专利名称：用于表征一种氧化还原剂系统酶的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于表征氧化还原系统酶的方法和组合物。
背景技术：
对当今社会而言，生理性液体或样品例如血液或血液制品的分析物检测正日益重要。分析物检测试验用于多种应用中，所述应用包括临床实验室化验、家庭化验等，这些化验结果在多种疾病的诊断和控制中充当重要的角色。所研究的分析物包括用于糖尿病控制的葡萄糖、胆固醇等。随着分析物检测的日益重要，已经研究了多种用于临床和家庭的分析物检测规程和装置。
一种类型的用于分析物检测的方法为电化学方法。在这类方法中，将一种水溶液样品放在电化学槽的反应区中，所述电化学槽包括至少两个电极，即一个参比电极和一个工作电极。使待分析成分同一个电极直接反应，或者使之同一种氧化还原剂直接或间接地反应从而形成一种可氧化(或可还原)的物质，所述物质的量对应于待分析成分、即分析物的浓度。然后用电化学方法推算存在的可氧化(或可还原)物质的量，其与原始样品中存在的分析物的量有关。
在许多这种用于分析物检测的电化学方法中，使用一种分析物氧化信号产生系统，所述系统包括一种酶成分和一种介质成分，所述酶成分氧化所研究的分析物，然后向介质传递一个电子，所述介质依次将电子传递到电化学槽的一个电极上，从而产生一个电信号，可由所述电信号测定所述分析物的浓度。
在设计电化学分析物检测试验和系统中，期望使用一种分析物特异性酶。例如对于测定葡萄糖而言，可溶解形式的吡咯并喹啉醌(PQQ)依赖的葡糖脱氢酶(后面称之为s-GDH)是一种可在葡萄糖氧化信号产生系统中使用的酶。s-GDH是一种弱电子受体，因此有利地，对在流体样本中存在的氧不敏感。
然而，天然存在或“野生型”的s-GDH的缺点为它不仅氧化葡萄糖，还氧化其它还原糖，所述还原糖包括麦芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖以及核糖。在某些情况下，s-GDH与葡萄糖之外的糖的反应性可损害一些糖尿病病人血糖水平检测的精确度。例如，病人在进行腹膜透析时用icodextrin(一种葡萄糖聚合物)处理，其血液中可能含有很高水平的麦芽糖。
s-GDH特异性的缺乏导致人们试图通过产生变异形式的酶例如产生一个或多个氨基酸替换来提高s-GDH的特异性。然而，在可以使用这种“转变”酶之前，必须对其进行测试以测定其用于分析物检测试验的适宜性。
虽然费时，但分光光度法试验已被用于测定s-GDH的活性，但仅在酶限制性条件下使用。在美国专利US6,103,509和欧洲专利申请NO.1176202A1中公开的一种分光光度法试验使用2，6-二氯酚吲哚酚(DCIP)和甲硫酸吩嗪(PMS)作为人工介质。
然而，典型的使用s-GDH的商用葡萄糖测试带不使用酶限制性条件，这是因为酶过量存在以保证带的长期性能。通常仅生产少量的重组体蛋白质，例如s-GDH的变异形式。测试这些变异形式s-GDH的反应性涉及制备涂覆有酶的带，以及用含有各种浓度的葡萄糖和每种可能的干扰(即还原)糖的全血或血浆测试每一批带。制备涂覆有每种变异形式s-GDH的测试带需要大量的每种变异体，其费时、劳动强度大、需要技术人员用人血或血浆测试所述带，这可能产生生物危害。
因此，需要一种快速和便宜的底物限制性试验来测定是否由于特定突变酶例如s-GDH的葡萄糖特异性相对于野生型s-GDH得到了提高而使其大规模生产得到保证。除了掺有还原糖的全血或血浆样品之外，所述试验还可用于掺有葡萄糖或干扰糖的不含血液的样品。
因此，在本领域仍然需要的是一种快速和简单的方法，所述方法用于测定变异形式s-GDH的糖特异性，所述方法使用少量的酶并在一种典型的、基于电化学的测试带上模拟底物限制性条件，用于测量流体样品(例如全血或血浆)中的分析物(例如葡萄糖)。此外，还期望一种用于测试酶活的快速和简单的方法。
相关文献美国专利文献5,484,708；5,723,284；5,834,224；5,942,102；5,972,199；5,997,817；6,059,946；6,083,710；6,103,509；6,121,009；6,134,461；6,179,979；6,193,973；6,231,531；6,284,125；6,340,428；6,444,115以及6,716,577；以及其它专利文献US2003/0104595；WO99/49307；WO97/18465；WO01/57510；WO01/57238；WO02/48707；WO02/50609；WO02/06788；EP0969097；EP1176202；JP091403378A和GB2304628。
发明内容
本发明提供了用于表征氧化还原剂系统酶的方法和组合物。在实施上述方法时，将一种包括氧化还原剂系统酶和已知量底物的样品施加到一个电化学槽，所述槽包括一种无酶试剂组合物，所述组合物具有一种氧化还原剂系统介质。还提供了包括上述电化学槽的电化学测试带、包括所述带的系统以及成套部件。本发明用在多种不同的应用中，所述应用包括氧化还原剂系统的表征应用。
