专利名称：用于评估种子纯度的dna标记和应用dna序列评估种子纯度的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用DNA序列作为评估种子纯度的方法，尤其涉及具有同源性的DNA序列和水稻的线粒体DNA，其对于含有水稻细胞质雄性不育系的野生败育(WA)的细胞质是特有的，且在聚合酶链式反应(PCR)检测中应用这些序列去区别水稻的雄性不育系(CMS)和它们的同族雄性可育保持系。本发明涉及利用DNA碱基标记确保水稻细胞质雄性不育系的纯度的一种方法。
背景技术：
杂种优势是在两个近亲繁殖系的一个杂交的后代比它双亲中的任一个有高的生产潜力的一种现象。杂种能产生比最好的品系高10-30％的产量，而且对于增加产量它也是一个受欢迎的选择。
在世界上水稻是主要的禾谷类作物，而且在亚洲的许多地区它是饮食的主要部分。据估计，在亚洲的许多国家，象印度，到2025年为止，水稻的产量必须加倍才能满足日益增长的人口需要[Hossain，1996.InKhush(ed)水稻遗传学(Rice Genetics)III，Proc.Third Intl.RiceGenet.Symp.，Los Banos马尼拉，菲律宾，16-20 Oct.1995.国际水稻研究院，马尼拉，菲律宾]。就象在中国所证明的那样，在中国，几乎水稻种植面积的50％都是被杂种覆盖。杂种水稻的广泛种植对于增加产量是一个理想的可行的选择。相比之下，在象印度这样的国家，杂交水稻的种植面积不到水稻总的种植面积的1％。这证明了增加杂交水稻种植面积的巨大的潜力，而且，人们预计，杂交水稻种子的市场在许多种植水稻的国家将增加，这包括印度。
对于杂交水稻的生产应用最广泛的系统是三系杂交系统(表1)。三系杂交系统包括1、一个被称做细胞质雄性不育系(CMS)的雄性不育的雌性可育系，因为它在基因组的细胞质成分中携带有一个给予它突变的雄性不育；2、保持系；以及3、恢复系。保持系和恢复系是雄性可育和雌性可育的。CMS和保持系与基因组的细胞核的成分实际上是完全相同的(常常作为等同一细胞核系被提到)，但是基因组的细胞质的成分是互不相同的。CMS系的雄性不育是母性遗传的，而且最有可能是由于在线粒体DNA上突变。CMS系(雌性可育)可通过用来源于保持系的花粉受精被繁殖。因为基因组的细胞质不能通过花粉进行转移，这样杂交的后代将仅仅遗传有来源于CMS系的细胞质，而且将因此是雄性不育的。即使后代基因组的细胞核成分有一半来源于保持系，由于在这两个系的基因组的成分没有什么区别，后代基因组的细胞核成分同CMS系的细胞核成分也是完全相同的。
在CMS系和另一个近亲繁殖的亲本系杂交中产生的杂种种子被称做恢复系，就象上面所指明的那样是雄性可育和雌性可育的。在这个杂交中，CMS系作为雌性的亲本起作用，而恢复系是作为雄性的亲本。恢复系在其细胞核基因组中带有一个Rf基因/或多个Rf基因(可育的恢复)，它将恢复细胞质源于CMS系遗传的植物的雄性可育性。因此，在如
图1所示的杂交中产生的杂种的种子是可育的。CMS和恢复系要恰当地选择，这样杂交呈现充分的杂种优势(杂种优势)以得到比近交的品种实际上更高的产量。
目前在世界上具有商业价值种植的杂交水稻的绝大多数(90％或更多)是从一个单一的资源衍生它们的细胞质[Yuan，1995，杂交水稻生产技术，水稻研究理事会(Directorate of Rice Research)，海得拉巴，印度]，这种细胞质被称作野生败育(WA)细胞质，是在中国的野生稻中被发现的。随后，利用循环的亲体做为雄性供体，通过重复回交使这个细胞质同几种不同细胞核遗传背景进行杂交。在这个方法里，几个不同的CMS系已被培育。它们中每一个都按顺序同不同的恢复系杂交而培育出大量的杂种，它们所有都具有相同的WA细胞质。
保持杂种的纯度是重要的，因为任何杂质都会降低期望的产量。据估计，在杂种种子中每1％的杂质会使产量降低达100kg/公顷[Mao等，1996In Virmani，S.S.，E.A.Siddiq，和K.Muralidharan(eds)，杂交水稻技术的进展(Advances in Hybrid Rice Technology)Proc.Third Intl.Symp.on Hybrid Rice，水稻研究理事会(Directorate of Rice Research)，海得拉巴，印度]。印度种子法规定杂交水稻期望的纯度应该是98％(Verma，1996.Seed Tech.News 241-4)。在中国杂交水稻的纯度被规定至少是96％(Wengui Yan，2000.，US Patent#6066779)。为了确保杂交种子纯度要求的水平，用于杂交种子生产的亲本系应有高的纯度(几乎99％)水平。
一个最常见的出现在杂交种子生产期间的杂质是CMS系种子中的保持系杂质。因为它们都是等同细胞核系，除了雄性不育仅在开花期能被判断，基于形态上的标准去区分这些系是极其困难的。区分CMS和保持系的DNA标记可能被研究开发和被应用在苗的水平上去进行做为杂质出现在CMS系的原种中保持系种子的实际检测。基于聚合酶链式反应基础上的DNA标记对于这个目的是极其适用的。因为它们比基于限制性片段长度多态性的方法基础上的杂交能更为有效地处理大量的样品。
聚合酶链式反应是基于应用短寡聚核苷酸序列做为引物的DNA序列的酶[促]扩增的基础上的，这样的DNA序列出现在两个结合在靶DNA位点适当间隔的引物之间。当寡聚核苷酸引物在已知靶DNA序列的基础上被设计时，PCR工作是重复的。基于的短的(8-10个碱基长)，随机设计的寡聚核苷酸引物[Williams等，1990；核酸研究(Nucleic acidsresearch)186531-6535]的PCR的程序已被研究开发。这些引物不是以已知的靶DNA序列为基础的，而且包含有大量的这些随机产生的引物的试剂盒现在都已商品化供应。用这种方法被研究开发的DNA标记就是被称为随机扩增多态(RAPD)DNA标记。由于大量的引物是可用的，即使是极其相关的品系，其遗传(基因)的多态性也可以用这种方法检测。然而，RAPD标记的重复性是不好的，这是由于RAPD的寡聚核苷酸引物长度短，也可能是由于对靶特异性的要求程度的缺乏。这严重限制了RAPD标记做为一种区分不同基因型的诊断标记的实际应用。
用于区分水稻CMS(WA细胞质)和保持系的RAPD标记，曾有过报道(Jena和Pandey 1999；Hybrid Rice Newsletter，213-14)。然而，由于这些标记的低可重复性使在实际中不可能应用它们以常规方法对CMS和保持系进行区分。因此，基于这些方法基础上的可重复PCR的研究开发是必要的，且其能被应用于区分CMS和保持系，如果寡聚核苷酸引物是基于在CMS和保持系之间的具有多态性的水稻DNA一个区域已知序列的基础上的，那么可能获得理想的重复水平。因为这些引物在长度上比用在RAPD分析上的引物长且对靶DNA序列特异，所以基于这样引物基础上的PCR检测将是高度可重复的。
发明内容
在本申请中，对于含有野生败育型细胞质(WA)的CMS水稻系特异的水稻线粒体DNA一个区域的序列确定和识别进行了描述。在这个序列基础上，可以被用于在PCR检测中区分CMS系(WA)和与它等同细胞核保持系的特异的寡聚苷酸引物已被研究开发。这些引物已被用于区分几种不同的水稻CMS系(所有均含有WA细胞质)和它们同源的保持系。在一个编代码试验中，这个检测被用于预测水稻CMS(WA)保持系混合物的基因型，其具有100％的准确性。因此育种者可以应用这个检测去成功地检测在CMS系的原种种子中保持质的杂质，确保了这个亲本系及其由它衍生的杂种纯度。
