专利名称：一个用于防治作物病害的编码类光敏色素蛋白的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病害防治领域，更具体地，本发明涉及一个用于防治作物病害的编码类光敏色素蛋白的基因。本发明还涉及该基因在植物病害防治中的应用以及作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
背景技术：
植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因子之一。随着病原菌对药物抗性的增强，农药用量在不断增加，这不仅加剧了环境污染、药物残留，也大大提高了农业成本，因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害药物。弄清植物病原菌侵染寄主的遗传机制是开发新型药物和防病策略的关键。
甘蓝黑腐病黄单胞菌，也称为甘蓝黑腐病黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris，简称Xcc)，是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌(Qian，2005)。该菌能在寄主的任何生长期通过水孔、气孔或伤口侵入植物体内，引起病害，寄主包括甘蓝、花椰菜、大白菜、萝卜、油菜等。典型的黑腐病症状是在叶缘上形成V字形病斑，随着病斑的扩大，叶脉变黑，因而被称为黑腐病。黑腐病被认为是对十字花科植物危害最为严重的病害，尤其在热带和亚热带地区，温度和湿度都适宜于该菌的生长繁殖，因此发病更加严重(Alvarez，1987)。由于遗传稳定性和遗传可操作性，甘蓝黑腐病黄单胞菌一直被用作研究微生物与植物相互作用分子机理的模式细菌。因此，鉴定与黄单胞菌致病相关的新基因，对防治植物病害具有显著的意义。
植物发育生物学是当代植物科学研究的重点之一，而光控发育(photomorphogenesis，光形态建成)又是植物发育生物学研究中最为活跃的领域之一。光敏素的发现是20世纪植物学科的一大成就。植物中光控发育的主要光受体是光敏色素(phytochrome)。感受到光后，光敏色素发生构象变化，转移入核与一系列的转录因子相互作用激活下游的靶基因产生光形态建成表型，影响细胞或发育过程。光敏色素街道光信号传导，控制植物一系列基因的表达(Sineshchekov，2004；Nagy，2002)。
发明内容
本发明鉴定了甘蓝黑腐病黄单胞菌类光敏色素蛋白基因XC4241与致病相关，提供可能的防治植物病害的药物靶标。
因此，本发明的一个目的是提供一种编码类光敏色素蛋白的基因(XC4241基因)，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
在一个实施方案中，所述的基因具有SEQ ID No.1所示的DNA序列，5’端的第301-2202位核苷酸为开放阅读框。
本发明还涉及含有上述基因的表达载体。优选为pCXC4241。
本发明另一个目的是提供上述基因在植物病害防治中的应用。
在本发明的一个实施方案中，所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)所导致的甘蓝黑腐病。
本发明还有一个目的是提供所述的基因作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。在一个实施方案中，所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌所导致的甘蓝黑腐病。
SEQ ID No.1所示的DNA是甘蓝黑腐病黄单胞菌8004菌株的DNA，由1905个碱基组成。含完整的类光敏色素蛋白基因，自5’端的第301-2202位核苷酸为该基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第301-303位核苷酸为该基因的起始密码子TTG，自5’端的第2203-2205位核苷酸为终止密码子TAA。
SEQ ID No.2所示的蛋白质是类光敏色素蛋白基因编码的类光敏色素蛋白产物，由634个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为70355.49道尔顿，等电点为5.56。
含有本发明开放阅读框及其部分序列的表达载体均属于本发明的保护范围。
图1为XC4241基因的克隆酶切电泳图谱。1100bp标准DNA(片段大小从大到小依次为3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)；2XC4241基因片段；3λ/HindIII2标准DNA(片段大小从大到小依次为23.1kb，9.4kb，6.6kb，2.4kb，2.0kb)。
图2为XC4241基因插入突变体064H01的PCR验证凝胶图。1100bp标准DNA；2XC4241基因插入突变体064H01。
图3为XC4241基因插入突变体064H01的致病性试验。
A为甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型菌株8004；B为XC4241基因插入突变体064H01；C为水(空白对照)。