通过参考下述详细的说明书和附图，将更好地理解本发明的特征和优点，所述说明书列出了使用本发明原理的说明性实施方案，附图中的图1为说明根据本发明的一种代表性实施方案的工艺中连续步骤的流程图，其用于测试变异形式的s-GDH；图2A和2B各为测试带的分解图和顶视图，可将所述带用在根据本发明的代表性工艺中；图3为说明根据本发明的一种代表性实施方案的工艺中连续步骤的流程图，其用于测试野生型s-GDH及其变异体的活性；图4为显示野生型s-GDH和两种变异形式s-GDH(Asn452Thr和Asp167Glu)相对于不含干扰糖对照物的绝对偏差的图，所述绝对偏差为木糖浓度的函数，其使用常规涂覆酶的测试带；图5为显示作为糖浓度函数的响应的图，其用于常规的涂覆酶的测试带，其中所述酶为野生型s-GDH；图6为显示作为糖浓度函数的响应的图，其在根据本发明的工艺中使用野生型s-GDH；图7为显示作为糖浓度函数的响应的图，其在根据本发明的工艺中使用变异形式的s-GDH Asn452Thr；图8为显示作为糖浓度函数的响应的图，其在根据本发明的工艺中使用另一种变异形式的s-GDH Asp167Glu；图9为显示用于野生型s-GDH标准曲线的图，所述曲线在根据本发明的工艺中获得；图10为显示在图9中说明的标准曲线的图，其为双倒数曲线图。
具体实施例方式
本发明提供了用于表征氧化还原剂系统酶的方法和组合物。在实施上述方法时，将一种包括氧化还原剂系统酶和已知量底物的样品施加到一电化学槽，所述槽包括一种无酶试剂组合物，所述组合物具有一种氧化还原剂系统介质。还提供了包括上述电化学槽的电化学测试带、包括所述带的系统以及成套部件。所述发明用在多种不同的应用中，所述应用包括氧化还原剂系统表征应用。
在进一步公开本发明之前，应该理解的是本发明不局限于本发明下述具体实施方案，因为可对所述具体实施方案进行改变，且其仍然属于所附权利要求的范围。还应该理解的是所用的术语是为了公开具体实施方案，其并不意味着限制。相反，本发明的范围将由所附权利要求确定。
在本说明书和所附权利要求中，除非上下文清楚规定，否则单数形式的“一”包括复数，除非上下文中有明确的相反说明。除非另行限定，否则对本发明所属领域的技术人员而言，所有用于此处的技术和科学术语具有与常规理解相同的含义。
当提供了一个数值范围时，应当理解，每个中间值都被包括在本发明中，包括至下限十分之一单位(除非上下文中有相反说明)的中间值，在该范围上下限之间的中间值，以及在该指明的范围内的任何其它指明的值、或中间值。这些更小的范围的上下限可以独立地被包括在这些更小的范围内，并且也包括在本发明中，除非在该指明范围内特别排除了某个端点。当该指明的范围包括一个或两个端点时，排除一个或两个被包括的端点的范围也包括在本发明中。
除非另行限定，否则对本发明所属领域的技术人员而言，所有用于此处的技术和科学术语具有与常规理解相同的意思。尽管在实施或测试本发明中，可使用任何与在此公开的方法、装置和材料相似或等价的方法、装置和材料，但现在将公开优选的方法、装置和材料。
为了说明和公开细胞系、载体以及方法，在此以引用的方式将所有在此提到的出版物包括在内，所述细胞系、载体以及方法在所述出版物中公开，并可将之同所述发明结合使用。
如上所述，本发明提供了用于表征酶的方法和组合物。在进一步说明本发明的过程中，首先更详细评述上述方法及其代表性具体应用，然后评述用于实施所述方法的代表性组合物和系统。
方法如上所述，本发明提供了表征酶的方法。表征一种酶意味着测定该酶的特征或参数。所述特征可为所述酶的固有特征例如它的底物选择性，或者至少部分依赖环境的特征例如在给定流体培养基中酶的浓度、在给定流体培养基中酶的活性等。当然，所述特征可为固有因素和环境因素的产物。在下面更详细地公开具体的代表性特征，使用本发明所述的方法可测定所述代表性特征。
所述方法包括将一种含有氧化还原剂系统酶的样品施加到一电化学槽，并检测由所述槽产生的电信号，然后使用所述检测到的信号来表征所述样品中的氧化还原剂系统酶。
本发明的一些代表性实施方案的特征在于同所述电化学槽接触的所述样品包括氧化还原剂系统酶和已知量的酶底物，而所述电化学槽包括一种无酶试剂组合物，将所述样品施加到所述电化学槽，所述无酶试剂组合物包括氧化还原剂系统的介质成分，其中所述样品中的酶为所述系统的一种组成成分。现在，将分别更详细地公开上述方法的实施方案中使用的样品和电化学槽成分。
样品在实施上述方法中，同所述电化学槽接触的样品是这样一种样品，其包括氧化还原剂系统酶和已知量的底物或者至少是所述酶的可能底物即酶底物。
酶在许多实施方案中，所述样品的酶成分是一种酶或者多种酶，所述多种酶一起氧化所研究的分析物。换句话说，所述酶成分可由单独一种分析物氧化酶或者由两种或多种酶的收集物组成，所述两种或多种酶一起氧化一种给定的研究分析物，使得在电化学槽中产生一种电化学信号，如下所述。所研究的酶包括氧化酶、脱氢酶、脂肪酶、激酶、黄递酶、醌蛋白酶(quinoprotein)等。所研究的更具体的代表性酶包括但不局限为葡萄糖氧化酶、葡糖脱氢酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、脂蛋白脂肪酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶、乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、醇氧化酶、胆红素氧化酶、尿酸酶等。如在下面更详细公开的一样，在所研究的一些实施方案中，所述酶是葡糖脱氢酶例如s-GDH或其变异体。
在一些实施方案中，所述酶成分可以以大约35-大约450μM的浓度存在，通常以大约80-大约270μM的浓度存在。
