专利名称：定量测定睫状神经营养因子相关因子的方法
技术领域：
本发明涉及酸性磷酸酶法在定量测定睫状神经营养因子(Ciliary NeurotrophicFactor，简称CNTF)相关因子生物活性方面的用途，还涉及利用CNTF相关因子对原代鸡胚神经细胞的促存活作用、通过酸性磷酸酶法检测细胞的存活状况来定量测定CNTF相关因子生物活性的方法。
背景技术：
睫状神经营养因子最初是由Adler等人于1979年在鸡胚脉络膜、虹膜、睫状体中提取出来，发现其具有在体外促进鸡胚睫状神经元中的副交感神经节存活的能力，并因此而得名。CNTF是一种广泛存在的神经营养因子，其具有广泛的生物活性，是一种多功能的神经营养因子。其主要作用对象是神经系统，它促进感觉、运动和海马等神经元的存活，诱导神经元的分化，防止神经损伤，并在神经损伤的修复中起重要作用，能促进神经纤维再生及支持细胞类型的分化。根据已报道的动物模型及CNTF的功能研究，CNTF有可能成为治疗帕金森氏病、早老性痴呆及肌萎缩性侧索硬化等疾病的有效药物。CNTF由于缺乏信号肽，一般情况下只是储藏在雪旺氏细胞而不分泌，一旦有神经肌肉损伤发生则大量释放，且骨骼肌细胞上CNTF受体的表达可增加数十倍，已有文献证实CNTF具有促进体外培养的骨骼肌细胞增殖的作用，提示CNTF除了神经营养作用外，还可能对肌肉具有某种营养作用。在国外临床研究中CNTF还具有类似瘦素的减肥功效，通过作用于下丘脑中枢神经来控制食欲达到减肥目的，目前国外正在进行减肥治疗的三期临床。
因此，需要建立灵敏的CNTF测定方法以与其广泛的应用相适应。目前CNTF生物活性的检测方法主要是利用鸡胚神经节或鸡胚神经细胞受CNTF刺激后产生的两种生物学效应[1-5]。一种方法是利用显微镜观察CNTF对鸡胚神经节突触生长状况的影响，是一种形态学观察，只能大致进行半定量；另一种方法是检测鸡胚神经节的存活状况，首先对细胞进行染色以区分死细胞和活细胞，然后在显微镜下计数不同视野中活细胞的比例来进行判断，方法误差较大，难以准确定量。目前尚没有低成本且方便地定量测定CNTF的方法。
因此本领域中需要一种低成本且方便的方法来定量测定CNTF，以便于CNTF的广泛应用。
发明内容
本发明涉及酸性磷酸酶法在定量测定睫状神经营养因子(简称CNTF)相关因子生物活性方面的用途，还涉及利用CNTF相关因子对原代鸡胚神经细胞的促存活作用、通过酸性磷酸酶活性测定法检测细胞的存活状况来定量测定CNTF相关因子生物活性的方法。
因此，本发明的目的是提供定量测定CNTF相关因子生物活性的方法，该方法利用CNTF相关因子对原代鸡胚神经细胞的促存活作用，通过酸性磷酸酶活性测定法检测细胞的存活状况而实现。酸性磷酸酶活性测定的原理是活细胞溶酶体中普遍存在有酸性磷酸酶，其可以将底物pNPP(对硝基苯磷酸酯)催化生成黄色的对硝基酚，该物质在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应，黄色可稳定一段时间。由于离体培养的鸡胚原代神经细胞在CNTF的刺激下只能延长存活时间，并不能继续增殖，细胞数量上不再增加，因此不能用常见的一些检测细胞增殖的方法来检测CNTF的活性，如MTT方法等，而酸性磷酸酶的活性可以灵敏地反映细胞的活性状况。
在本发明的一个方面中，提供了通过酸性磷酸酶活性测定法在定量测定CNTF相关因子方面的用途。本文所用的术语“CNTF相关因子”是指具有CNTF促神经细胞存活作用的任意分子，包括从自然界分离的、具有CNTF促神经细胞存活作用的任意蛋白质或多肽，如CNTF、NGF等；包括通过分子生物学技术重组产生或化学合成的、具有CNTF促神经细胞存活作用的、野生型或突变型的任意蛋白质或多肽，其中所述的突变包括任意合适的氨基酸替换、添加和/或删除；还包括化学合成的、具有CNTF促神经细胞存活作用的模拟分子。
在本发明的一个方面中，提供了一种通过酸性磷酸酶法定量测定CNTF相关因子生物活性的方法，包括下列步骤(a)摘取位于鸡胚脊索神经两边的背根神经节；(b)将摘取的神经节置于消化液中消化，使鸡胚背根神经节细胞分散；(c)使消化分散的神经细胞在培养基中贴附于固相支持物上培养，获得原代鸡胚背根神经节细胞；(d)使用酸性磷酸酶活性测定法检测各稀释度的CNTF相关因子对原代鸡胚背根神经节细胞的促存活活性；(e)根据各稀释度CNTF相关因子的光吸收值绘制剂量—效应曲线；(f)根据剂量—效应曲线计算CNTF相关因子的半数有效作用剂量。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的CNTF相关因子是CNTF。