在CMS系的原种种子中另一个杂质的来源是由不是指定保持系的水稻花粉杂交引起的。对于水稻CMS系的繁殖[Virmani，1993.农学进展(Advances in Agronmy)57377-462]，规定的最小隔离距离为300米，在这个距离内除了保持系(优先的花粉供体或雄性亲本)外，没有其它品系的水稻被培育，这是基于来源于这个距离以外的正在生长的水稻的花粉不能传粉给雌性亲本的观察为基础的。偶尔，这个最小的隔离距离或者没有被严格遵守或者由于当地的条件(例如风流和天气)可能允许花粉从正在生长的水稻作物上被转移到300米以外的距离。因此，监测在CMS繁育期间出现的劣种花粉供体远源杂交的程度是重要的。在本专利中，描述了象微卫星和序列标签位点(STSs)这样用于估计在CMS系的原种种子繁育期间出现的远源杂交的程度的序列特异的PCR标记的应用方法。
尽管这个应用是用于估计水稻CMS系出现的远源杂交的程度，但是用于估计远源杂交程度的相似方法已被应用于其它作物CMS系中，其非限制性包括玉米、珍珠谷子、高粱、麦子、太阳花、芥子、卷心菜、花木郁菜、西红柿、胡椒、秋葵等。在这里CMS系被用于杂种的生产而且合适的微卫星或STS标记也是可行的。
杂种种子纯度的评估在传统上是通过生长测试(GOT)试验完成，这是基于生长成熟的具有代表性的植物样品的形态和花的特性(区分杂种)基础上的，水稻植株要花几个月的时间才能成熟而且这些种子不得不贮存在适宜的条件下，因此它们要等到这些试验结果是可行后才能被销售。此外，象在印度出现的那样，如果在杂交种子生产后被GOT所占据的第一个生长季节也是杂种培育的优选季节的情况下就会引起相当大的耽搁。在这样情况下，种子不得不被贮存达一年至到在它们能销售之前的随后的生长季节到来。对于种子公司在延长的周期中大量的资金因此被以杂种原种的形式搁死，同时等待GOT的结果。GOT的另一个缺陷是它对由于环境影响形态特征的表达是敏感的。而且，也存在这种可能性，即不利的气候条件(象大风或大雨)可能损害或毁掉作物，这样使收集数据变得困难了。
从速度和准确性方面考虑，以一个优越的试验取代GOT为目标，基于检测的一个PCR被描述用于评估杂种种子纯度。这些实验包括区别水稻杂种亲本系的微卫星或STS(序列标签位点)多态性的应用。这些多态性是共显性的，而且等位基因是做为在PCR及琼脂糖凝胶电泳中不同大小的DNA片段被检测的。杂种能被鉴定，因为它有被两个亲本提供的等位基因，即从杂种植物中分离的DNA在PCR中做为一个模板的应用后，PCR扩增的两个不同大小的片段被获得。这些等位基因中的一个被雄性不育、雌性可育的(CMS)亲本提供，而另一个被雄性可育、雌性可育的亲本(恢复系)提供。这个试验是用从6天的水稻幼苗分离的DNA而进行的，且检测能在48小时之内被完成。这个基于种子纯度试验的PCR的实施在种子工业上将引起相当大的节约。在本实验中描述的对这个检测的另外的修改不需要在单独的苗上进行实验，而能够在从杂种种子原种所获得的一个群体苗上进行实验。
本发明涉及用于评估种子纯度的新的DNA标记和用基于标记的DNA确保水稻细胞质的雄性不育系纯度的方法。该方法是基于对水稻WA细胞质雄性不育系特异的一个DNA序列的确认识别的基础上的，也是关于来源相同的特异的DNA标记的研究开发。这些DNA标记能被用于检测CMS系的雄性可育保持系的杂质。这个应用可能对于杂交水稻工业是非常有利的，因为上述的混合物类型常常导致杂交种子有一个下降的纯度和在商品交易中产品的不利的销售。本发明还提供了在亲本系、杂交水稻及其它作物中应用象微卫星和STSs这样的共显性序列特异的PCR标记检测的方法。
在世界的许多地方，水稻是主要的禾谷类作物。中国正在大规模地实践杂交水稻的种植，据报道，杂交水稻种植后产量增加了10-30％。人们期望在不久的将来，杂交水稻技术也将在许多其它的生长水稻的国家被大规模实践。目前，大多数杂交水稻，通过一个三系系统生产，其包括1、一个细胞质雄性不育系(CMS)，由于在水稻基因组细胞质成分上的一个突变(最可能是线粒体)，所以其是雌性可育的但雄性不育的；2、一个雄性可育的、雌性可育的保持系，它和CMS系基因组细胞核成分是完全相同的，但有一个不能诱导雄性不育的不同的细胞质基因型；3、一个雄性可育的、雌性可育的恢复系。CMS系做为雌性亲本在杂交中起作用，而恢复系是雄性亲本。在杂种种子生产期间，CMS和恢复系在很近的距离内被培育，这样，来源于恢复系的花粉将被传粉给CMS系的花上。因为CMS系是雄性不育的，它将不能通过自花传粉结种，而且在CMS系上形成的任何种子都注定是由于来源于恢复系的花粉受精的结果。恢复系带有一个或多个编码基因的细胞核，它将恢复杂种的雄性可育，即使它带有一个CMS细胞质。因此杂种是自交可稔的。
CMS系由于本身是雄性不育的，它不能通过自交繁育。实际上，CMS系的繁育是通过用CMS系做为一个雌性亲本和保持系做为一个雄性亲本被完成的。从这杂交中出现的后代的基因型将同CMS系的基因型是完全相同的，因为保持系和CMS系实际上在基因组的细胞核成分上是完全相同的。后代将有CMS系的雄性不育的特性，因为基因型的细胞质成分是由雌性亲本提供的，在本试验情况下是CMS系。还应注意到保持系不带有CMS系的细胞质雄性不育表型的任何恢复。
CMS和保持系的细胞核基因型的等同性意味着这两个品系通过形态学的标准几乎是不可区分的。这就产生了一个实际问题，因为去检测在CMS系种子原种中的保持系杂质是极其困难的。因为保持系是自交可稔的，这些杂质能在杂交水稻的生产田中不需要恢复系授精就能产生种子，这导致了保持系的种子污染了杂种的种子。这种类型的污染在杂交水稻种子的生产期间是最常被观察的，而且导致期望产量的减少及在田里杂种的弱的生产能力。如果杂种的纯度达不到种子证明处(seed certificationagencies)制定的规定的限制(在印度是98％，在中国96％)，所有的种子都被拒绝，这对种子生产者(公司)是相当大的损失。
在杂交水稻的商品生产中用的CMS系绝大多数是基于WA细胞质应用的基础上的。在本专利中，我们描述了对于含有WA细胞质水稻品系特有的DNA序列的识别确认，而且这是和水稻线粒体DNA高度同源的，基于这个DNA序列的对寡聚核苷酸引物特异的序列已被研究开发，它能被用于PCR检测中可靠地区分含有WA细胞质水稻细胞质雄性不育系和它的同族的保持系。困此这些引物能被杂种种子培育者/种子公司利用去检测在CMS系中保持系的杂质，通过确保CMS系的纯度，一个主要的杂种种子污染源被除去，对种子工业和农场主产生了明显的利益。
附图的简要描述图1是杂交水稻生产的三系系统；该图是在三系系统中，一个杂种如何被生产出来的示意图。细胞质雄性不育(CMS)系(花粉不育的)做为雌性亲本在和作为雄性亲本的保持系(花粉可育的)的杂交中起作用。除了在CMS系中花粉不育外，CMS和保持系是等同细胞核的。因此，保持系对于CMS系的繁育是非常必要的。一旦CMS系被获得，它就和一个恢复系杂交，该恢复系拥有大量的我们想要的农艺学上的特性，且能恢复后代的可育性。因此通过这样杂交产生的杂种是可育的。
图2为对水稻CMS系特异的一个DNA序列的PCR扩增；PCR就如实施例3描述的用微卫星引物RM9(SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7)进行的。PCR产物在2％的琼脂糖凝胶上进行分离，用EB(溴乙锭)染色，在紫外灯下可见。第一泳道含有DNA分子量标记[λDNA用Hind III酶切消化(NEW England Biolabs，USA)]；第二泳道是含有保持系的PCR扩增产物(IR 62829B)；第三泳道是杂种(DRR H1)，第四泳道是CMS系(IR 62829A)，一个多余的DNA条带仅在杂种和CMS系中出现，在保持系中未出现的用一个黑色的箭头在胶的右角标明了。
图3为一个水稻CMS系特异的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)；用微卫星引物RM9对一个CMS特异的DNA条带进行确定，而且其如实施例4所描述的一样被纯化。该DNA条带用一个自动的DNA测序仪测序(ABI 3700；ABI，Foster city，USA)。这个序列由325碱基对组成，同源查询表明它同水稻线粒体DNA有高度的同源性，DBJ登记号#D21251，除了从1-36位置的碱基有一点(不同)外，PCR引物是基于这个序列信息被设计的，仅在CMS系中获得了扩增。正向引物是基于对水稻线粒体DNA(从位置1-36)没有呈现同源性的区域基础上的，反向引物是基于线粒体DNA序列基础上的。