酶底物在上述方法中使用的样品还包含一种已知量的酶底物。所述酶底物可为存在于所述样品中的酶的已知的底物或者存在于所述样品中的酶的后备底物。例如，当所述酶为葡糖脱氢酶时，所述样品中的底物可为葡萄糖(已知其为所述酶的底物)或另一种糖例如麦芽糖，也就是说，或者已知其为该酶底物，或者怀疑其为该酶底物。已知量意味着所述样品具有固定或预定量或浓度的底物。在一些实施方案中，所述样品中的酶底物的浓度为大约0-大约50mM(大约0-大约900mg/dL)，通常为大约0-大约45mM(大约0-大约810mg/dL)。在一些实施方案中，当所述酶底物明确存在时，样品中所述酶底物的浓度为大约0.1-大约50mM(例如，为大约0.01-大约900mg/dL)，通常为大约0.1-大约45mM(例如，大约0.01-大约810mg/dL)。
辅酶在一些实施方案中，流体培养基样品还包括一种辅酶，所述辅酶使所述酶成分活化。所研究的辅酶的一种实例为吡咯并喹啉醌(PQQ)。取决于用于测试剂的酶的类型，所研究的其它辅因子包括但不局限为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、细胞色素等。在一些实施方案中，任何辅酶的浓度可为大约60-大约670μM，通常为大约100-大约430μM。
酶辅因子在一些实施方案中，所述样品还包括一种或多种酶辅因子。所研究的酶辅因子包括二价金属阳离子例如Ca2+、Mg2+等。任何辅因子的浓度可为大约0.5-大约5mM。
电化学槽如上所述，在实施上述方法中，将所述样品施加到一电化学槽，所述电化学槽包括一种无酶试剂组合物。已知多种不同类型的电化学槽配置，包括在美国专利文献5,723,284；5,834,224；5,942,102；5,972,199；5,997,817；6,083,710；6,121,009；6,134,461；6,193,873以及6,716,577(在此参考引用其所公开的内容)以及在其它专利文献WO99/49307；WO97/18465；WO01/57510；WO01/57238；WO02/48707；WO02/50609；EP0969097A2以及GB2304628(在此参考引用其优先权文献，所述优先权文献为美国申请)中公开的配置。可改进任何本领域技术人员已知的这些或其它电化学槽以加入上述组合物。
在一些实施方案中，所述电化学槽存在于一种电化学测试带中。在图2A和2B中提供了根据本发明的电化学测试带的模型。图2A提供了一种电化学测试带的分解图，所述测试带由工作电极和参比电极组成，所述电极由隔离层隔离，所述隔离层具有一剖面，所述剖面在装备的带上限定反应区或范围，将在下面进一步公开这些要素。图2B显示了相同装配形式的测试带。现在，将在下面更详细地公开多种组件中的每一个。
电极上述包括试剂组合物的电化学测试带包括一工作电极和一参比电极。通常，工作电极和参比电极以细长矩形带的形式配置。一般地，电极的长度为大约1.9-大约4.5cm，通常为大约2-大约2.8cm。电极的宽度为大约0.38-大约0.76cm，通常为大约0.51-大约0.67cm。一般地，参比电极的厚度为大约10-100nm，通常为大约18-大约22nm。在一些实施方案中，电极中的一个的长度要比另一个的长度短，在一些实施方案中，大约短0.32cm。
工作和参比电极的特征还在于至少面对带中反应区的电极表面为导电材料例如为金属或其它导电材料，所研究的代表性材料包括但不局限为钯、金、铂、银、铱、碳、掺杂氧化锡、不锈钢等。在一些实施方案中，所述导电材料为金或钯。虽然原则上整个电极可由导电材料组成，但通常每个电极由惰性支持材料组成，在所述惰性支持材料的表面上存在有电极的导电材料成分的薄层。在上述电极中，可使用任意便利的惰性衬底材料，一般地，所述材料是一种刚性材料，其能够给电极，从而从总体上看，给电化学测试带提供结构支撑。可用作衬底的适宜材料包括塑料例如PET、PETG、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯、硅、陶瓷、玻璃等。
隔离层上述电化学测试带的一个特征在于上述工作和参比电极彼此面对，且仅相隔很短的距离，以至于在电化学测试带的反应区或范围中，工作和参比电极之间的距离极小。在上述测试带中，工作和参比电极的最小间距起因于设置在或夹在工作和参比电极之间的薄隔离层的存在。所述隔离层的厚度一般为大约1-大约500μm，通常为大约100-大约200μm。切割所述隔离层从而给反应区或范围提供至少一个进入所述反应区的入口以及通常一个离开所述反应区的出口。在图2A和2B中可看见代表性隔离层的构造。尽管在这些图中显示所述隔离层具有圆形反应区，且所述区域被切割有侧入口和出口或排出口，但为其它形状例如正方形、椭圆形、三角形、矩形、不规则形状的反应区等是可能的。可用任意便利的材料制造所述隔离层，代表性的适宜材料包括PET、PETG、聚酰亚胺、聚碳酸酯等，可处理所述隔离层的表面使之粘着于各自的电极上，从而维持所述电化学测试带的结构。特别感兴趣的是将模切双面粘着带用作隔离层。
反应区上述电化学测试带包括一反应区或范围，其由工作电极、参比电极以及隔离层限定，这些要素如上所述。特别地，所述工作和参比电极限定所述反应区的顶部和底部，而所述隔离层限定所述反应区的壁。所述反应区的容积至少为大约0.1μl，通常至少为大约1μl，更通常为至少大约1.5μl，所述容积可为10μl大或者更大。如上所述，所述反应区通常包括至少一个入口，在许多实施方案中还包括一个出口。入口和出口的横截面面积可改变，只要其足够大从而自所述反应区提供流体的有效进入和退出即可，但是所述横截面面积一般为大约9×10-5-大约5×10-3cm2，通常为大约5×10-4-大约2.5×10-3cm2。