在本发明的另一个实施方案中，其中所述的CNTF相关因子是神经生长因子(简称NGF)。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的鸡胚是海兰鸡的鸡胚，也可以是来亨鸡或其他鸡种的鸡胚；使用前应灯检，只有鸡胚大小合适、血管丰富的正常发育鸡胚才能用于实验，如发现有其他异常现象则不应采用。所用鸡胚的胚龄是8-12天。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的消化液选自0.05％-0.25％(W/V)胰酶、0.02％EDTA及其组合，优选为0.25％(WN)胰酶和0.02％EDTA的组合。所述的消化于37℃或室温或4℃下进行1～30分钟，优选于4℃下进行30分钟。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的培养基为含有1-10％(V/V)血清的高糖DMEM培养基，优选含2％(V/V)胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养基中还可包含一些添加剂，选自青霉素、链霉素和谷氨酰胺。这些添加剂的浓度是细胞培养领域常用的浓度。因为本发明使用的是原代细胞，操作较粗放，稀释培养基又完全不含血清，因此加入上述添加剂能获得更好的效果。
在本发明的一个实施方案中，其中所述的固相支持物可以是细胞培养领域常用的一些基质，选自鼠尾胶原、多聚赖氨酸和小牛皮胶原。
本发明可以克服现有技术中的上述缺点，以浓度和酶标仪读数为坐标轴作图，使用常见的作图定量方法，确定半数有效剂量(ED50)。具体计算方法为以样品稀释度的对数值为横坐标，以样品在405nm的吸光值为纵坐标，根据实验数据在坐标纸上画出剂量—效应曲线，然后计算50％最高吸光值＝(最高吸光值+最低吸光值)/2，再利用50％最高吸光值通过数据曲线在横坐标上确定能引起50％最大活性的稀释度，该稀释度下对应的样品剂量即为半数有效剂量(ED50)，以能引起50％最大活性的稀释度对应的孔内样品所包含的生物活性确定为1个活性单位，再用相对应的浓度的倒数作为装量为100微升体积内所具有的生物活性单位。排除了通过显微镜观察来确定CNTF活性导致的主观误差，获得的结果更客观，更能真实反映CNTF的生物活性。
本方法的灵敏度高，可以检测到0.1ng/ml浓度的生物活性，在0.1ng/ml～10ng/ml的浓度范围内呈现非常明显的剂量—效应关系，CNTF浓度高于10ng/ml会对神经细胞造成一定的抑制作用，低于0.1ng/ml则对神经细胞的存活没有明显刺激作用。
本发明具有以下优点(1)获得的神经细胞活性高；(2)所使用的酸性磷酸酶法灵敏度高，重复性好，所需试剂廉价易得；(3)通过检测细胞的存活状况能定量的检测CNTF相关因子的生物活性。
图1为根据实施例1～4的实施方案的剂量-效应曲线。
具体实施例方式
下面将根据具体的实施例说明本发明的优选实施方案，这些实施方案只是为了说明本发明，并不限制本发明的实质和范围。
实施例实施例196孔细胞培养板的包被在摘取背根神经节之前预先用鼠尾胶原包被96孔细胞培养板，每孔加入鼠尾胶原50微升，风干30分钟后，吸弃多余鼠尾胶原，用高糖DMEM培养基洗一遍，待用。鼠尾胶原对神经细胞的贴附很重要，应铺展均匀，厚薄适当。
实施例2鸡胚背根神经节细胞的获得选取10日龄鸡胚，操作前预先用碘酒擦拭蛋壳消毒，轻轻敲开鸡胚气室端蛋壳，小心取出鸡胚，去除头、四肢和内脏组织，暴露出脊椎，在体视显微镜(或称为解剖镜；北京泰克XTL20型，最大放大40倍)下无菌操作摘取背根神经节。用0.25％的胰酶和0.05％的EDTA将摘取的背根神经节消化30分钟，消化温度4℃。吸弃消化液，用培养基洗2次，加入培养基吹打分散细胞，台盼蓝活细胞记数法获得活的神经细胞浓度。
实施例3hCNTF样品的稀释以基因工程大肠杆菌发酵并经离子交换柱、凝胶柱等纯化方法精制提纯而获得的重组hCNTF突变体原液为样品。该基因工程大肠杆菌已经于2005年3月22日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学，邮编430072)进行了生物保藏，保藏编号为CCTCC NO M205025。其具体发酵和制备方法参见本申请人在与本申请的同一天提交的、题目为“重组人睫状神经营养因子突变体及其制备方法”的专利申请，其通过引用并入本文。该样品由其浓度用lowry定蛋白法检测为2.7mg/ml，纯度用SDS-PAGE方法和HPLC方法检测大于98％，等电点为5.8-6.4，类毒素检测阴性。用含100IU/ml的青霉素、100μg/ml链霉素和4mmol/L谷氨酰胺的高糖DMEM培养基稀释样品，最高浓度为3000倍稀释，以下使用9000倍稀释、27000倍稀释等作3倍梯度稀释，共10个稀释样品。