图4为CMS特异DNA序列和水稻线粒体DNA的同源性(SEQ.ID.NO.2)；通过测序获得的DNA序列的信息如实施例4描述的一样和水稻线粒体DNA进行比较，DBJ登记号#D21251，用Boxshade服务器，在http//www.ch.embnet.org/software/Box-form.html.上可用。
图5为区分水稻CMS和保持系的一个PCR检测；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上被分离，用EB(溴乙锭)染色，在紫外灯下可见。第一泳道为1kb(干对碱基)的DNA标记；第二泳道含有IR58025A(CMS)；第三泳道，DRR H2(杂种)；第四泳道，IR 58025B(保持系)；第五泳道，IR 62829A(CMS)；第六泳道，DRR H1(杂种)；第七泳道，IR 62829B(保持系)。三个其它组的CMS-保持系被分析；而且在所有情况下，观察到扩增仅在CMS系中，而未观察到杂种在保持系中。
图6为用CMS特异的DNA序列做为探针在水稻CMS和保持系间进行限制片段长度多态性(RFLP)的检测；从IR 58025A(CMS)和IR 58025B(保持系)分离的基因组DNA用EcoR V限制性酶消化在琼脂糖凝胶上过夜分离。用CMS特异的DNA序列作为探针如在实施例7中所描述的进行Southern杂交。这个探针杂交上一个2.3kb的在IR 58025A(CMS)系的区域，而在IR 58025B(保持系)，其与一个0.6kb的区域杂交。
图7是为了区分水稻的CMS系和保持系而进行的一个多重PCR检测；第一泳道是DNA分子量标记[λDNA用Hind III消化(NEW EnglandBiolabs，USA)]；第二泳道是IR 58025 A(CMS)；第三泳道是IR 58025B(保持系)，在第二、三泳道中样品是通过SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5单独扩增的PCR产物；第四泳道是IR 58025A(CMS)；第五泳道，IR 58025B(保持系)，第四、五泳道中样品是通过多重SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ.ID NO.8和SEQ.ID No.9扩增的PCR产物。单态性片段是SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9的PCR产物，多态性片段是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的PCR产物。
图8为测定水稻杂种纯度的PCR检测；第一泳道是一条1kb DNA分子量标记，用引物对RM164微卫星基因座进行的PCR扩增；第二泳道是IR 40750(恢复系)；第三泳道是DRR H1(杂种)；第四泳道是IR 62829A(CMS)。注意，一个单一的多态PCR扩增的片段在第二、四泳道中被观察到。杂种显示了由双亲提供的具有特征性的等位基因的两个DNA片段。第5-12泳道代表了确定来源于DRR H1杂种原种中种子纯度而进行的一个PCR检测。两条带的出现表明了第5、6、8、9、10、11和13电泳泳道代表真正的杂种，单一条带的出现表明被7、12带代表的植物是杂质(非正常型的)。
简而言之，本发明提供了和水稻线粒体DNA有极大同源性的一个DNA序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3)，这里提到的序列对于含有水稻细胞质雄性不育的野生败育细胞质(WA)是特有的。本发明提供了基于这个序列在PCR检测中用于区分水稻的雄性不育系(CMS)和与它同源的雄性可育的保持系基础上的寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5)的寡聚核苷酸引物。
在另个具体体现中，本发明提供了基于DNA序列在PCR检测中用于区分水稻细胞质雄性不育系(CMS)和它同源的雄性保持系的基础上的应用寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了基于DNA序列在PCR检测中用于区分水稻细胞质雄性不育系(CMS)和它同源的雄性保持系的基础上的应用含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法。这里所说的雄性不育系含有WA(野生败育)细胞质。
在一个实施方案中，本发明提供了基于DNA序列在PCR检测中用于区分水稻WA细胞质雄性不育系(CMS)和它同源的雄性保持系的基础上的应用含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法。在这里如果模板DNA来源于CMS系则DNA扩增产物是可得到的，如果模板DNA来源于同源的雄性可育的保持系则DNA扩增产物不可得到。
在另一个实施方案中，本发明提供了基于这个DNA序列在PCR检测中用于水稻WA细胞质雄性不育系(CMS)和与它同源的雄性可育的保持系基础上的含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法，在这里PCR扩增片段的检测是通过琼脂糖凝胶电泳和随后的EBC(溴乙锭)染色。
在另一个实施方案中，本发明提供了基于这个DNA序列在PCR检测中用于区分水稻的WA细胞质雄性不育系(CMS)和与它同源的雄性可育的保持系基础上的含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法，在这里PCR扩增片段的检测是通过检测被结合进PCR扩增产物中的放射性标记的核苷酸来完成的。
在另一个实施方案中，本发明提供了基于这个DNA序列在PCR检测中用于区分水稻的WA细胞质雄性不育系(CMS)和与它同源的雄性可育的保持系基础上的含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的方法，在这里非放射性标记的核苷酸被结合进PCR扩增产物，而且它的检测是通过比色法、化学发光法、或荧光测量法进行的。
在另一个实施方案中，本发明提供了基于DNA序列在PCR-ELISA(酶连免疫吸附检测)设计反应用于区分水稻的WA细胞质雄性不育系和它同源的可育保持系的方法。所述PCR-ELISA设计反应可能包括(a)一个被标记的捕获探针或一个被标记的PCR引物的应用，它们能对适当的由聚苯乙烯、苯乙烯、玻璃等组成的包被固体表面起作用；(b)在PCR中非放射性标记的[标签为地高辛DIG(digoxigen)、荧光素等]核苷酸和随后用抗-DIG或抗荧光素的抗体进行检测，这些抗体被共价连到用于ELISA的酶上，这些酶包括辣屋过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等。对于PCR-ELISA设计反应的修改包括对标记PCR扩增产物片段的可替代的方法及探针吸附到固体表面的检测方法等。
在一个实施方案中，本发明提供了基于这个DNA序列在PCR检测中用于区分水稻WA细胞质雄性不育系和它们同源的雄性可育的保持系基础上的含又SEQ ID NO.4和SED ID NO.5引物的方法。在这里的检测方法是基于是荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer)(FRET)的应用基础上的，而FRET基于包括Taqman、Beacon分子等的检测系统基础上，这对于精通这个领域的人是熟悉的。