无酶试剂组合物一种无酶试剂制品存在于所述反应区，所述试剂制品一般以干燥形式存在。无酶意味着所述制品至少不包括存在于所述样品中的氧化还原剂系统酶，所述样品将通过电化学槽进行试验。同样，如果将被施加到电化学槽的样品包括一种葡糖脱氢酶，则存在于所述电化学槽的试剂制品不包含葡糖脱氢酶，且在许多实施方案中不包含任何酶。
存在于电化学槽的无酶试剂制品的特征在于存在一种氧化还原介质(mediator)，所述介质可包括一种或多种介质试剂。所述介质充当一种媒介，其促进电子从酶(在分析物氧化过程中，所述酶从所述分析物带走一个或多个电子)到电极的转移。可使用本领域已知的多种不同的介质试剂，其包括铁氰化物、吩嗪、乙基硫酸酯、甲硫酸吩嗪、苯二胺、N，N，N’，N’-四甲基苯二胺、1-甲氧基-甲硫酸吩嗪、2，5-二甲基-1，4-苯醌、2，6-二甲基-1，4苯醌2，5-二氯-1，4-苯醌、二茂铁衍生物、二吡啶锇(osmium bipyridyl)络合物、钌络合物等。在代表性实施方案中，所述氧化还原介质为铁氰化物。
所述试剂组合物中的另一种成分为一种介质稳定缓冲成分。上述介质稳定缓冲成分可由一种或多种例如两种、三种、四种或者更多种不同缓冲剂组成，在所述组合物以干燥形式贮存过程中，所述缓冲成分使介质稳定，从而使得在使用前例如在贮存过程中只有很少(如果有的话)介质被还原。
在一种实施方案中，所述缓冲剂为多羧酸。多羧酸意味着所述缓冲剂包括两种或多种羧酸官能部分(moiety)，不同羧酸官能部分的数目可为大约2-大约10个，例如大约2-大约8个，包括大约2-大约6个。上述缓冲剂的羧酸基团或官能部分可连在许多不同结构上，所述结构包括脂肪族、脂环族、芳香族以及杂环结构。多于一个羧酸基团的存在对为所述缓冲剂提供至少一个期望范围内的pKa值具有有利影响。所研究的特定多羧酸包括但不局限为苯六羧酸、柠康酸、马来酸等。
当所述试剂组合物为一种干燥试剂制品时，例如在下面更详细描述的电化学带中可能存在的那样，存在于所述干燥组合物中缓冲成分的量一般为大约0.01-大约40.00，通常为大约1-大约10％wt/wt。
所述试剂组合物还可包含一种或多种下述附加成分润湿剂、洗涤剂稳定剂、粘度调节剂或其混合。
在一些实施方案中，可将所述润湿剂同洗涤剂一起添加到所述试剂组合物中，从而促进所述试剂组合物在电化学测试带上的均匀涂覆。也可使用一种或多种试剂混合物。所用试剂可提高试验试剂的溶解性以及增强毛细管充填带的毛细管特性。所述试剂包括本领域已知的一些试剂例如聚合物、消泡剂以及表面活性剂。所研究的代表性类型的表面活性剂/洗涤剂包括但不局限为Tritons、Macols、Tetronics、Silwets、Zonyls以及Pluronics。适宜的试剂包括Pluronic材料，其为聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物。Pluronic材料的实例包括Pluronic P103以及Pluronic F87 Prill，前者具有很好的润湿性能，后者具有很好的洗涤性能。Pluronic P103和F87Prill都具有高于80℃的雾点温度，由于在干燥过程中，这种性能可避免在组合物中的相变，所以期望这种性能。
可将稳定剂添加到试剂组合物中，从而帮助所述酶的稳定并阻止蛋白质的变性。所述稳定剂还可以帮助介质的氧化还原状态的稳定，特别是氧化的氧化还原介质的稳定。稳定剂的实例包括但不局限为碳水化合物(例如蔗糖、海藻糖、甘露糖醇以及乳糖)、氨基酸、蛋白质(例如BSA以及清蛋白)、有机化合物例如EDTA等。
可将粘度调节剂添加到所述试剂中以调节液体试剂的流变能力。这种药剂的实例包括聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、右旋糖酐、BSA等。
方法在实施上述方法中，第一步为将大量流体培养基或样品引入到电化学槽(例如电化学测试带中的电化学槽)的反应区。样品制备和施加到反应区之间的时间段可以改变，但在一些代表性实施方案中为大约30秒-大约8小时，例如为大约5分钟-大约3小时，包括大约30分钟-大约60分钟。引入到电化学槽反应区的样品的量可以改变，但一般为大约0.05-大约10μl，通常为大约0.5-大约1.6μl。可使用任何便利的规程将所述样品引入到所述反应区，所述样品可被注射、通过毛细作用等便利的方式进入到所述反应区。
在将所述样品施加到所述反应区之后，使用参比和工作电极进行电化学测试。所进行的电化学测试取决于所述试验和装置的特殊属性例如取决于所述试验是否为库仑法、安培法或电位法而改变，所述装置与电化学测试带一起使用。一般地，通常在将样品引入到所述反应区之后，在给定的一个时期内，所述电化学测试将测量电荷(库仑法)、电流(安培法)或电压(电位法)。用于进行上述电化学测试的方法还在美国专利Nos.4,224,125；4,545,382；5,266,179以及WO97/18465；WO99/49307中公开，在此参考引用其所公开的内容。
在检测上述反应区中产生的电化学信号之后，以某种方式使用该信号来表征样品中的酶，例如检测酶的底物特异性、检测施加到所述槽的样品中酶的浓度等，在下面更详细地公开这两种代表性应用。在一些实施方案中，通过一种装置自动进行上述电化学信号测量步骤和酶表征步骤，所述装置被设计成可与所述测试带一起工作以便在将样品施加到电化学槽之后，来进行这些步骤。此外，在美国专利No.6,193,873中公开了一种代表性读数装置，所述装置用于自动实施所述步骤中的至少一些步骤，在此参考引用其所公开的内容。
