专利名称：一种利用可燃性气体传感器发酵培养食酸戴尔福特菌的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是提供了一种利用可燃性气体传感器发酵培养食酸戴尔福特菌的方法。对于筛选出的1株能够降解微囊藻毒素(Microcystins，简称MCs)的食酸戴尔福特菌Delftia acidovorans USTB02(CGMCC No.1447，保藏日期2005年8月25日，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，通过可燃性气体传感器使发酵罐培养基中乙醇浓度恒定控制在0.1～10.0g/L范围内的任何一个浓度的方法进行发酵培养，可以获得高细胞浓度的食酸戴尔福特菌USTB02液。将发酵培养的菌液或提取的酶作为一种生物催化剂，可以用于MCs的高效去除。
食酸戴尔福特菌USTB02降解MCs的活性不需要采用MCs进行诱导培养，生长于其它含碳、含氮有机物的食酸戴尔福特菌USTB02同样可以保持降解MCs的能力，因此如何高效培养出食酸戴尔福特菌USTB02至关重要。
背景技术：
蓝藻水华污染所带来的主要危害是在有毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类型的藻毒素，其中MCs是一类在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。研究结果显示，MCs的主要靶器官是肝脏，能够促发肝脏肿瘤的发生。
虽然微生物降解是去除MCs的一种非常有前途的方法，但MCs的环状结构和间隔双键具有相当的稳定性，一般的多肽分解酶不能对MCs进行分解，只有一些特殊的微生物菌种才具备对MCs的降解能力，这也是MCs在天然水体中能够存在很长时间的一个重要原因。在纯菌种降解去除MCs方面，国外学者发现从天然水体中分离出的铜绿假单胞菌和鞘氨醇单胞菌对MC-LR和RR这2种类型的MCs有降解能力，其中鞘氨醇单胞菌对MC-RR和LR的降解速率分别达到每天13.0和5.4mg/L，这是目前国外报道的最大的MCs生物降解速率。国内学者闫海从云南滇池底泥中分离出了一株日平均降解MC-RR和MC-LR的速率达到16.7和9.4mg/L的微生物纯菌种Ralstoniasolanacearum，并研究了此菌种对MC-RR和LR的降解途径，发现至少有两种酶参与了MC-RR和LR的催化降解过程。
更进一步研究显示，我们从天然水体中筛选出的食酸戴尔福特菌USTB02对MCs具备更强的降解能力，它能在2天内将初始浓度分别为90.2mg/L和39.6mg/L的MC-RR和LR全部降解，日均降解速率分别达到45.1mg/L和19.8mg/L。进一步研究显示食酸戴尔福特菌酶对MCs仍然具有催化降解能力，且降解速率更迅速，能在7小时内分别将30mg/L的MC-RR和30mg/L的MC-LR完全降解。食酸戴尔福特菌是目前发现的除鞘氨醇单胞菌属、铜绿假单胞菌属和Ralstonia solanacearum菌外能够降解MCs的又一新菌种，国内外均未见有此菌种降解MCs的文献报道。因此如何高效培养出超高细胞浓度的食酸戴尔福特菌USTB02在解决水体中MCs的去除问题方面具有非常重要的意义和价值。
发明内容
本发明目的是提供一种利用可燃性气体传感器发酵培养食酸戴尔福特菌USTB02的方法，培养出超高细胞浓度食酸戴尔福特菌USTB02作为一种能够高效去除MCs的生物催化剂。
本发明在成功筛选出1株能够高效降解MCs的微生物纯菌种食酸戴尔福特菌USTB02 Delftia acidovorans USTB02(CGMCC No.1447，保藏日期2005年8月25日)的基础上，在发酵培养过程中应用乙醇作为食酸戴尔福特菌USTB02生长的唯一碳源，并且采用可燃性气体传感器对发酵罐培养基中的乙醇浓度进行恒定控制，能够培养出超高细胞浓度的食酸戴尔福特菌USTB02。
1、微生物培养基培养基组成如下(1000mL去离子水中)MgSO4·7H2O 0.05～0.5g，KH2PO40.25～0.5g，K2HPO42.0～5.0g，NaCl 0.5～2.5g，CaCl2 5.0～10.0mg，FeSO40.5～2.5mg，ZnCl20.5～2.5mg，MnCl2·4H2O 0.5～2.5mg，CuCl20.05～0.25mg，酵母粉5.0～20.0g为基础培养基，另外在发酵罐中的基础培养基经120～130℃高温和0.10～0.15MPa高压蒸汽灭菌15～20分钟。接种食酸戴尔福特菌USTB02后，在整个发酵培养过程中通过可燃性气体传感器自动流加乙醇并保持培养基中的乙醇浓度在0.1～20.0g/L范围。