具体实施例方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例在本发明的实施例中所用到的材料包括甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型菌株8004，购于英国植物病原细菌国家保藏中心(The National Collectionof Plant Pathogenic Bacteria，NCPPB)，保藏号为NCPPB No.1145；大肠杆菌(Escherichia coli)株系JM109、载体pGEM-3Zf(+)购自Promega公司，pLAFR3、pLAFRJ为本研究室保存的柯斯质粒(Staskawicz et al，1987)；限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Stratagene、QIAGEN公司。
实施例1 甘蓝黑腐病黄单胞菌突变体库的构建以大肠杆菌和Xcc之间的穿梭质粒pLAFR1为载体将Tn5gusA5(Sharma，1991)引入Xcc野生型菌株8004，然后通过引入不相容质粒pPH1JI(Tang et al，2005)驱赶pLAFR1，通过抗生素(卡那霉素)抗性标记筛选Xcc::Tn5gusA5插入突变体，结合Xcc全基因组序列(基因组序列号NC 007086)和TAIL-PCR(Thermal Asymetric Interlaced-PCR)技术(Yao-Guang Liu，1995)，确定Tn5gusA5在基因组上的插入位置，并对插入位置进行PCR验证。通过考察突变体的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的变化，筛选致病相关基因(Tang et al，2005)，本发明涉及其中一个新的致病相关基因-XC4241基因(类光敏色素蛋白基因)，其插入突变体编号为064H01，筛选过程见参考文献(Tang et al，2005)。
实施例2 XC4241基因(类光敏色素蛋白基因)的克隆及序列测定根据XC4241的基因序列(见序列表，第1位到第2305位碱基)，设计引物(上游引物GGGAATTC CGATGCCGCCGTGCCGCCGCCG和下游引物GGTCTAGA GTCATGCCGATCCCGAGCACCG；PCR条件95℃3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃2.5min，30个循环；72℃5min)，以甘蓝黑腐病黄单胞菌8004菌株总DNA为模板，用PCR法扩增该基因全长序列，并将其克隆至克隆载体pGEM3Zf(+)中，用双脱氧核苷酸法在ABI377 DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列(SEQ ID No.1)。将测序验证正确的XC4241基因序列克隆至穿梭载体pLAFRJ中，获得了含该基因的重组质粒pCXC4241。该质粒用EcoRI、XbaI酶切，除了一个22kb的载体条带外，还有一个2.3kb的外源片段(见图1)。
实施例 3XC4241基因插入突变体064H01的验证对插入突变体064H01进行TAIL-PCR测序定位，发现其插在XC4241基因内。用转座子Tn5上IS50R侧的一条引物(CCGCCGAAGAGAACACAGATTTA)和上游基因XC4242(GenBank登录号YP_245300)的一条引物(5’-CCACATCGACGCCGATACCTACG-3’)配对进行PCR验证(95℃3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，30个循环；72℃5min)，产物预期大小676bp(见图2)。
实施例 4XC4241基因插入突变体064H01的致病性检测实验所用寄主植物为萝卜苗(种名为Raphanus sativus L.var.radiculusPers.)，所用的接种方法为剪叶法。XC4241基因插入突变体和野生型菌株在28℃下进行液体培养，培养基NYG(每升溶液含5g蛋白胨，3g酵母膏和20g甘油，根据三组分缩写为NYG，pH7.0)，15-18个小时。用NYG稀释到OD600＝0.001，用灭过菌的剪刀在菌液浸泡5秒钟后，在健康叶片距叶尖1-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5秒钟，被接种的植物在25-30℃培养一周后观察结果，正对照选用甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型8004菌株，负对照用清水。致病试验表明，XC4241基因的插入突变体的致病性显著降低(见图3)。
从本实施例可以看出，本发明要求保护的基因的失活直接导致甘蓝黑腐病黄单胞菌致病力的下降。因此，本发明要求保护的基因可以用于植物病害防治，特别是由甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)所导致的甘蓝黑腐病。另外，本发明要求保护的基因可以作为开发用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以根据本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是甘蓝黑腐病的药物。