实用性如上所述，发现上述方法用在多种不同的应用中，在所述代表性应用中，发现上述方法可用于上述酶表征应用。
通过上述方法可实现的第一种代表性酶表征应用为同一种或多种添加酶相比，检测第一种酶的底物或分析物特异性，例如同其它还原糖如麦芽糖相比，葡糖脱氢酶突变体对葡萄糖的特异性，其中相对于第二种葡糖脱氢酶如野生型脱氢酶确定所述特异性。
在实施本发明的这些代表性应用中，制备一系列流体样品，所述样品至少包含第一和第二种酶，所述酶同第一和第二种酶底物组合，然后在电化学槽中单独测试每一个制好的样品。单独测试意味着在其自己的或分离的电化学槽中测试系列中的每一个样品。
在一些实施方案中，根据本方法被制备，然后被分别施加到电化学槽中的样品系列至少包括(i)一种样品，其含有第一氧化还原剂系统酶以及已知的第一浓度的第一酶底物；(ii)一种样品，其含有第一氧化还原剂系统酶以及已知的第一浓度的第二酶底物；(iii)一种样品，其含有第二氧化还原剂系统酶以及所述已知的第一浓度的第一酶底物；以及(iv)一种样品，其含有第二氧化还原剂系统酶以及所述已知的第一浓度的第二酶底物。
在一些实施方案中，所述特异性试验包括在第一和第二酶底物的不同浓度如在第一和第二酶的多种不同浓度下测试每一种酶。在这些实施方案中，至少制备和测试下述附加样品(i)一种样品，其含有第一氧化还原剂系统酶以及已知的第二浓度的第一酶底物；(ii)一种样品，其含有第一氧化还原剂系统酶以及已知的第二浓度的第二酶底物；(iii)一种样品，其含有第二氧化还原剂系统酶以及已知的第二浓度的第一酶底物；以及(iv)一种样品，其含有第二氧化还原剂系统酶以及已知的第二浓度的第二酶底物。
这些应用的代表性实施方案为针对底物特异性评估不同的s-GDH酶，所述底物特性即利用葡萄糖作为底物但不竞争还原糖的能力。在图1中进一步说明了这种实施方案。图1为方法100的流程图，所述方法用于根据本发明的示范型实施方案，测试野生型和变异形式的s-GDH。方法100包括如在步骤110中所示提供一电化学槽。如分别在图2A和2B中的分解图和顶视图所示，可以测试带200的形式提供用于根据本发明方法的典型电化学槽。测试带200包括一工作电极202和一参比电极204，所述电极被隔离层206隔开。工作电极202包括干燥试剂带208，所述带含有缓冲介质、表面活性剂以及稳定剂。隔离层206包括一剖面，在装配的带上，所述剖面在电化学槽210中，限定了所述反应区。
如上所述，用于参比电极的204的适宜材料包括上述所列用于工作电极202的材料。用于以对电极形式存在的参比电极204的材料通常为钯或金。在一种电化学槽形式中，其中电极在同一平面，参比电极204通常为碳。
参比电极204通常涂覆有一种稳定剂，所述稳定剂在其分子结构中含有硫部分。所述涂层还可包括亲水基和间隔基，所述间隔基在含硫部分和所述亲水基之间。在参比电极204涂层中有用的化合物实例包括但不局限为2-巯基乙烷磺酸、2-巯基乙醇、2-巯基乙胺、3-巯基丙酸、噻吩、4-羧基噻吩、半胱氨酸、同型半胱氨酸以及胱氨酸。参比电极204通常由涂覆有2-巯基乙烷磺酸的金组成。
通过如在欧洲专利申请EP1324038A2中公开的开缝涂覆，可将干燥试剂208涂覆在工作电极202上，在此参考引用其所公开的内容。涂覆试剂的其它方法包括但不局限为喷墨和针涂覆。
切割隔离层206以提供一反应区，所述反应区具有至少一个进入其中的入口以及通常一个离开所述反应区的出口。隔离层206如图2A和2B所示，其具有一圆形反应区，所述反应区被切割有侧入口和出口。其它反应区形状包括但不局限为正方形、椭圆形、三角形、矩形以及不规则形状的反应区。可由任何适宜的材料制造隔离层206，所述材料包括但不局限为PET、PETG、聚酰亚胺以及聚碳酸酯，由此，可处理隔离层206的表面从而使之具有粘性。隔离层206一般是模切双面有粘性。
所述介质可为铁氰化物、吩嗪乙基硫酸酯、甲硫酸吩嗪、苯二胺、N，N，N’，N’-四甲基苯二胺、1-甲氧基-甲硫酸吩嗪、2，5-二甲基-1，4-苯醌、2，6-二甲基-1，4-苯醌、2，5-二氯代-1，4-苯醌、二茂铁衍生物、二吡啶锇络合物、钌络合物等。适宜的缓冲剂对二价金属阳离子(例如Ca2+)几乎没有粘合吸引力，其可以为柠康酸盐(citraconate)、柠檬酸、苹果酸、马来酸、磷酸盐、“Good”缓冲剂等。此外，所述缓冲溶液可包括表面活性剂或润湿剂以及稳定剂，所述表面活性剂包括Triton、Macol、Tetronic、Silwet、Zonyl以及Pluronic，所述稳定剂包括蔗糖、海藻糖或甘露糖醇。在一种优选实施方案中，所述介质为铁氰化物，所述缓冲剂为柠康酸盐，所述表面活性剂为Pluronic以及所述稳定剂为蔗糖。
接着，如方法100中的步骤120所示，将缓冲溶液中的野生型或者至少一种变异形式的s-GDH同辅酶、辅因子以及不同浓度的第一还原糖(例如葡萄糖)相混合。第一还原糖可为但不局限为葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、木糖或乳糖。所述辅酶可为PQQ，所述辅因子可为钙。
根据本发明，在所述方法中使用的s-GDH可为任何一种天然或变异形式的s-GDH，所述方法包括方法100和300(见下面)，在所述变异形式的s-GDH中进行天然酶氨基酸顺序的至少一种改变，所述改变包括但不局限为进行一个或多个氨基酸的置换或删除从而提高葡萄糖特异性。可使用本领域技术人员公知的技术进行s-GDH的改变，所述技术在上述美国专利No.6,103,509和欧洲专利申请No.EP1176202A1中公开，在此参考引用其所公开的内容，制备野生型酶变异体的一般方法对本领域技术人员而言是公知的。