2、食酸戴尔福特菌USTB02发酵培养接种1～50mL食酸戴尔福特菌USTB02液于5升发酵罐内的0.5～2L微生物液体培养基中进行发酵培养。培养条件温度25～35℃，培养基中溶解氧40％～80％饱和溶解氧，通过流加NaOH溶液保持培养基的pH在6.0～8.0范围。在乙醇作为微生物唯一碳源时，利用可燃性气体传感器全自动流加乙醇并始终保持乙醇在培养基中的浓度为0.1～20.0g/L。
3、发酵罐培养基中乙醇浓度的控制方法因为乙醇是挥发性化合物，在发酵培养通气过程中，发酵罐流出气体中乙醇浓度的减少将引起传感器气敏元件的电阻增加，从而导致与传感器气敏元件串联的电阻两端的输出电压减小，当输出电压减小到设定值1.40～1.70V时，继电器通过控制电源插座开关打开蠕动泵向发酵罐内流加乙醇。随着发酵罐培养基中乙醇浓度的增加，发酵罐流出气体中乙醇浓度也增加，这又使传感器气敏元件的电阻减少，又导致与传感器气敏元件串联的电阻两端输出电压的增大，当输出电压增大到设定值1.40～1.70V时，继电器自动关闭流加乙醇的蠕动泵。采用此控制方法可成功地保持发酵罐培养基中乙醇浓度的恒定控制在0.1～20.0g/L范围内的任何一个浓度。
本发明的优点在于尽管乙醇是支持食酸戴尔福特菌USTB02生长的最好碳源之一，但是由于乙醇既易溶于水也易溶于有机溶剂，如果培养基中的乙醇浓度超过1.0％(体积/体积)将导致食酸戴尔福特菌USTB02的生长速度下降。因此用可燃性气体传感器通过继电器开关控制蠕动泵，自动流加乙醇作为食酸戴尔福特菌USTB02生长的唯一碳源，并始终保持在发酵罐培养基中的乙醇在0.1～20.0g/L之间的任何一个恒定浓度非常重要。采用此种控制方法，不仅可以保证食酸戴尔福特菌USTB02生长的碳源供给，而且可以对培养基中的乙醇浓度进行在线监测与控制。
在培养基中控制乙醇浓度恒定的原理是在一定浓度范围内，发酵罐培养基中的乙醇浓度与从发酵罐中流出空气中乙醇浓度之间存在线性关系。发酵罐流出气体中乙醇浓度的减少将引起传感器气敏元件的电阻增加，这样就使与气敏元件串联的电阻两端的输出电压减少，当串联电阻输出电压减小到某一设定值时，继电器通过控制插座开关打开蠕动泵向发酵罐内流加乙醇。随着发酵罐培养基中乙醇浓度的增加，发酵罐流出气体中乙醇浓度也增加，这又使传感器气敏元件的电阻减少，又导致与气敏元件串联电阻输出电压的增大，当输出电压增大到同一设定值时，继电器自动关闭流加乙醇的蠕动泵。采用这样的方法可成功地保持发酵罐培养基中乙醇浓度的恒定。可燃性气体传感器经调试后可准确控制培养基中的乙醇恒定保持在0.1～20.0g/L范围内任何一个浓度。采用上述方法进行流加乙醇的控制，可以保持食酸戴尔福特菌USTB02的快速生长，并最终获得非常高的细胞浓度。
图1为可燃性气体传感器一微生物发酵罐控制系统示意图。主要由发酵罐、可燃性气体传感器、继电器和流加泵所组成。
图2为本发明传感器接线图，显示继电器气敏元件电阻跟输出电压的关系。传感器外加电压DC9V，串接电阻51欧。当传感器气敏元件电阻增大时，与之串接电阻两端的输出电压随之减小；反之，当传感器气敏元件电阻减小时，则串接电阻两端的输出电压随之增大。
具体实施例方式
1、食酸戴尔福特菌USTB02培养基培养基组成如下(1000mL去离子水中)MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO40.5g，K2HPO45.0g，NaCl 1.5g，CaCl210.0mg，FeSO42.5mg，ZnCl22.5mg，MnCl2·4H2O 2.5mg，CuCl20.1mg，酵母粉10.0g为基础培养基。在5升微生物发酵培养罐中配制2.0L基础培养基，经125℃高温和0.12MPa高压蒸汽灭菌20分钟后，开始通空气冷却，空气流量为2.0升/分钟，待培养基温度冷却至30℃后，接种20mL的食酸戴尔福特菌USTB02液开始进行发酵培养，开始搅拌转速为200转/分钟，培养1天以后逐渐增大到500转/分钟。培养条件是温度30℃，培养基中溶解氧大于50％饱和溶解氧，pH 7.0。