在另一个实施方案中，本发明提供了基于这个DNA序列基础上，用第一对含有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的寡聚核苷酸引物的多重PCR检测的方法，其与第二对寡聚核苷酸引物配合。在这里只要模板DNA是从WA细胞质雄性不育系中而不是雄性保持系中被获得，用第一对引物就可以获得DNA扩增产物。而且，无论模板DNA是来源于一个CMS系还是一个雄性不育保持系，用第二套引物都能获得另一个DNA扩增产物，第二对寡聚核苷酸引物能从第一对引物的靶区域以外的水稻基因组的任何序列部分衍生而来，另一个需要考虑的是即使当两对引物被包含在同样的PCR的混合物中，各个靶DNA序列的成功的扩增应该出现。属于这个第二套的几个寡聚核苷酸引物对和第一套寡聚核苷酸引物对在PCR检测中能够被成功的进行多重扩增反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了在Southern杂交检测中用CMS特异的DNA序列区分水稻的WA细胞质雄性不育系和它的同族的雄性保持系的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估在水稻的细胞质雄性不育的繁育期间，用劣种的花粉供体(即水稻的品系不是指定的保持系)和作为结果出现的遗传上有杂质的种子远源杂交程度。在另一实施方案中，本发明提供了从单一苗中分离DNA的方法。进行PCR分析，通过在琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳对基因型进行评估，检测通过EB(溴乙锭)染色，银染进行或如果一个放射性的标签或一个非放射性的荧光标签被结合进PCR的扩增的产物中可适用的检测方法。
在一个实施方案中，本发明提供了在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估在水稻的细胞质雄性不育的繁育期间，用劣种的花粉供体(即水稻的品系不是指定的保持系)和作为结果出现的遗传上有杂质的种子远源杂交程度的方法。在这里的DNA是从一个群体的苗中被分离的(在这个群体中具有代表性的个体数可能是100)，这些苗是通过CMS原种种子发芽而获得的。进行PCR的分析，而且通过估计在被评估位置群体中等位基因的频率判断杂质的程度。估计在群体中等位基因频率的方法包括通过凝胶电泳使带有荧光标签的PCR扩增片段的分离，以及同特定的等位基因相应的峰高的评估。
在一个实施方案中，本发明提供了在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估在任何作物或杂种的生产是遵循三系的具有经济价值的植物的细胞质雄性不育的繁育期间，用劣质的花粉供体(即水稻的品系不是指定的保持系)和作为结果出现的遗传上有杂质的种子远源杂交程度的方法。DNA是从单一的苗中分离出来的。进行PCR分析，通过在琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳对基因型进行评估，检测通过EB(溴乙锭)染色、银染进行或如果一个放射性的标签或一个非放射性的荧光标签被结合进PCR的扩增的产物中可适用的检测方法。
在一个实施方案中，本发明提供了在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估在任何作物或杂种的生产是遵循三系的具有经济价值的植物的细胞质雄性不育的繁育期间，用劣质的花粉供体(即水稻的品系不是指定的保持系)和作为结果出现的遗传上有杂质的种子远源杂交程度的方法。DNA是从一个群体的苗中被分离的(在这个群体中具有代表性的个体数可能是100)。进行PCR的分析，而且通过估计在被评估的位置群体中等位基因的频率判断杂质的程度。估计在群体中等位基因频率的方法包括通过凝胶电泳使带有荧光标签的PCR扩增片段的分离，以及同特定的等位基因相应的峰高的评估。
在另一个实施方案中，本发明提供了在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估水稻杂种的亲本系纯度的方法。在这里采用了生产杂交水稻的一个两系系统。这些亲本系包括一个雌性亲本，它具有由温度、光周期引起不育的及能够诱导雄性配子致死的化学试剂处理的条件雄性不育性。DNA是从单一的苗中进行分离的。进行PCR分析，通过在琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳对基因型进行评估，检测通过EB(溴乙锭)染色、银染进行或如果一个放射性的标签或一个非放射性的荧光标签被结合进PCR的扩增的产物中可适用的检测方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估水稻杂种的亲本系纯度的方法。在这里采用了生产杂交水稻的一个两系系统。这些亲本系包括一个雌性亲本，它具有由温度、光周期引起不育的及能够诱导雄性配子致死的化学试剂处理的条件雄性不育性。这里要求保护的是将DNA从一个群体的苗中分离的方法(在这个群体中具有代表性的个体数可能是100)，这些苗是通过亲本系发芽的种子被获得的。进行PCR分析，而且通过估计在被评估位置群体中的等位基因的频率判断杂质的程度。估计在群体中的等位基因频率的方法包括通过凝胶电泳使带有荧光标签的PCR扩增片段的分离，以及同特定的等位基因相应的峰高的评估。
在另一个实施方案中，本发明提供了在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估任何具有经济重要性的杂种的亲本系纯度的方法。在这里采用了杂交生产的一个两系系统。这些亲本系包括一个雌性亲本，它具有由温度、光周期引起不育的及能够诱导雄性配子致死的化学试剂处理的条件雄性不育性。DNA是从单一的苗中进行分离的。进行PCR分析，通过在琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳对基因型进行评估，检测通过EB(溴乙锭)染色、银染进行或如果一个放射性的标签或一个非放射性的荧光标签被结合进PCR的扩增的产物中可适用的检测方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估任何具有经济重要性的杂种的亲本系纯度的方法。在这里采用了杂交生产的一个两系系统。这些亲本系包括一个雌性亲本，它具有由温度、光周期引起不育的及能够诱导雄性配子致死的化学试剂处理的条件雄性不育性。这里要求保护的是DNA是从一个群体的苗中被分离的方法(在这个群体中具有代表性的个体数可能是100)，这些苗是通过亲本系发芽的种子被获得的。进行PCR分析，而且通过估计在被评估位置群体中等位基因的频率判断杂质的程度。估计在群体中等位基因频率的方法包括通过凝胶电泳使带有荧光标签的PCR扩增片段的分离，以及同特定的等位基因相应的峰高的评估。
在另一个实施方案中，本发明提供了当水稻的种子或苗及一个三系或二系的系统被应用于杂种的生产时，在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估杂种纯度的方法。DNA是从单一的苗中进行分离的。进行PCR分析，通过在琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳对基因型进行评估，检测通过EB(溴乙锭)染色、银染进行或如果一个放射性的标签或一个非放射性的荧光标签被结合进PCR的扩增的产物中可适用的检测方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了当水稻的种子或苗及一个三系或二系的系统被应用于杂种的生产时，在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估杂种纯度的方法。DNA是从一个群体的苗中被分离的(在这个群体中具有代表性的个体数可能是100)，这些苗是通过杂种原种发芽的种子被获得的。进行PCR分析，而且通过估计在被评估位置群体中等位基因的频率判断杂质的程度。估计在群体中等位基因频率的方法包括通过凝胶电泳使带有荧光标签的PCR扩增片段的分离，以及同特定的等位基因相应的峰高的评估。