如在图1的步骤130中所示，将酶/糖溶液各自添加到分离的电化学槽中，所述电化学槽含有缓冲介质、表面活性剂以及稳定剂。接着，测量电流响应，并如步骤140所示，将之作为糖浓度的函数制图。由于酶和介质之间的反应速度很快，在测量电流响应之前，将所述酶/糖溶液同所述介质分离是有利的。如果在将所述溶液添加到电化学槽之前，将酶同介质混合，在能测量所述电流响应之前，所述反应将已完成或接近完成。然后如在步骤150(参见实施例2-4)中所示，针对至少一种附加的还原糖和至少一种附加的变异形式的s-GDH，重复步骤110-140。所述至少一种附加的还原糖可为但不局限为半乳糖、麦芽糖、木糖或乳糖。接着，如在步骤160和170中所示，选择至少一种变异形式的s-GDH，所述s-GDH对至少一种附加糖具有降低的响应。
以这种方式，可很容易地测定变异s-GDH相对于野生型s-GDH的特异性。
在另一种代表性应用中，使用上述方法来测定流体样品中酶的浓度或活性。在实施这种方法中，将一种流体样品施加到电化学槽中，所述样品含有一未知量的酶和已知量的底物。在施加之后，使用检测到的电信号来测定所施加样品中分析物的浓度，例如通过将所述检测到的电信号同一参考值相比。
图3为说明根据本发明的方法300中的一系列步骤的流程图，所述方法用于测量样品中野生型s-GDH及其变异体的活性。方法300包括如步骤310所示，提供一种含有干燥介质的电化学槽，所述干燥介质在缓冲液中，且所述缓冲液具有表面活性剂和稳定剂。接着如步骤320所示，将浓度增加的野生型s-GDH或变异形式的s-GDH同恒定量的葡萄糖混合。然后如步骤330所示，将每一酶/葡萄糖样品添加到分离的电化学槽中。如在步骤340中所示，测量每一个样品的电流响应，并将所述响应作为酶浓度的函数制图从而制成标准曲线，在后续步骤中，可将所述标准曲线用作参考值。接着如步骤350所示，针对至少一批附加野生型或变异形式的s-GDH，重复步骤310-340。如在步骤360中所示，然后例如通过将所述测定信号同所述参考值相比，从所述标准曲线或参考值读取至少一批附加野生型或变异形式的s-GDH的酶浓度。
系统本发明还提供用于实施上述方法的系统，如上所述，所述系统包括至少一种样品或流体培养基和电化学槽，所述样品包括一种氧化还原剂系统酶，所述电化学槽包括一种无酶试剂组合物。
上述系统还可以包括一种用于电化学分析样品的装置，其使用上述试剂组合物。
上述系统的装置或仪表通常为电化学测量装置。上述仪表通常包括(a)用于向已将所述样品引入到其中的电化学槽施加电势的装置；(b)用于在所述槽中测量槽电流的装置。在美国专利文献5,723,284；5,834,224；5,942,102；5,972,199；5,997,817；6,083,710；6,121,009；6,134,461以及6,193,873中公开了代表性电化学仪表或装置，在此参考引用其所公开的内容；其它专利文献WO99/49307；WO97/18465；WO01/57510；WO01/57238；WO02/48707；WO02/50609；EP0969097A2以及GB2304628中也公开了代表性电化学仪表或装置。
以说明而非限制的方式提供下述实施例。
试验实施例1--涂覆有野生型或变异形式s-GDH的常规测试带的表现为了发展一种用于筛选具有不同的糖特异性的变异形式s-GDH的试验，首先以一种常规的涂覆酶的葡萄糖测试带形式测试野生型或变异形式的s-GDH对还原糖的响应。所述筛选试验理想地模拟使用常规酶涂覆的带、用掺有还原糖的全血或血浆测试时显示的响应。所述被测的变异形式的s-GDH含有一个氨基酸突变，分别为Asn452Thr和Asp167Glu。通过一种基于网状的方法(web-based)来制备所述测试带，在所述方法中，用缓冲试剂溶液缝隙涂覆(slot coating)所述工作电极(金)，所述溶液含有大约50-500Ku/ml的野生型或变异s-GDH，与GDH的摩尔比率为2∶1的PQQ，2mMCaCl2，750mM铁氰化物，67mM pH为6.8的柠康酸盐，0.1％Pluronics以及75mM蔗糖。调节试剂溶液中野生型或变异s-GDH的浓度，从而使得可使用大约13活性单位/电化学槽，因此，所述试剂溶液的活性单位/ml依赖于所使用酶的活性单位/克而改变。每一种酶的活性基于一种分光光度法试验，所述试验在pH为6.8的50mMPIPES(吩嗪，N，N’-二-(2-乙基磺酸))缓冲液中，使用DCIP(2，6-二氯靛酚(dichlorophenolindophenol))和PES(吩嗪乙基硫酸酯)。在所述试验中，监控600nmDCIP吸光率的变化，并将吸光率的下降速度认为是所述酶的反应速度。将在1分钟内使1mmolDCIP还原的酶活性定义为1个单位。在pH为6.8时，DCIP的摩尔吸光系数为17.4mM-1。将COBAS FARA II离心分析器用于所述分光光度法试验。
如在欧洲专利申请No.EP1324038中公开的一样，使用一种红外能源来干燥工作电极上的试剂，在此充分参考引用其所公开的内容。通过用干燥试剂将所述工作电极粘附在一金对(counter)电极上，从而形成电化学槽(或测试带)，所述对电极含有干燥的MESA以抑制对电极上的污垢。
