的IVM培养液，培养箱内预温至少4小时待用。
取卵当日取卵同时抽吸自体主导卵泡液2～10ml，经离心(1200rpm×10分钟)、吸取上清、再经0.22μm过滤器过滤获得AutoMFF。4C冷藏待用。
在上述标准的IVM培养液内追加10(v/v)％的AutoMFF(即IVM培养液与AutoMFF的体积投料比为9∶1)，制备成相应的培养液A(M-I期末成熟卵专用培养液)微滴，覆盖矿物油，培养箱内孵育(37℃，5％CO2，饱和湿度)至少0.5小时待用。
矿物油可选用Irvine Scientific公司产品(Cat#9305，IrvineScientific公司，美国)。
3、配制autoMFF和autoCCs共同辅助的培养液B(GV期未成熟卵专用培养液)先行制备上述标准的IVM培养液，培养箱内预温至少4小时待用。
再同上述实施方式第2点表述的方法配制autoMFF辅助的培养液A(即M-I期未成熟卵专用培养液)，培养箱内孵育(37℃，5％CO2，饱和湿度)至少0.5小时待用。
AutoCC取自自体卵细胞ICSI处理前透明质酸酶消化(30秒左右)、再细管机械吹打获取的游离AutoCCs。该初始的AutoCC悬液(1ml)经预温的淋巴细胞分离液(2ml)离心(2000rpm×20分钟)分离、磷酸缓冲液(PBS)(3倍容量)悬浮、再离心(1200rpm×5分钟)。如此获取的AutoCCs沉淀，先用血细胞计数板计数，再经上述事先配制/预温的autoMFF辅助的培养液A悬浮成细胞密度在1～5×105/ml的AutoMFF和AutoCCs共同辅助的培养液B(GV期未成熟卵专用培养液)，制备相应的培养液微滴，覆盖矿物油，培养箱内孵育(37℃，5％CO2，饱和湿度)至少0.5小时待用。
透明质酸酶可选用SAGE Biopharma公司产品(Hyaluronidase，Cat No.4007，SAGE Biopharma公司，美国)。
淋巴细胞分离液可选用Bio Basic，Inc.公司产品(Cat No.Q/GHSB85-2001，Bio Basic，Inc.公司，上海，中国)。
4、IVM方法高倍镜下核实未成熟卵(IMOs)类别(GV期或M-I期)后，分类别搬移IMOs至相应的IVM培养工作液微滴中将M-I期ccdIMOs搬移至autoMFF辅助的培养液A(即M-I期未成熟卵专用培养液)的微滴中，将GV期ccdIMOs搬移至autoMFF和autoCC共同辅助的培养液B(即GV期未成熟卵专用培养液)的微滴中；分别培养48-72小时(37℃，5％CO2，饱和湿度)。每6～12小时观察卵母细胞成熟情况，以第一极体(PB1)排出为卵细胞体外培养成熟的标志。一旦核实卵子成熟，接续ICSI处理和其后常规的植入前胚胎培养和发育观察。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实例。显然，本发明不限于以上实例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种人体未成熟卵体外成熟培养方法，所述未成熟卵是指卵巢刺激周期卵丘冠颗粒细胞剥除的未成熟卵，该方法包括配置和预温标准的人类体外成熟培养液，将第一次减数分裂前期、第一次减数分裂中期的未成熟卵均置于上述人类体外成熟培养液的微滴中进行培养；其特征是在所述人类体外成熟培养液中按照9∶1的体积比加入自体成熟卵泡液制成培养液A，将第一次减数分裂中期的未成熟卵置于所述培养液A的微滴中进行培养；在所述培养液A中加入分离、纯化的自体卵丘冠颗粒细胞沉淀，悬浮成自体卵丘冠颗粒细胞密度在1～5×105/ml的培养液B，将第一次减数分裂前期的未成熟卵置于所述培养液B的微滴中进行培养。
2.根据权利要求1所述的人体未成熟卵体外成熟培养方法，其特征是所述人类体外成熟培养液由基础培养液、体积浓度为10％人血清替代品、0.075IU/ml人促卵泡刺激素和0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素组成；然后在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内预温平衡至少4小时。
3.根据权利要求1或2所述的人体未成熟卵体外成熟培养方法，其特征是将所述培养液A制成相应培养微滴后，覆盖矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内孵育至少0.5小时；再将第一次减数分裂中期的未成熟卵置于上述孵育后的培养液A微滴中进行培养。
4.根据权利要求3所述的人体未成熟卵体外成熟培养方法，其特征是将所述培养液B制成相应培养微滴后，覆盖矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内孵育至少0.5小时；再将第一次减数分裂前期的未成熟卵置于上述孵育后的培养液B微滴中进行培养。
5.根据权利要求4所述的人体未成熟卵体外成熟培养方法，其特征是所述培养均是指在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内进行培养，以第一极体排出为卵细胞体外培养成熟的标志。
全文摘要
本发明公开了一种人体未成熟卵体外成熟培养方法，未成熟卵是指卵巢刺激周期卵丘冠颗粒细胞剥除的未成熟卵，该方法包括配置和预温标准的人类体外成熟培养液，在所述人类体外成熟培养液中按照9∶1的体积比加入自体成熟卵泡液制成培养液A，将第一次减数分裂中期的未成熟卵置于所述培养液A的微滴中进行培养；在所述培养液A中加入分离、纯化的自体卵丘冠颗粒细胞沉淀，悬浮成自体卵丘冠颗粒细胞密度在1～5×10
文档编号C12N5/08GK1800371SQ20051006211
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月19日 优先权日2005年12月19日
发明者朱小明, 黄荷凤, 朱依敏, 徐晨明, 钱羽力, 金帆 申请人:浙江大学