在另一个实施方案中，本发明提供了当任何作物或有经济价值植物的种子或苗及一个三系或二系的系统被应用于杂种的生产时，在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估杂种纯度的方法。DNA是从单一的苗中进行分离的。进行PCR分析，通过在琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳对基因型进行评估，检测通过EB(溴乙锭)染色、银染进行或如果一个放射性的标签或一个非放射性的荧光标签被结合进PCR的扩增的产物中可适用的检测方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了当任何作物或有经济价值植物的种子或苗及一个三系或二系的系统被应用于杂种的生产时，在PCR检测中用象微卫星和序列标签位点(STSs)这样的共显性的序列特异的DNA标记评估杂种纯度的方法。DNA是从一个群体的苗中被分离的(在这个群体中具有代表性的个体可能是400)，这些苗是通过杂种原种发芽的种子被获得的。进行PCR分析，而且通过估计在被评估位置群体中等位基因的频率判断杂质的程度。估计在群体中等位基因频率的方法包括通过凝胶电泳使带有荧光标签的PCR扩增片段的分离，以及同特定的等位基因相应的峰高的评估。
为详细描述本发明，最初，PCR检测是在单独从构成CMS(WA细胞质)的一套水稻品系中分离的DNA模板上进行的。保持品种和相应的杂种用寡聚核苷酸引物扩增RM9水稻微卫星位置(McCouch等，1996.Rice GeneticsIII，Proc.Third Intl.Rice Genet.Symp.Los Banos马尼拉，菲律宾16-20Oct.1995.国际水稻研究院，马尼拉，菲律宾).PCR扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，而且通过溴乙锭(EB)染色进行检测。就象对PCR检测所期望的一样，RM9位点被检测到，利用来源于所有三系的模板DNA，一个大约250bp的PCR扩增片段被观察到(图2)。除此之外，仅模板DNA从CMS系或杂种中获得时，一个大约350bp的PCR扩增片段才能在此反应中被观察到(图2)。然而，这个片段的PCR扩增被发现对反应条件是高度敏感的，即使模板DNA从CMS系或杂种中获得时，也常常观察不到它。这表明引向RM9微卫星位置的引物不能可靠地被用于区分CMS系和保持系。我们认为这种重复性的缺乏出现是由于在RM9引物和含有CMS细胞质的品系的靶序列中不能完好地配对。
随后，在图2中表明的CMS系特异的PCR扩增的片段(大小为325bp)被纯化，而且通过应用来源于RM9位置的正向和反向的寡聚核苷酸引物在DNA自动测序仪上进行核苷酸序列的确定。被确定的PCR核苷酸序列如图3所示。
用BLAST计算程序通过国家生物技术信息中心(Bethesda，Maryland，USA)的网点，在GenBank DNA数据库中进行同源DNA序列的查询[Altschul等，1997.核酸研究(Nucleic Acid Res.)253389-3402]。所述DNA序列同数据库中的特定的记载[登记号#D21251；日本的DNA数据库(DBJ)，在这作为一个参考]是高度同源的。这个记载来源于基因组区域的水稻(Oryza sativa)线粒体的一个序列，其编码核糖体蛋白S3、L16、S12及NADH脱氢酶的亚单位3。这里所说的DNA序列同水稻线粒体DNA同源的程度如图4所描述的。很清楚，除了在登记号#D21251所描述的水稻线粒体DNA缺乏的一段DNA序列[同核苷酸序列ACGGCCCTCATCACCTTCTTTCACTTTTTGTTTTTG(SEQ ID No.3)相应的]外，区域是高度同源性的。
被用在PCR检测中区分水稻CMS(WA)和保持系的一对寡聚核苷酸引物是以这个序列为基础被设计的(表2在描述的末尾进行了表明)。其中一个引物(正向引物)是以对CMS系(图3)特异的序列为基础的，而另一个引物(反向引物)是基于核糖体蛋白S3基因的基因组的上游区域的水稻的线粒体DNA，其位于核苷酸#s1362和1384之间，如DBJ登记号#D21251所表明的，寡聚核苷酸引物[正向引物5’-ACTTTTTGTTTTTGTGTAGG-3’(SEQ ID No.4)；反向引物5’-TGCCATATGTCGCTTAGACTTTAC-3’(SEQ ID No.5)]被用在以来源于水稻CMS系和保持系的模板DNA进行PCR检测，这些模板DNA被列在表1中(如描述的末尾所示)。
当模板DNA是从CMS系(IR 58025 A，IR 62829 A，PMS 8A，PMS 10A，78897 A)分离的，利用引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5作为引物，可获得一个PCR扩增的325bp的产物(图5)，而当模板DNA来源是保持系时(IR 58025 B，IR 62829 B，PMS 8B，PMS 10B，78897 B)却不能得到。在这个测试的进一步的证据中，一个编码实验在从35种不同的水稻植物中提取的基因组DNA中进行的，它们中有15种是CMS系的IR 58025A，20种是保持系的IR 58025B。在不了解这35种植物那些是CMS系，那些是保持系的情况下，进行PCR检测。这个检测被精确地用于预测35种不同植物的每个基因型，表明了PCR检测作为区分水稻CMS和保持系方法的可应用性。
这里所说的CMS特异的PCR扩增片段是用α32p-dATP放射标记的。从同族的成对的CMS(IR 58025A和IR 62829A)和保持系(IR 58025B和IR 62829B)被分离的基因组DNA用不同的限制酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离，和放射性标记的探针杂交(如Sambrook等，1989，ColdSpring Harbor，NY，USA)。图6表明在水稻CMS(WA)系和保持系间的一个限制性片段长度的多态形，它通过用探针及EcoR V限制性酶被检测到的。用上述提到的探针-酶联合对来源于水稻CMS和保持系的线粒体DNA的纯化及RFLP分析揭示了同那个可检测在线粒体DNA中多态性相似的一个多态性的证实。
多重PCR检测被发展用以区分水稻的CMS和保持系。在这个检测中，用在上面提到的PCR检测中的第一套寡聚核苷酸引物和属于第二套寡聚核苷酸引物进行多重复合。这个第二套寡聚核苷酸引物或是以从正在进行的国际水稻基因组计划(公共可用的就象在GenBank登记号#AP001859，在这里引入作为参考)的一部分获得的水稻的染色体I上的一段序列为基础的，或在DBJ中登记号为#D21251可用的水稻线粒体DNA序列为基础的。第二套引物被这样设计，因此属于第二套中的任一引物对都可被加到含有属于第一套寡聚核苷酸引物的引物的PCR检测的混合物中，而不会影响通过第一套寡聚核苷酸引物扩增CMS特异的DNA片段。在这个多重PCR检测中，无论模板DNA是来源于一个CMS系还是来源于一个保持系(图7)，第二套寡聚核苷酸引物扩增一个特异的DNA片段。当从CMS和保持系中获得一个PCR扩增的片段时，第二套引物作为影响PCR结果的外在的因素(象PCR的抑制剂，模板DNA的质量不好等)的对照。第二套寡聚核苷酸引物，它们在水稻基因组上的位置及通过用这些引物扩增的DNA片段的大小在表2中被表明了(在描述的末尾所示)。