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序列表<110>广西大学<120>一个用于防治作物病害的编码类光敏色素蛋白的基因<130>IB055878<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2305<212>DNA<213>Xanthomonas campestris pv.campestris<400>1cgatgccgcc gtgccgccgc cggccagcag cgaggcggcg cgctggggca tgctgtatgt60catcgaaggc tctcagctgg gtggccgggt gattgcacgc atgctgcgca aacgtcagcc120gggcctggcg catgcattgc actatttcga gctggccgac gaagacccgg ccggctggcg180gcgctttcag gcggtgctcg agcaacgcct gcagagcgca gcggcgcgtg ccgacgccat240cgccggcgcg caggccatgt ttgcccattt ccacacctgc ctggcagcgg aggcacgtcc300ttgagcactg caaccaaccc gttggacctg gacgtctgcg cgcgcgaacc catccatatt360cccgggctga tccagcccta cggcgtgttg ctggtgatcg accccgccga cggccgcatc420gtgcaggcca gcaccaccgc cgccgatctg ctcggcgtgc caatggccgc actgcttggc480atgccctaca cccaggtgct gacgctgccc gaagcacagc cgttcgccgt cgatgaccag540ccacagcacc tgatgcatgc cgaggtgcgg ttcccgcaac gcgccacgcc gccagccagc600gcctgggtgg cggcctggca tctgtatccg cagcagtggc tggtggaaat ggagccgcgc660gatgcgcgcc tgctcgatgt caccctgcgc gaggcgatgc cgctgctgcg cagtgtcgaa720cgcgatccgg gcatcgccga ggcagcggtg cgcgtggcca agggcctgcg tagcctgatc780ggcttcgacc gcgtgatgat ctaccgcttc gatgaggagt ggaacggcga catcatcgcc840gaggcgcgca agccggagct ggaggcctat ctcggcctgc attaccccgc cagcgacatc900ccggcgcagg cgcgcgcgct gtacctgcgc aaccgggtcc gccagattgc cgatgtcggc960taccagccgt cgccgatcca gcccaccgtg catccgcagt tgggcacgcc ggtggatttg1020
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Pro Ile His Ile Pro Gly Leu Ile Gln Pro Tyr Gly Val Leu Leu Val20 25 30Ile Asp Pro Ala Asp Gly Arg Ile Val Gln Ala Ser Thr Thr Ala Ala35 40 45Asp Leu Leu Gly Val Pro Met Ala Ala Leu Leu Gly Met Pro Tyr Thr50 55 60Gln Val Leu Thr Leu Pro Glu Ala Gln Pro Phe Ala Val Asp Asp Gln65 70 75 80Pro Gln His Leu Met His Ala Glu Val Arg Phe Pro Gln Arg Ala Thr85 90 95Pro Pro Ala Ser Ala Trp Val Ala Ala Trp His Leu Tyr Pro Gln Gln100 105 110Trp Leu Val Glu Met Glu Pro Arg Asp Ala Arg Leu Leu Asp Val Thr115 120 125Leu Arg Glu Ala Met Pro Leu Leu Arg Ser Val Glu Arg Asp Pro Gly130 135 140Ile Ala Glu Ala Ala Val Arg Val Ala Lys Gly Leu Arg Ser Leu Ile145 150 155 160Gly Phe Asp Arg Val Met Ile Tyr Arg Phe Asp Glu Glu Trp Asn Gly165 170 175Asp Ile Ile Ala Glu Ala Arg Lys Pro Glu Leu Glu Ala Tyr Leu Gly180 185 190Leu His Tyr Pro Ala Ser Asp Ile Pro Ala Gln Ala Arg Ala Leu Tyr195 200 205Leu Arg Asn Arg Val Arg Gln Ile Ala Asp Val Gly Tyr Gln Pro Ser210 215 220Pro Ile Gln Pro Thr Val His Pro Gln Leu Gly Thr Pro Val Asp Leu225 230 235 240Ser Asp Val Ser Leu Arg Ser Val Ser Pro Val His Leu Glu Tyr Leu245 250 255