在具有大约80mg/dL内生葡萄糖的(或者4.4mM)全血中掺入高治疗水平(大约60mg/dL或4mM)或高治疗水平三倍(大约180mg/dL或12mM)的干扰糖木糖。将所述搀杂样品投配到上述测试带上，并通过计时安培分析法测定葡萄糖的浓度，在所述方法中，施加-0.3V的电位达10秒钟，接着施加+0.3V的电位达5秒钟。如在图4中所示，计算每一种酶与不含木糖的对照样品的绝对偏差，并将之表示为木糖浓度的函数。绝对偏差和木糖干扰糖之间线性相关，所述木糖用于野生型s-GDH和Asn452Thr变异体，这表明野生型s-GDH和Asn452Thr变异体既可识别木糖也可识别葡萄糖。但是，Asp167Glu变异体对木糖的反应降低。两种变异形式都显示绝对偏差和半乳糖或麦芽糖(数据未显示)之间线性相关。这表明这些碳水化合物同葡萄糖一样可被识别。因此，一种用于筛选s-GDH变异形式的试验应当给出与在图4中获得的结果相似的结果，因为只有Asp167Glu应表现出对木糖的反应下降。
在图4中显示的结果不包括糖的浓度在整个生理学相关范围(即高达720mg/dL或40mM)的测试，因此进行了更多常规测试带的测试以扩展糖的浓度范围，所述带涂覆有野生型s-GDH。用最多40mM的五种还原糖中的每一种搀杂具有大约80mg/dL(或4.4mM)内生葡萄糖的血浆，所述还原糖为葡萄糖、麦芽糖、木糖、半乳糖以及乳糖。将所述搀杂样品投配到上述测试带上，并通过上述计时安培分析法测定葡萄糖的浓度。如图5所示，将测得的电流响应作为糖浓度的函数制图。如图4所示，小于大约10mM时，野生型s-GDH同五种测试还原糖中的每一种都一样反应。但是，当用上述DCIP/PES分光光度试验进行测试时，在相同糖浓度范围内，s-GDH同木糖和半乳糖的反应性很低(结果未示出)，这表明不能将分光光度试验用于模拟酶对干扰糖的响应，所述干扰糖用于常规涂覆酶的测试带。如前所述，分光光度试验使用酶限制性条件，而常规涂覆酶的测试带过量使用酶，因此，这解释了在每一种试验形式中糖响应的不同。
实施例2--野生型s-GDH对还原糖响应的测试，在所述方法中，使用根据本发明的电化学槽使用电化学槽(即测试带)测量野生型s-GDH对还原糖的响应，通过一种基于网状的方法制造所述电化学槽，在所述方法中，用一种缓冲试剂溶液缝隙涂覆所述工作电极(金)，所述溶液含有750mM铁氰化物，67mM pH为6.8的柠康酸盐，0.1％的Pluronics以及75mM蔗糖。如在实施例1中，使用一种红外能源来干燥工作电极上的试剂。通过用干燥试剂将所述工作电极粘附在一金对电极上，从而形成电化学槽，所述对电极含有干燥的MESA以抑制对电极上的污垢。
将pH为6.8的67mM柠康酸盐中的野生型s-GDH和同生理学相关浓度(最高40mM或720mg/dL)的下述糖中的一种混合，所述柠康酸盐中PQQ与GDH的摩尔比率为2∶1，还含有2mM CaCl2，所述糖为葡萄糖、木糖、半乳糖、麦芽糖或乳糖。调节每一种溶液中野生型s-GDH的浓度，从而使得使用大约13活性单位/电化学槽。将每一种含酶/糖的溶液投配到电化学槽上，所述槽含有干燥的铁氰化物、柠康酸盐、Pluronics以及蔗糖，但不含酶(参见上述浓度)。测量电流响应，并如图6所示，将三次测量的平均值作为糖浓度的函数制图。在木糖浓度低于10mM时，所述结果与在实施例1中由涂覆有s-GDH的带获得的结果(参见图4)相似，因为所述酶可同葡萄糖和木糖一样反应。而且，利用所有这些还原糖，可获得与图5中获得的结果相似的结果。因此，该试验模拟了用常规的涂覆野生型酶的测试带获得的响应，具有下述优点(1)涂覆酶的测试带不必用酶的每一种形式制备，从而节省了时间和资源(设备和技术人员)，并且使用很少的酶；以及(2)可将基于缓冲液的样品替代有生物危险性的全血或掺糖血浆，所述样品含有变化浓度的还原糖。
实施例3--Asn452Thr(s-GDH的变异形式)对还原糖响应的测试，在所述方法中，使用根据本发明的电化学槽使用与上述实施例2相同的一批电化学槽(即槽含有干燥铁氰化物、柠康酸盐、Pluronics以及蔗糖，但不含酶)来测量Asn452Thr对还原糖的响应。将Asn452Thr同生理相关浓度(最高大约40mM或720mg/dL)的下述糖中的一种混合，所述糖为葡萄糖、麦芽糖、木糖、半乳糖以及乳糖。调节每一种溶液中Asn452Thr的浓度，从而使得使用大约13活性单位/电化学槽。将每一种含酶/糖的溶液投配到电化学槽上，所述槽含有干燥的铁氰化物、柠康酸盐、Pluronics以及蔗糖，但不含酶。测量电流响应，并如图7所示，将之作为糖浓度的函数制图。所获得的结果与在实施例1中在木糖低于10mM(即大约高治疗水平的三倍)时用涂覆有Asn452Thr的带获得的结果(参见图4)相似，因为同野生型酶一样，Asn452Thr可同葡萄糖和木糖一样反应。所述数据还显示，在糖浓度低于10mM时，s-GDH的变异形式同所有试验糖一样反应。因此，所述试验模拟了用涂覆有Asn452Thr的带获得的结果，且具有上述优点。
实施例4--Asp167Glu(s-GDH的另一种变异形式)对还原糖响应的测试，在所述方法中，使用根据本发明的电化学槽如上述实施例3所述来测量Asp167Glu对还原糖的响应。将Asp167Glu同生理相关浓度(最高大约40mM或720mg/dL)的下述糖中的一种混合，所述糖为葡萄糖、麦芽糖、木糖、半乳糖以及乳糖，并将之投配到电化学槽上，所述槽含有干燥的铁氰化物、柠康酸盐、Pluronics以及蔗糖，但不含酶。如图8所示，测量电流响应并将之作为糖浓度的函数制图。在木糖浓度低于10mM(即大约高治疗水平的三倍)时，所述结果与在实施例1中，用涂覆有Asp167Glu的带获得的结果(参见图4)相似，因为s-GDH的这种变异形式对木糖显示了降低的响应。这种变异体还可同所有其它试验的还原糖一样反应。因此，所述试验再次有利地、但以很快且易于使用的形式模拟了用涂覆有Asp167Glu的带获得的结果。