微卫星(也称单序列重复或SSRs)是简单的，一前一后重复的二至四-核苷酸序列的基元，它位于一个独特的序列的侧翼。微卫星是丰富的，而且很规则地分散在水稻(McCouch等1997)及其它作物的基因组中(Powell等，1996，Trends Plant Sci.1215-222)。因为微卫星是共显性的，可以检测高水平的等位基因的多样性，且能通过PCR进行有效的检测，所以它作为遗传标记很有价值。目前通用的被微卫星提供的水稻中基因组宽度的覆盖水平为每6cM一个(Temnykh等，2000.Theor.App.Genet.100697-712)对于评估杂种纯度和基因型的确定是充分有用的。同微卫星相似的是STS，一个STS是一段短的DNA序列，它可以通过PCR进行检测，而且在基因组中可以作为一个地标对特定的位点做图谱。在水稻中作图谱的一些STSs是多态的(Ghareyazie等，1995.Theor.Appl.Genet.91218-227；Robenoil等，1996.Inkhush，G.S.(ed)Rice Genetics III，Proc.Third Intl，Rice Genet，Symp，Los Banos马尼拉，菲律宾，16-20 Oct.1995.国际水稻研究院，马尼拉，菲律宾)。
水稻CMS系的繁育规定最小的隔离距离是300米[Virmani，1993.杂交水稻在农艺学方面的进展(Hybrid Rice Advances in Agronomy)57377-462]，也就是在这个隔离距离内除了保持系的水稻以外，没有水稻系应被培育。这是基于来源于这个距离以外的正在生长的水稻的植株的花粉不能传粉给CMS系的观察的基础上的。在偶然的情况下，这个最小的隔离距离或是由于没有被严格的遵守或是由于当地的条件(象风流和天气)有可能允许花粉被转移到300米以外的正在生长的植物上。
CMS系同来源于生长在大田附近的水稻品系(保持系除外)的劣质花粉的杂交授粉的程度，可以通过微卫星和STS标记进行评估，这两种方法在这些水稻品系和CMS系间具有多态性。这些多态性的标记可用来源于有潜在的生产能力的供体系(一个具有代表性的情况是1-3个系)和CMS系中的任一个的模板DNA通过PCR、琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色鉴定。一个优选标记是一个能够检测来源于这些劣质系任一个的杂交授粉。来源于杂交授粉的植物在杂合性存在的情况下将用这样的标记检测[即在两个大小不同的DNA片段存在的情况下，这两个片段中的一个是被雌性(CMS)亲本提供的，而另一个是由雄性的亲本提供的(劣质花粉供体)]。和这种情况形成对照的是，如果授粉象我们希望的那样出现，且花粉来源于保持系，那么纯合子(以单个的DNA片段存在的)将在后代中被观察到，这是因为CMS和保持系相互是等同细胞核的，意味着除了细胞核DNA标记外，它们在实质上是完全相同的。DNA分离、PCR及琼脂糖凝胶电泳的程序如实施例9所描述的一样。
这种检测的修改方法也在实施例9中被描述了，其中的DNA是从属于CMS原种的苗(从100或更多的种子库中获得的)的群体中获得的叶片中分离的。用于检测多态性标记的引物中的一个在5’末端用象荧光素、若丹明、和其它的这样的染料染色标记，它们可以用象ABI 377 DNA测序仪的基因描扫设备或对这个领域熟悉的人来讲所知道的其它相似的仪器，随后的PCR或电泳被检测到。通过这种检测，杂交授粉的程度可以通过测量每个峰的高度进行检测(每个峰的具有一个等位基因特性)，就象通过仪器进行检测一样。如果仅有一个峰被检测到(相对应于一个等位基因)，那么CMS种子的样品能被认为是100％纯的。通过在样品中出现多个等位基因(峰)，检测杂质。杂质的峰高(被劣质种子供体提供给群体的等位基因)和期望峰高(具有CMS系特性的等位基因)的比率表明了曾出现在随后的用劣种花粉供体的杂交授粉的CMS原种中的种子的频率。
尽管本申请如前面所表明的一样是用于评估出现在水稻CMS系的繁育期间的远源杂交的程度的，一个相似的方法能被用于评估出现在其它作物CMS系的繁育期间的远源杂交的程度，这些作物非限制性包括玉米、珍珠谷子、高梁、麦子、太阳花、芥子、卷心菜、花椰菜、西红柿、胡椒、秋葵等。在这里，CMS系用于杂种的生产，而且适当的微卫星或STS标记是可用的。
种子纯度的评估是杂交水稻程序的一项重要质量控制成分。在传统上这是通过生长测试(GOT)完成的，它(GOT)是基于在生长到成熟(Ref)的植物上的形态的或花的特性的评估的基础上的。对于种子工业来讲，大量资金因为延长的周期以贮存的杂种种子形式被搁死，同时等待着GOT的结果。以检测基础上的DNA取代GOT为目标，用微卫星和序列标签位点(STS)多态性，水稻细胞质雄性不育(CMS)、恢复和杂交系被筛选以用于区分。这些共显性多态性在PCR、琼脂糖凝胶电泳、溴乙淀染色后被鉴定。这个方法的原理是杂种将是杂合的(即两个亲本的等位基因将在杂种中出现)，当用在亲本系间具有多态性的微卫星或STS标记评估基因型时(即检测在两个亲本上的一个不同的等位基因)，用3天龄的水稻苗进行DNA分离、检测杂合性及纯度的一个简单程序已被标准化(如下所描述)，而且已被用于在杂种种子组中杂质的检测(实施例10)。尽管多重多态性的标记能被用于(或是单独地或是多重地)评估种子纯度，但是考虑到花费上的原因，建议一个单一的适当选择的微卫星标记足以评估杂种种子纯度。
这个检测的一个修改也是在实施例10中被描述，其中DNA是从属于杂种种子原种的400棵小苗(从400粒种子库中获得的)群体的叶片中被分离的用于检测多态性标记物中一个在5’末端用象荧光素、若丹明和其它染料这样的荧光标签进行标记，这些荧光标签标记可用象ABI 377 DNA测序仪的基因扫描设备的仪器或熟悉这个领域的人所知道的其它仪器在随后的PCR和电泳在被检测到。通过这个检测，纯度可以通过测量期望的两个峰中每一个高度检测，这两个峰(每个峰代表被一个亲本提供的等位基因)具有可通过仪器检测的杂种特性。在PCR检测中，用从一个单一杂种植物中分离的基因组DNA做一个模板，峰高被期望是相等的，产生了1∶1的比率(或50∶50)。在PCR检测中，用从400株苗的群体中分离的基因组DNA作为一个模板，任何两个峰高度的1∶1的比率(50∶50)的偏离都将是在杂种种子原种中杂质程度的指标。峰高比率为1.02∶0.98(51∶49)将和一个98％纯度的杂种种子原种的样品对应，峰高比率为1.1∶0.9(55∶45)将和一个90％纯度的杂种种子原种的样品对应。
用于评估杂种种子纯度的方法在认真考虑后应被仔细地筛选。生长在邻近大田的品种作为一个有潜在生产能力花粉供体或在CMS系繁育期间(在这里仅保持系应是一个花粉供体)或在杂种生产期间(在这里仅恢复系应是一个花粉受体)起作用。如果授粉是通过劣种花粉供体进行的(即既不是保持系也不是恢复系的品系被发现出现的情况下)，而且那个劣种供体对应于所选择的微卫星或STS标记在CMS系是中具有多态性，那么杂合性即使在我们想要的杂种不存在的情况下也可以被观察到，因此，筛选用于评估杂种纯度的标记应在CMS系和有潜在生产能力的花粉供体之间是单态性的，而不应在CMS系和恢复系之间有多态性。那么我们期望的杂合性的检测将是杂种种子生产的一个指标。这些特异的标记在用或微卫星或STS标记于CMS，恢复系和有潜在生产能力的劣种的供体系中所进行的多态性测量中被鉴定。对于以前熟知这一个领域的人说，这些多态性标记的检测并不困难，因为目前有大量的微卫星标记对水稻是适用的(Temnykh等，2000)。
DNA标记检测从速度和准确度角度来讲优于GOT，而且它的应用在种子工业上将引起相当大的节省。尽管这个方法被标准化了，用于评估如图1所描述的那种类型的通过三系培育系统生产水稻杂种的纯度，它也可用于评估通过两系培育系统获得的水稻杂种的纯度。在这个两系培育系统中，一个条件型的雄性不育系通过生长在诱导雄性不育的条件下，被用做杂种生产的雌性亲本。当生长在不会诱导雄性不育的条件下，该系可通过自我授粉繁殖。因此，可以避免对细胞质雄性不育和保持系的需要。两系培育系统总的说来处于实验阶段(除了在中国有一个小的规模)，然而，即使对于杂种种子生产的两系系统，评估杂种种子纯度的方法也将和三系培育系统所描述的那样是相同的。在这种情况下，区分雌、雄性亲本(而不是CMS和恢复系)的微卫星和STS多态性将象前述的一样被鉴定及应用。