Ala Asn Met Gly Val Thr Ala Thr Leu Val Ala Ser Ile Val Val Asn260 265 270Asp Ala Leu Trp Gly Leu Ile Ser Cys His His Tyr Ser Pro His Phe275 280 285Thr Asn His Ala Met Arg Asp Val Thr Asp Ala Val Ala Arg Thr Leu290 295 300Ala Gly Arg Ile Gly Ala Leu Gln Ala Val Ala Arg Ala Arg Leu Glu305 310 315 320Ser Val Leu Leu Thr Val Arg Glu Lys Leu Ile Thr Asp Phe Asn Asp325 330 335Ala Glu His Met Thr Val Glu Leu Leu Asp Asp Met Ala Pro Asp Leu340 345 350Met Asp Val Val Asp Ala Asp Gly Val Ala Ile Phe His Gly Asn Asp355 360 365Ile Ser Arg His Gly Thr Thr Pro Asp Val Ala Ala Leu Arg Arg Ile370 375 380Arg Asp His Ile Glu Ser Glu His His Glu Ala Leu Arg Glu Asp Ala385 390 395 400Val Gly Ala Leu His Val Asp Ala Ile Gly Glu Val Phe Pro Glu Leu405 410 415Ala Asp Leu Ala Pro Leu Ala Ala Gly Phe Ile Phe Val Pro Leu Met420 425 430Pro Gln Ser Arg Ser Ala Leu Leu Trp Thr Arg Arg Glu Gln Ile Gln435 440 445Gln Ile Lys Trp Ala Gly Asn Pro Gln Leu Ala Lys Leu Glu Asp Ile450 455 460Pro Asn Ser Arg Leu Ser Pro Arg Lys Ser Phe Asp Leu Trp Gln Gln465 470 475 480Thr Val Arg Gly Arg Ala Arg Arg Trp Ser Pro Leu His Leu Glu Ser485 490 495
Ala Arg Ser Leu Arg Val Leu Ile Glu Leu Met Glu Arg Lys Arg Phe500 505 510Gln Gln Asp Phe Thr Leu Leu Glu Ala Ser Leu Ser Arg Leu Arg Asp515 520 525Gly Val Ala Ile Ile Glu Arg Gly Thr Ala Asn Ala Ala His Arg Leu530 535 540Leu Phe Val Asn Thr Ala Phe Ala Asp Val Cys Gly Ser Asp Val Ala545 550 555 560Glu Leu Ile Gly Arg Glu Leu Gln Thr Leu Tyr Ala Ser Asp Ala Pro565 570 575Arg Ala Asn Val Glu Leu Leu Gln Asp Ala Leu Arg Asn Gly Arg Ala580 585 590Ala Tyr Val Thr Leu Pro Leu Gln Val Ser Asp Gly Ala Pro Val Tyr595 600 605Arg Gln Phe His Leu Glu Pro Leu Pro Ser Pro Ser Gly Val Thr Ala610 615 620His Trp Leu Leu Gln Leu Arg Asp Pro Glu625 630
权利要求
1.一种编码类光敏色素蛋白的基因，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于它具有SEQ ID No.1所示的DNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于自5’端的第301-2202位核苷酸为开放阅读框。
4.含有根据权利要求1或2所述的基因的表达载体。
5.根据权利要求4的表达载体，其为pCXC4241。
6.权利要求1或2所述的基因在植物病害防治中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)所导致的甘蓝黑腐病。
8.权利要求1或2所述的基因作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述植物病害是由甘蓝黑腐病黄单胞菌所导致的甘蓝黑腐病。
全文摘要
本发明公开了来自甘蓝黑腐病黄单胞菌中的一个与致病相关的基因(类光敏色素蛋白基因)。本发明所提供的类光敏色素蛋白基因，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。本发明还涉及该基因在植物病害防治中的应用以及作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
文档编号C12N15/63GK1952147SQ20051008665
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者姜伯乐, 唐纪良, 何勇强, 唐东阶, 姜伟, 韦红玉, 臧宁, 韦珂, 张穗生 申请人:广西大学