2、食酸戴尔福特菌USTB02的发酵培养接种20mL食酸戴尔福特菌USTB02液于5升发酵罐内的1L微生物液体培养基中进行发酵培养。培养条件温度30℃，培养基中溶解氧60％饱和溶解氧，通过流加NaOH溶液保持培养基的pH在7.0范围。在乙醇作为微生物唯一碳源时，利用可燃性气体传感器输出电压设定值为1.45V全自动流加乙醇并始终保持乙醇在培养基中的浓度为1.0g/L。培养3天后，食酸戴尔福特菌USTB02的光密度(OD680nm)可以从1.0左右增加到150.0，对应细胞干重浓度为30.0g/L以上。
3、发酵罐培养基中乙醇浓度的控制方法在发酵培养通气过程中，与传感器气敏元件串联的电阻两端的输出电压设定为1.45V。因为乙醇是挥发性化合物，发酵罐流出气体中乙醇浓度的减少将引起传感器气敏元件电阻的增加，从而导致与传感器气敏元件串联的电阻两端的输出电压减小，当输出电压减小到设定值时，继电器通过控制电源插座开关打开蠕动泵向发酵罐内流加乙醇。随着发酵罐培养基中乙醇浓度的增加，发酵罐流出气体中乙醇浓度也增加，这又使传感器气敏元件的电阻减少，从而导致与传感器气敏元件串联的电阻两端输出电压的增大，当输出电压增大到设定值1.45V时，继电器自动关闭流加乙醇的蠕动泵。采用此控制方法可成功地保持发酵罐培养基中乙醇浓度恒定控制在1.0g/L。
权利要求
1.一种利用可燃性气体传感器发酵培养食酸戴尔福特菌的方法，其特征在于发酵培养的具体工艺为a.微生物培养基培养基组成1000mL去离子水中，MgSO4·7H2O 0.05～0.5g，KH2PO40.25～0.5g，K2HPO42.0～5.0g，NaCl 0.5～2.5g，CaCl25.0～10.0mg，FeSO40.5～2.5mg，ZnCl20.5～2.5mg，MnCl2·4H2O 0.5～2.5mg，CuCl20.05～0.25mg，酵母粉5.0～20.0g为基础培养基，另外在发酵罐中的基础培养基经120～130℃高温和0.10～0.15MPa高压蒸汽灭菌15～20分钟；接种食酸戴尔福特菌USTB02后，在整个发酵培养过程中通过可燃性气体传感器自动流加乙醇并保持培养基中的乙醇浓度在0.1～20.0g/L范围；b.食酸戴尔福特菌USTB02发酵培养接种1～50mL食酸戴尔福特菌USTB02液于5升发酵罐内的0.5～2L微生物液体培养基中进行发酵培养；培养条件温度25～35℃，培养基中溶解氧40％～80％饱和溶解氧，通过流加NaOH溶液保持培养基的pH在6.0～8.0范围；在乙醇作为食酸戴尔福特菌USTB02生长的唯一碳源时，利用可燃性气体传感器全自动流加乙醇并始终保持乙醇在培养基中的浓度为0.1～20.0g/L；c.发酵罐培养基中乙醇浓度的控制因为乙醇是挥发性化合物，在发酵培养通气过程中，发酵罐流出气体中乙醇浓度的减少将引起传感器气敏元件的电阻增加，从而导致与传感器气敏元件串联的电阻两端的输出电压减小，当输出电压减小到设定值1.40～1.70V时，继电器通过控制电源插座开关打开蠕动泵向发酵罐内流加乙醇；随着发酵罐培养基中乙醇浓度的增加，发酵罐流出气体中乙醇浓度也增加，这又使传感器气敏元件的电阻减少，又导致与传感器气敏元件串联的电阻两端输出电压的增大，当输出电压增大到设定值1.40～1.70V时，继电器自动关闭流加乙醇的蠕动泵；采用此控制方法成功地保持发酵罐培养基中乙醇浓度恒定控制在0.1～20.0g/L范围内的任何一个浓度。
全文摘要
本发明提供了一种利用可燃性气体传感器发酵培养食酸戴尔福特菌的方法，属于生物技术领域。对于筛选出的1株能够降解微囊藻毒素的食酸戴尔福特菌Delftia acidovorans USTB02，CGMCC No.1447，保藏日期2005年8月25日，通过与气敏元件串联电阻输出电压的设定进行开关控制，使发酵罐培养基中乙醇浓度恒定控制在0.1～20.0g/L范围内的任何一个浓度的方法进行发酵培养，可以获得高效降解MCs活性超高细胞浓度的食酸戴尔福特菌USTB02液。本发明的优点在于将发酵的菌液或提取的酶作为一种生物催化剂，用于微囊藻毒素的高效去除。
文档编号C12N1/38GK1782069SQ200510086720
公开日2006年6月7日 申请日期2005年10月26日 优先权日2005年10月26日
发明者徐中文, 张金燕, 孙建新, 闫海, 周洁, 何宏胜 申请人:广东绿百多生物科技有限公司, 北京科技大学