上述实施例说明可将所述方法可用于模拟涂覆有酶的带的性能，并且可将之用于筛选s-GDH的变异形式对糖的响应。
下述实施例说明了如何使用所述方法来测量酶的活性。
实施例5--用于电化学槽的标准曲线，根据本发明的方法，用野生型s-GDH投配所述槽通过用增加浓度的野生型s-GDH投配电化学槽来产生野生型s-GDH的标准曲线(参见图9)，所述电化学槽含有干燥的铁氰化物、柠康酸盐、Pluronics以及蔗糖，但不含酶(参见上述浓度)，所述野生型s-GDH的浓度为大约0-10mg/mL。将葡萄糖的浓度维持在450mg/dL。本领域技术人员将认识到还可构造用于任何s-GDH变异形式的标准曲线。
由图9中的标准曲线构造一种双倒数曲线图(即1/响应作为1/酶浓度的函数)，并在图10中显示所述曲线图。在电化学槽响应和野生型s-GDH的量之间存在强线性相关(r2＝0.9986)。通过测量电流响应和从标准曲线读取浓度，可很容易地检测该批测试酶的浓度。
在一种电化学形式中，用于s-GDH的标准曲线的产生有利地用于测量输入的酶的活性，用于测量涂覆在干燥带上的酶的稳定性，以及用于解决潜在带涂覆问题，所述输入的酶用于制备常规测试带，所述问题与酶的活性有关。
上述结果和讨论说明本发明提供了便利且经济合算的、用于表征氧化还原剂系统酶的方式。本发明的优点包括成本低和不使用血或血制品进行测试的能力。因此，本发明为本领域带来了重大的贡献。
如同明确、单独地表明参考引用每一个出版物或专利一样，在此参考引用说明书中引用的所有出版物和专利。对任一出版物的引用都是由于其公开于申请日之前，因此，不应将其理解为由于在前发明，本发明就不能先于这些公开出版物。
尽管为了清楚地理解，通过说明图表和实施例的方式详细说明前述发明，但对本领域技术人员而言，根据本发明的教导，不违背所附权利要求的实质和范围，显然可以进行一些变化和改造。
权利要求
1.一种方法，包括(a)将样品施加到电化学槽中，所述样品包括第一氧化还原剂系统酶和已知量的酶底物，所述电化学槽包括无酶试剂组合物，所述组合物包括所述氧化还原剂系统的介质；以及(b)检测由所述槽产生的电信号。
2.根据权利要求1的方法，其中所述酶为氧化酶。
3.根据权利要求2的方法，其中所述氧化酶选自氧化酶和脱氢酶。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述样品还包括一种酶辅因子。
5.根据权利要求1、2、3或4的方法，其中所述方法还包括使用所述检测到的电信号来测定所述第一氧化还原剂系统酶的分析物特异性。
6.根据权利要求5的方法，其中所述方法包括检测电信号，所述电信号至少由下述样品产生(i)一种样品，其含有第一氧化还原剂系统酶以及已知的第一浓度的第一酶底物；(ii)一种样品，其含有所述第一氧化还原剂系统酶以及已知的第一浓度的第二酶底物；(iii)一种样品，其含有第二氧化还原剂系统酶以及所述已知的第一浓度的所述第一酶底物；以及(iv)一种样品，其含有所述第二氧化还原剂系统酶以及所述已知的第一浓度的所述第二酶底物。
7.根据权利要求6的方法，其中所述方法还包括检测电信号，所述电信号由下述样品产生(i)一种样品，其含有所述第一氧化还原剂系统酶以及已知的第二浓度的所述第一酶底物；(ii)一种样品，其含有所述第一氧化还原剂系统酶以及已知的第二浓度的所述第二酶底物；(iii)一种样品，其含有所述第二氧化还原剂系统酶以及所述已知的第二浓度的所述第一酶底物；以及(iv)一种样品，其含有所述第二氧化还原剂系统酶以及所述已知的第二浓度的所述第二酶底物。
8.根据权利要求7的方法，其中所测得的所述第一氧化还原剂系统酶的所述分析物特异性是相对于所述第二氧化还原剂系统酶而言的。
9.根据权利要求8的方法，其中所述第一氧化还原剂系统酶为非天然的氧化还原剂系统酶。
10.根据权利要求8的方法，其中所述第二氧化还原剂系统酶为天然的氧化还原剂系统酶。
11.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括使用所述检测到的电信号来测定所述样品中所述酶的活性。
12.一种电化学槽，包括无酶试剂组合物，所述组合物包括氧化还原剂系统介质。
13.一种系统，包括(a)电化学槽，其包括无酶试剂组合物，所述组合物包括氧化还原剂系统介质；以及(b)流体培养基，其包括氧化还原剂系统酶以及已知量的酶底物。
全文摘要
本发明提供了用于表征氧化还原剂系统酶的方法和组合物。在实施上述方法的过程中，将包括氧化还原剂系统酶和已知量底物的样品施加到一电化学槽中，所述电化学槽包括无酶试剂组合物，所述组合物具有氧化还原剂系统介质。还提供了电化学测试带、包括所述带的系统以及成套部件，所述带包括所述电化学槽。本发明用在多种不同的应用中，所述应用包括氧化还原剂系统的表征应用。
文档编号C12Q1/26GK1725006SQ20051008106
公开日2006年1月25日 申请日期2005年6月29日 优先权日2004年6月30日
发明者P·拜尔德, S·钱, T·P·哈茨 申请人:生命扫描有限公司