尽管这个方法是用于评估水稻杂种的纯度的标准化的方法，它也能被用于评估任何其它作物中杂种的纯度，这些作物非限制性包括玉米、珍珠谷子、高梁、麦子、太阳花、芥子、卷心菜、花郁菜、西红柿、胡椒、秋葵等，对于它们合适的微卫星和STS标记也是可用的。人们期望这个检测方法(或由此所做的修改对于熟知这一领域的人是明显的)在杂交种子质量控制程序中发现广泛的应用。用这个过程进行种子试验的农民也将获利，因为他们正在得到一个适合的真正的产品。
具体实施例方式
实施例1从水稻CMS和保持系进行基因组DNA的分离水稻基因组DNA的分离用或是被(a)Kochert等(1989)RockefellerProgram on Rice Biotechnology，Cornell Univ.，New York，USA描述的程序或(b)Chunwongse等(1993)Theor.Appl.Genet.86694-698的程序，有稍微改动(a)简要的，用Kochert等的分离程序如下5-10g来源于20天龄的温室中生长的植物的叶片在一个液态氮的研钵和杵中被研磨至到形成一个均匀的粉末，不要让粉末解冻。样品然后被转到抗氯仿的50ml试管中(聚丙醇试管)，试管中含有预先温热到60℃的25ml提取缓冲液[420g尿素，70ml 5M NaCl，50ml 1M Tris-HCl pH8.0，80ml 0.25M EDTA，200ml10％SDS 50ml苯酚试剂，用灭过菌的重蒸水(double distilled water)定容到1L]。用玻璃棒搅拌不要形成任何的块状物，加入0.750ml的20％的十二烷基苯磺酸钠，混合好。这个混合物在60℃温育10分钟，同时不时有规律地上下倒置混匀。冷却到室温，加15ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀得到一个乳液。试管被离心而分成水和氯仿相，用吸移管将上层水相移到一个新鲜的50ml试管中，将2/3体积的异丙醇加到最终的水相中，颠倒混合直到DNA开始聚集。DNA被沉淀析出并转移到一个含有70％乙醇的新鲜的试管中。DNA通过离心而成粒状沉淀并在倒掉乙醇后于真空干燥器中被吸干。DNA被溶解在TE中(Tris-HCl 10mM pH8.0，EDTA 1mM pH8.0)。
(b)应用Chunwongse等(1993)进行DNA分离的程序如下种子在培养皿湿润的滤纸上在黑暗中28℃下发芽。三天龄的苗用一个杵在一个1.5ml的含有200μl提取缓冲液的试管中单独地被捣碎，此缓冲液由5％W/V chelex-100(Bio-Rad实验室、美国)在无菌蒸馏水中组成。组织匀浆在95℃中温育10分钟，于12000rpm的转速下离心1分钟。10-15μl上清液被用于每个PCR反应。
实施例2从水稻CMS和保持系中分离线粒体DNA线粒体DNA根据Saleh等，(1989)Theor.Appl.Genet.77617-619的程序从CMS和保持系中分离。表面消过毒的种子在温室中发芽生长14天。这些植物然后在黑暗中被保存3天，以使植株褪色发白。这一步之后，所有的实验均在4℃条件下进行。收集来源于14天龄植株的20g叶片并将其切成小片。叶片在一个100ml缓冲液A的研钵和杵中被匀浆。缓冲液A(10mM TES pH7.2，0.5M甘露糖醇，0.2％BSA，0.05％半胱氨酸。组织匀浆通过4层的奶酪布过滤，在5000rpm转速下离心10分钟，收集上清液。粒状沉淀被轻轻重悬浮在30ml的缓冲液A中，再于5000rpm下离心10分钟。混合上清液，于12000rpm转速下离心10分钟，收集粒状沉淀。将上清液再一次在12000rpm下离心10分钟，混合两次粒状沉淀。该沉淀在缓冲液A中重悬浮而且于5000rpm下离心10分钟，收集上清液。1M MgCl2和10mg/ml新配制的Dnase I(在0.15M NaCl和50％甘油中)加到使终浓度为10mM的MgCl2和10μg DNase/g新鲜的叶片组织按时，4℃温育1h。一个蔗糖梯度是用缓冲液B(10mM TES pH7.2，20mM EDTA，0.6M蔗糖)和2ml线粒体悬浮液被加到每个试管中形成的。于16000rpm下离心10分钟，粒状沉淀在4ml缓冲液C(50mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTApH8.0，2％肌氨酰，100μg/ml蛋白酶K)中被重悬浮，并在37℃的水浴摇床(Jolabo，德国)中温育2小时，同时进行轻轻搅拌。裂解液用0.2M乙酸铵补足，而且用3个循环的苯酚-氯仿抽提进行纯化。用95％乙醇洗涤沉淀颗粒，再用70％乙醇洗涤。在真空中干燥沉淀颗粒，DNA溶解在TE中，用RNA酶(Rnase A)处理，-20℃下保存。
实施例3对水稻CMS系特异的DNA序列的确定所用的引物对于水稻RM9微卫星位置的寡聚核苷酸引物(McCouch等，1996.Rice Genetics III，Proc.Third Intl.Rice Genet.Symp.LosBanos马尼拉，菲律宾16-20 Oct.1995.国际水稻研究院，马尼拉，菲律宾)。
正向5’-CAAAAACAGAGCAGATGAC-3’(SEQ ID No.6)反向5’-CTCAAGATGGACGCCAAGA-3’(SEQ ID No.7)引物被Oswel DNA Service，Southamton，U.K合成的。聚合酶链式反应(PCR)条件如McCouch等，[(1996).Rice Genetics III，Proc.ThirdIntl.Rice Genet.Symp.Los Banos马尼拉，菲律宾16-20 Oct.1995.国际水稻研究院，马尼拉，菲律宾]的略带修改的描述。简言之，PCR是在含有50-100ng模板DNA，每个引物5pmol，200μM(每)脱氧核糖核苷酸，50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01％明胶和1个单位的Taq聚合酶的25μl反应体系中进行的。PCR条件是95℃，7分钟(为初变性)，接着是94℃下变性1分钟，55℃下退火1分钟，72℃下延伸2分钟这样三个重复步骤组成一个循环，共进行35个这样循环，最后在72℃下延长5分钟。样品在4℃下贮存，备下一步使用。PCR产物的检测是通过在1％或2％的琼脂糖凝胶上分离、电泳、溴乙锭染色，以便在紫外灯下可见DNA片段来进行的。
PCR是用一个保持系、CMS系和同族的杂种进行的。除希望的由RM9引物扩增DNA片段外，仅在CMS系和杂种中观察到了一个额外的条带，但在保持系中没有观察到(图2)。
实施例4对水稻CMS系特异的核苷酸序列的确定用RM9引物，PCR是在含有50-100ng模板DNA，每个引物5pmol，200μM(每)脱氧核糖核苷酸，50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01％明胶和1个单位的Taq聚合酶的25μl反应体系中进行的。PCR条件是95℃，7分钟(为初变性)，接着是94℃下变性1分钟，55℃下退火1分钟。72℃下延伸2分钟这样三个重复步骤组成一个循环，共35个这样循环，最后在72℃下延长5分钟。在4℃下贮存，备下一步使用。扩增的PCR产物被分离在琼脂糖凝胶上、被溴乙锭染色并且其在紫外灯下可被观察到。对CMS系(图2)特异的大约350bp的DNA序列从凝胶上切下用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiaquick Gel Extraction Kit)(Qiagen，德国)根据操作指南进行纯化，纯化后DNA的用自动DNA测序仪ABI 3700(ABI，Foster City，USA)排序，所获得序列如图3所示，在GenBank中对DNA同源性查询表明(图4)这个序列大多数和水稻线粒体体DNA(DBJ，登记号#D21251)一个区域有同源性。然而，这个序列有一小部分同水稻线粒体DNA并没有呈现任何同源性。
实施例5
