专利名称：一种制备粗酶制剂和甘草次苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种新的由禽类组织提取的含β-葡萄糖醛酸苷酶(β-Glucuronidase)的粗酶制剂，及用其转化甘草酸制备甘草次苷的方法。
背景技术：
甘草次苷，又名单葡萄糖醛酸基甘草次酸(3-Monoglucuronyl-GlycyrrhetinicAcid，3β-D-(monoglucuronyl)18β-glycyrrhetinic acid)，分子式C36H54O10，分子量646.8。
甘草次苷是甘草酸经口服后在肠道中的代谢产物，研究表明甘草次苷对β-己糖胺酶和透明质酸酶有抑制作用，对氯化苦味酸诱导的接触性皮炎也有抑制作用，还能抑制血小板凝集及角叉菜胶诱导的指爪水肿，抗肿瘤增殖，抑制实验诱导的致癌作用等。具有与(或比)甘草酸相同(或更强)的抗溃疡与抗炎作用。在大量的体内和体外动物致癌试验中发现，甘草次苷对二阶段致癌(two-stage carcinogenesis)均有抑制作用。甘草次苷的急性中毒量超过5000mg/kg(p.o.in mice)，而且经umu-test发现没有致突性。甘草次苷的甜度是蔗糖的941倍，和甘草酸具有类似的口味，而且其热量值也很低，是一种安全的高强度天然甜味剂。因此，甘草次苷的生产制备方法备受关注。Kanaoka M采用化学合成的方法制备甘草次苷(MKanaoka，Chem Pharm Bull(Tokyo)，1986，34(12)4978-4983.)，但化学合成法的技术路线长，收率低，且所制备的甘草次苷也不是天然甜味剂。甘草经过焙制仅含有极少量的甘草次苷，不能满足人们日益增长的需求，从而促使研究人员去寻找甘草次苷的替代生产方法。
根据欧盟和美国的立法，利用动植物资源通过物理方法、酶法或微生物法得到的物质，被认为是天然物质。用生物技术生产的甘草次苷，当属天然产品，符合消费者追求天然产品的消费心理。因此，利用生物转化选择性水解甘草酸生产甘草次苷，是一种有效的、很有前途的替代方法。
用生物转化法生产甘草次苷的研究已有近20年的历史，T Muro(T Muro，.Agricultural andBiological Chemistry，1986，50(3)687-692.)和鱼红闪(鱼红闪，食品与发酵工业，1999，25(3)10～15)分别报道了黑曲霉Aspergillus的β-葡萄糖醛酸苷酶水解甘草酸，但所选的微生物对甘草酸水解活性和选择性不强，产生大量的副产物甘草次酸。Kim Dong-Hyun用人肠道厌氧菌Streptococcus LJ-22的β-葡萄糖醛酸苷酶能专一性生物转化甘草酸生成甘草次苷(Kim Dong-Hyun，Biol.Pharm.Bull.1999，22(3)320-322)，由于使用昂贵的脑心浸剂肉汤作培养基，限制了该法在工业上的推广应用。Maruzen化学公司的Cryptococcus magnus MG-27是目前应用于工业生产的菌种(Takashi Kuramoto，Biosci.，Biotech.&Biochem.，1994，58(3)455-458)，该菌在甘草酸的诱导下24h培养达到最大酶活，专一的水解甘草酸生成甘草次苷，且培养一周都没有甘草次酸生成。用10g湿菌体转化10g甘草酸，反应48h，经离交，重结晶等分离后等7.5g甘草次苷，得率达95％。但此技术存在如下缺点微生物发酵需要甘草酸的诱导，β-葡萄糖醛酸苷酶的用量大，来源不方便也不经济。
本发明需要解决的技术问题是公开一种高效专一水解甘草酸制备甘草次苷的方法，以克服现有技术的上述缺陷。
发明内容
发明人发现，禽类的肝脏组织中含有专一性水解甘草酸生产甘草次苷的β-葡萄糖醛酸苷酶，该酶水解甘草酸时只生成甘草次苷而不产生甘草次酸。以禽类的肝脏组织制备的β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂催化效率高，制备容易，价格低廉，稳定性高。因此，使用禽类的肝脏组织制备的β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂可大幅度降低甘草次苷的生产成本。
