专利名称：用聚乳酸－o－羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法
技术领域：
本发明涉及一种肝细胞的培养方法。
背景技术：
急性肝衰竭(Acute liver failure，ALF)是各种肝脏疾病特别是病毒性肝炎的主要死因之一。肝细胞移植可以起到一定的肝功能支持作用。由于其具有操作简单、对机体生理环境干扰小、供体来源广泛等优点，已引起了众多研究者的广泛关注。然而，如何提高移植肝细胞的活性和降低免疫排斥反应是急需解决的两大问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可有效促进肝细胞生长，提高肝细胞活力的用聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法。
本发明的技术解决方案是一种用聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，其特征是在进行肝细胞培养时，将聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子与肝细胞混合接种培养。
培养时温度为35～38℃，并且在5％浓度的CO2条件下培养，培养12小时内，每30分钟震动一次，每次持续5分钟。
培养时温度为37℃。
肝细胞与聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的用量关系为肝细胞5×105个/ml与40μg/ml的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子相混合接种。
本发明可有效促进肝细胞生长，提高肝细胞活力，必定为肝细胞移植术的发展起到巨大的推动作用。实验证明，与普通肝细胞培养相比较，本发明培养的肝细胞形成球形聚集体的时间明显缩短，球形聚集体的比例明显增加，细胞形态好，培养后24h、第3天和第5天，ALB含量增高。培养后第3天和第5天，纳米培养组ALT含量低于普通培养组(P＜0.05)。两组培养第3天后，ALT含量逐渐降低(P＜0.05)。表明新制备的肝细胞悬液由于受到胶原酶和其它因素的影响，肝细胞膜受到不同程度的破坏，而经培养后肝细胞膜重新修复完整；纳米材料更有助于肝细胞膜的修复。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式
；聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子的制备将10ml浓度为0.03％的PLA二氯甲烷溶液与10ml浓度为0.15％的O-CMC溶液在超声情况下充分反应(约25min左右)，待其中的有机溶剂发完全后得到乳光较重的均匀悬浊液。将此悬浊液先以2000rpm低速离心5min，取低速离心后所得的上清液以14000rpm高速离心10min，得到部分白色沉淀，吸去部分上清液，将沉淀冷冻抽干取出并置于紫外灯下照射12h，消毒后备用。
猪肝细胞的分离和培养采用原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞。将分离所得肝细胞进行培养将肝细胞以5×105个/ml与40μg/ml的PLA-O-CMC纳米粒子相混合接种到培养板上(1ml/孔)，置于37℃、浓度为5％的CO2条件下静置培养，培养12小时(h)内每30分钟(min)震动一次，每次持续5分钟，以促进纳米材料与肝细胞的结合且有利于细胞集聚形成球形体。培养12h后，细胞贴附在纳米材料上。培养48h后，形成细胞粘附聚集的球形体，提高了细胞密度。培养24h，大部分肝细胞仍保持圆球状，部分肝细胞向多边形转变，多数肝细胞相互黏连，成束状生长。约培养48h后，大部分肝细胞重建细胞极性，呈现较典型、均匀的多边形形态特征。
为了更好地分析本发明的效果，同时建立了普通培养组对肝细胞进行培养将肝细胞以5×105个/ml的浓度接种到培养板上(1ml/孔)，置于37℃、浓度为5％的CO2条件下静置培养，培养12h内，每30min摇动1次，每次持续5min，以利于细胞集聚形成球形体。
普通培养的肝细胞，接种后很快沉于培养板底并贴壁生长，其形态立即由刚分离的圆球形向单层扁平多边形伸展，48～72h后细胞进一步变薄，逐渐失去多边形特征，肝细胞连接成片生长。
下面表中将用本发明方法的培养组称为“纳米材料培养组”肝细胞功能变化两组肝细胞培养上清液中白蛋白(ALB)含量比较(表1)表1 两组肝细胞培养上清液中ALB含量比较(x±s)
经统计学处理，培养后24h、第3天(d)和第5d，纳米细胞培养组ALB含量高于普通培养组(P＜0.05)。培养24h后，普通培养组ALB低于培养后12h值(P＜0.05)；纳米培养组ALB高于培养后12h值，培养7d后下降。
两组肝细胞培养上清液中丙氨酸转氨酶(ALT)含量比较(表2)表2 两组肝细胞培养上清液中ALT含量比较(x±s)
经统计学处理，培养后第3d和第5d，纳米材料培养组ALT含量低于普通培养组(P＜0.05)。两组培养第3d后，ALT含量逐渐降低(P＜0.05)。
两组肝细胞培养上清液中尿素氮(BUN)含量比较(表3)表3 两组肝细胞培养上清液中BUN含量比较(x±s)
经统计学处理，培养后第3-7天BUN含量有所增高，但各组之间及各时段之间相比差异无显著性(P＞0.05)。
权利要求
1.一种用聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，其特征是在进行肝细胞培养时，将聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子与肝细胞混合接种培养。
2.根据权利要求1所述的用聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，其特征是培养时温度为35～38℃，并且在5％浓度的CO2条件下培养，培养12小时内，每30分钟震动一次，每次持续5分钟。
3.根据权利要求2所述的用聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，其特征是培养时温度为37℃。
4.根据权利要求1、2或3所述的用聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，其特征是肝细胞与聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的用量关系为肝细胞5×105个/ml与40μg/ml的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子相混合接种。
全文摘要
本发明公开了一种用聚乳酸－O－羧甲基壳聚糖纳米粒子的肝细胞培养方法，在进行肝细胞培养时，将聚乳酸－O－羧甲基壳聚糖纳米粒子与肝细胞混合接种培养。本发明可有效促进肝细胞生长，提高肝细胞活力，必定为肝细胞移植术的发展起到巨大的推动作用。
文档编号C12N5/071GK1793339SQ20051009528
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月4日 优先权日2005年11月4日
发明者陈钟, 戴新征, 杨欣荣 申请人:南通大学附属医院