实施例4定量测定hCNTF样品用含2％血清的高糖DMEM培养基稀释神经细胞液至50000个细胞/ml，加入到如实施例1所述用鼠尾胶原包被的96孔细胞培养板中，每孔100微升。待神经细胞贴壁2小时后吸弃含血清的培养基，每孔加入含不同浓度hCNTF的高糖DMEM培养基100微升，每个稀释度做3个重复孔，另外取3孔加入不含样品的同样配制的高糖DMEM培养基作为阴性对照，放置于温度37℃、二氧化碳浓度5％、饱和水蒸气的培养箱中培养48小时。依次吸尽各孔中培养液，弃去。每孔各加入200微升PBS缓冲液(0.058mol/L Na2HPO4，0.017mol/L NaH2PO4，0.068mol/L NaCl，pH7.4)，静置1分钟后依次吸尽各孔中PBS，弃去。往各孔中依次加入100微升1mg/ml pNPP底物液(称取一定量的pNPP，按比例加入包含0.1mol/L乙酸钠pH6.0，0.2％ TritonX-100，1mmol/L EDTA的缓冲液将其完全溶解。临用前配制，1小时内使用)，放37℃。待4小时后，每孔各加入10微升1mol/L NaOH，混合均匀。室温放置10分钟后，于BIO-TEK酶标仪405nm处读取吸光度值，如下表所示。根据获得的数据作如图1所示的剂量-效应曲线，确定样品的半数有效剂量ED50，并确定活性为1.63×107单位/ml，比活性为6.05×106单位/mg。
参考文献1、细胞因子研究方法学；孙卫民，王惠琴；人民卫生出版社；P76-P78。
2、生物技术药物研究开发和质量控制；王军志；科学出版社；P466-467；P475-P478。
3、人睫状神经营养因子原核表达、纯化及其生物效应；咸海青，范明等；中国应用生理学杂志；1996，12(1)，P21-24。
4、睫状神经营养因子的cDNA克隆、表达、纯化及其生物活性鉴定；江国春，袁丽珍等；基础医学与临床；2000，20(1)，P27-30。
5、人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性；李鸿钧，马雁冰等；中国生物制品学杂志；2002，15(3)，P155-158。
权利要求
1.一种通过酸性磷酸酶活性测定法定量测定CNTF相关因子生物活性的方法，包括下列步骤(a)摘取位于鸡胚脊索神经两边的背根神经节；(b)将摘取的神经节置于消化液中消化，使鸡胚背根神经节细胞分散；(c)使消化分散的神经细胞在培养基中贴附于固相支持物上培养，获得原代鸡胚背根神经节细胞；(d)使用酸性磷酸酶活性测定法检测各稀释度的CNTF相关因子对原代鸡胚背根神经节细胞的促存活活性；(e)根据各稀释度CNTF相关因子的光吸收值绘制剂量—效应曲线；(f)根据剂量—效应曲线计算CNTF相关因子的半数有效作用剂量。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的CNTF相关因子选自CNTF和神经生长因子。
3.权利要求1所述的方法，其中所述鸡胚的胚龄是8-12天。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的消化液选自0.05％-0.25％(W/V)胰酶、0.02％EDTA及其组合。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的消化于4℃～37℃下进行1～30分钟。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的培养基为含有1-10％(V/V)血清的高糖DMEM培养基。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的光吸收值在405nm下测定。
8.权利要求1所述的方法，其中所述CNTF相关因子的稀释后浓度范围是0.1ng/ml～10ng/ml。
9.权利要求1所述的方法，其中所述的固相支持物选自鼠尾胶原、多聚赖氨酸和小牛皮胶原。
10.酸性磷酸酶活性测定法在定量测定CNTF相关因子生物活性方面的用途。
全文摘要
本发明涉及利用睫状神经营养因子(CNTF)相关因子对原代鸡胚神经细胞的促存活作用、通过酸性磷酸酶活性测定法检测细胞的存活状况来定量测定CNTF相关因子生物活性的方法。
文档编号C12Q1/42GK1721851SQ20051006619
公开日2006年1月18日 申请日期2005年4月21日 优先权日2005年4月21日
发明者朱俊铭, 冷武军, 周虎, 汪怡 申请人:梁亮胜