本发明的β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂，含有β-葡萄糖醛酸苷酶，用作制备甘草次苷的生物催化剂。所述粗酶制剂的制备方法包括如下步骤(1)以新鲜禽类如鸡、鸭、鹅、鸽等的肝脏组织为原料，剔除结缔组织，用组织捣碎机捣碎制成匀浆；(2)用冷冻丙酮将匀浆脱水，制备成冷冻丙酮粉；(3)用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理；(4)将脱脂处理冷冻丙酮粉低温真空干燥，研碎，制备成干燥丙酮份，即为含有β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂。
利用本发明的粗酶制剂作生物催化剂制备甘草次苷，包括以下连续步骤将甘草酸配制成溶液作为生物转化底物；将按照上述方法制备的干燥丙酮粉加入底物溶液进行转化反应，生成甘草次苷。由于酶反应的底物(甘草酸)水溶液在低pH范围内易成凝胶，阻碍酶反应的顺利进行，因此有必要在反应体系中加入一种或多种助溶剂防止凝胶的形成，提高其在酶反应体系中的扩散系数，以加快酶反应的速度。由于酶的活性受缓冲液种类与pH的影响，因此发明人在反应体系中选择合适的缓冲溶液或控制反应过程中的pH以提高反应的速度。选择较好的工反应艺条件是这样的(1)粗酶制剂反应的底物甘草酸溶解于水，必要时可以先用有机助溶剂溶解，再用水稀释，所用的有机助溶剂，经过优选可以是低碳醇类、低碳酮类、二氧六环、乙酸乙酯等中的一种或多种混合溶剂；(2)所用有机溶剂的量，为体系总体积的＜50％，最佳用量在＜20％；(3)甘草酸的浓度为0.05-200g/L，最佳浓度为10-50g/L；(4)所用的生物催化剂为上述的干燥丙酮粉，丙酮粉的加入量为0.01-20g/L；(5)反应温度为10-80℃，最佳温度为30-60℃；(6)反应体系的pH为4-10，最佳pH为5.3-6.8；(7)反应时间根据反应的实际进程而定，最佳为0.5-120h。
采用本发明上述的反应条件生产的甘草次苷，可以用常规技术如有机溶剂沉淀去除杂质，所得溶液进行干燥可得粗甘草次苷；也可以采用有机溶剂萃取法提取甘草次苷。
利用本发明所公开的酶促反应工艺，不仅能简单方便的获得甘草次苷，而且生产成本比现有技术低许多，是一种具有广泛应用前景的生产方法，可以满足迅速发展的医药工业、食品工业和日用化学工业的需要，以下将通过实例对本发明的技术内容作进一步的描述。
具体实施例方式
实施例1β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂的制备将新鲜鸡肝剔除结缔组织，用组织捣碎机捣碎制成匀浆，用4倍体积的冷冻丙酮(-18℃)将匀浆脱水，过滤去除丙酮，制备成冷冻丙酮粉。用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理，于50℃真空干燥3h，研碎，制备成干燥丙酮粉。1kg新鲜鸡肝可制备230g干燥丙酮粉，并置于4℃冰箱中冷藏备用。
实施例2在50mL具塞锥形瓶中，加入0.4g甘草酸，19mL磷酸盐缓冲液(pH6.0)，并加入1mL乙醇(或者低碳醇类、低碳酮类、二氧六环、乙酸乙酯等中的一种或多种混合溶剂)促进甘草酸溶解；加入上述干燥丙酮粉0.25g，塞紧磨口瓶塞，于50℃、120r/min的旋转式水浴摇床上反应24h。反应结束后，加入20mL甲醇过滤除酶，滤出的酶用甲醇洗涤(5mL×3)，滤液旋转蒸发去溶剂，得粗甘草次苷0.33g，HPLC法测定其纯度为85％，甘草酸的转化率为98％。色谱柱为Hypersil C18柱(4.6×250mm)，流动相为甲醇/水/冰醋酸(75/25/5，v/v/v)，流速1.0mL/min，检测波长254nm。甘草酸和甘草次苷出峰时间分别为10.3min和18.5min。
实施例3采用与实施例2中的相同方法，反应结束后调节pH2-3，用正丁醇等体积萃取3次，旋转蒸发去溶剂，得粗甘草次苷0.28g，HPLC法测定其纯度为93％，实施例4在15L全自动生物反应器中，加水12.5L，甘草酸625g，用NaOH调节pH为6.0，加入实例1中制备的丙酮粉75g，于50℃、转速为200r/min下进行酶促反应，反应过程用自动控制pH6.0。反应72h后，甘草酸的转化率为90％。
向反应液中加入2倍体积的工业酒精，调节pH8-9，加热至80℃，产生大量絮凝并过滤。过滤液进行喷雾干燥，得粗甘草次苷560g，HPLC法测定其纯度为78％。
权利要求
1.一种粗酶制剂的制备方法，包括以下连续步骤(1)以新鲜禽类的肝脏组织为原料，剔除结缔组织，用组织捣碎机捣碎制成匀浆；(2)用冷冻丙酮将匀浆脱水，制备成冷冻丙酮粉；(3)用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理；(4)将脱脂处理冷冻丙酮粉低温真空干燥，研碎，制备成干燥丙酮粉，即为含有β-葡萄糖醛酸苷酶粗酶制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于禽类为鸡、鸭、鹅、鸽。
3.一种生产甘草次苷的方法，包括以下连续步骤(1)将甘草酸配制成水溶液作为生物转化底物；(2)将如权利要求1所述方法制备的干燥丙酮粉加入(1)的底物溶液进行转化反应，生成甘草次苷。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，丙酮粉的加入量为0.01-20g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用有机助溶剂配制甘草酸溶液，有机助溶剂是低碳醇类、低碳酮类、二氧六环、乙酸乙酯等中的一种或多种混合溶剂；所用有机溶剂的量，为体系总体积的＜50％(v/v)。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所用有机溶剂的量，为体系总体积的＜20％(v/v)。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，甘草酸的浓度为0.05-200g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，甘草酸的浓度为10-50g/L。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应温度为10-80℃。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，反应温度为30-60℃。
11.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应体系的pH为4-9。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，反应体系的pH为5.3-6.8。
13.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应时间为0.5-120h。
14.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应转化液用有机溶剂沉淀去除杂质，所得溶液进行干燥可得粗甘草次苷或者采用有机溶剂萃取法提取甘草次苷。
全文摘要
本发明公开了一种制备粗酶制剂和甘草次苷的方法。以新鲜禽类的肝脏组织为原料，制成匀浆，用冷冻丙酮将匀浆脱水，制备成冷冻丙酮粉，用乙酸乙酯对冷冻丙酮粉进行脱脂处理，将脱脂处理冷冻丙酮粉低温真空干燥，研碎，制备成干燥丙酮份。将甘草酸配制成溶液作为生物转化底物；将制备的干燥丙酮粉加入底物溶液进行转化反应，生成甘草次苷。该方法用于甘草次苷的制备，转化24h，甘草酸的转化率为98％，正丁醇萃取法得到产物纯度93％。本发明所公开的酶促反应工艺，具有生产工艺简单、成本低的特点。
文档编号C12P7/40GK1789413SQ200510095360
公开日2006年6月21日 申请日期2005年11月10日 优先权日2005年11月10日
发明者卢定强, 李晖, 韦萍, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学