用于PCR检测区分水稻CMS和保持系的特异的寡聚核苷酸引物的设计PCR引物设计是基于用在实施例4所描述的程序获得的序列信息基础上的。一个引物是以那个序列的一部分为基础的，这个序列对于CMS系是独有的(图3中1-36的碱基位置)，而另一个引物是以水稻线粒体DNA序列为基础的，这个引物是正向5’-ACTTTTTGTTTTTGTGTAGG-3’(SEQ ID No.4)反向5’-TGCCATATGTCGCTTAGACTTTAC-3’(SEQ ID No.5)实施例6用于区分水稻CMS和保持系的PCR检测用实施例6中描述的引物对，PCR在以CMS和保持系做为模板DNA的25μl反应体系中进行的。反应组成为50-100ng模板DNA、1X PCR缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01％明胶)、200μM(每)脱氧核糖核苷酸(dNTP)、1个单位的Taq聚合酶、每个引物5pmol。PCR条件是在95℃下进行7分钟的初变性，接着是94℃下变性30秒、44℃下退火1分钟、72℃下延伸2分钟这样三个重复步骤组成一个循环，共进行35个这样循环，最后在72℃下延长7分钟。样品在4℃贮存，备下一步使用。PCR产物是在1％琼脂糖凝胶上被分离、DNA条带用溴乙锭染色，且在紫外灯下可见。用这个引物对，在CMS系中有一个350bp的DNA片段的扩增，但在保持系中(图5)没有观察到PCR扩增。
实施例7用CMS特异的PCR扩增的DNA片段作为探针对区分CMS和保持系的限制性片段长度多态性(RFLP)检测的DNA-DNA杂交检测如实施例1(a)所描述的那样，从水稻的IR 58025A(CMS)和IR 58025B(保持系)分离的基因组DNA用各种各样的限制性酶即EcoR I、Hina III、Dra I、EcoR V、Hinc II、Sau96 I、Taqα I(New England BiolabsInc.，MA，USA)消化。来源于CMS和保持系的消化完全的3-4mg的DNA在0.7％的琼脂糖(Sigma，USA)凝胶上电泳分离、变性、中和和真空转移到Hybond N(Amersham Life Science，Buckinghamshire)膜上，这是按照由Sambrook等(1989)Cold Spring Harbor，NY，USA.提供的程序进行的。用一个紫外(UV)Stratalinker(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，DNA被杂交连到膜上。印迹在0.5M磷酸钠(pH7.2)、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1％的牛血清蛋白、1mM的EDTA溶液中，于65℃预杂交3小时。用一个随机引物标记试剂盒(JONAKI-BRTT，Mumbai，印度)，按照制造商所描述的方法，用α32P-dATP标记探针(SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5的PCR扩增产物)，于65℃下保持18小时，同时进行不断的摇荡。印迹在65℃下，用2×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)、0.1％SDS、5mM磷酸钠(pH7.0)冲洗3×20分钟，再用0.5×SSC、0.1％SDS和3mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)冲洗3×20分钟。在-70℃下，通过暴露印迹于X-射线的胶片进行发射自显影。作为一个图解，用限制酶EcoR V所获得的RFLP在表6中被描述。
实施例8区分水稻CMS和保持系的多重PCR检测我们已研究开发了一种多重PCR检测，其中第一套寡聚核苷酸引物(如在表2描述的末尾所示)能和属于第二套寡聚核苷酸引物(表3)的任一个引物对在一个单PCR中进行成功的多重复合以区分CMS和保持系。
用来源于CMS系的DNA模板作为一个靶，第一套引物可以扩增一个325bp的片段，但是用来源于保持系的基因组DNA作为一个靶不能获得扩增的产物。无论靶DNA是来源于CMS系还是来源于保持系，属于第二套寡聚核苷酸引物的任一引物对将扩增出一单一片段。这个程序叙述如下在公共领域(GenBank)可用的水稻基因组序列被下载，而且引物是基于这些序列的基础上被设计的。一个引物对是以水稻1号染色体的序列为基础的(登记号#AP001859；在数据库序列的1372和2598的位置)。寡聚核苷酸引物的序列如下正向5’-AACACAAGGGACAGCACATTGAGC-3’(SEQ ID No.8)反向5’-GAAAGAGGAGCTAGAGGTGGGTGC-3’(SEQ ID No.9)这一引物产生了一个1.1kb的PCR扩增产物。其它的两个引物对是以数据库中水稻线粒体DNA(登记号#D21251)序列为基础设计的，其在序列的4981和5641位置之间是SEQ ID No.10和SEQ ID No.11，在序列的6660和7303位置之间的是SEW ID No.12和SEQ ID No.13。
(1)正向5’-GGGCAATTCCATCGTGCTATGAGC-3’(SEQ ID No.10)反向5’-GCGTTGGGTTTTCCAACGAAAAAC-3’(SEQ ID No.11)这一引物对产生了一个660bp的PCR扩增产物。
(2)正向5’-CAGGCGAAGGTCATAATTCGCAGG-3’(SEQ ID No.12)反向5’-CGAAGAAGGCAGTCTTGCTTCCTC-3’(SEQ ID No.13)这一引物对产生了一个600bp的PCR扩增产物。
这三个引物对中的每一个单独地与表2(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)中所说明的寡聚核苷酸引物混合，在一个PCR中进行多重扩增，所用的条件如下50-100ng的模板DNA，1×PCR缓冲液(50mM KCl，10mMTris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01％的明胶)，200μM dNTP(每一种)，一个单位的Taq聚合酶，来自于表2的引物(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)每个5pmol，来自表3任一引物对的每个引物1pmol。PCR反应的条件如下95℃、初始变性7分钟；接着94℃下30秒、44℃下1分钟、72℃下2分钟这样的一个循环，共进行35次；在72℃最后延伸7分钟，样品储存于4℃，备下一步用。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行分离，DNA条带用溴乙锭染色并且在紫外灯下可见。如图7所描述的一样，仅当模板DNA来源于CMS系时，用引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5扩增才能得到一个325bp的片段。无论模板是来源于CMS还是保持系，用在表3(SEQID No.8和SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SFQ ID No.13)中的引物对中的每一个都可扩增一个特异的DNA片段。因此，在多重PCR检测中，当模板是来源于CMS系时，有两个DNA片段被观察到；当模板是来源于保持系时，仅有一个单的DNA片段被获得。在表7中(第2泳道，第3泳道)展示了用对CMS特异的单一的引物对(SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5)进行PCR的例子和用引物对SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5和SEQ ID No.8和SEQ ID No.9(第4、5泳道)进行多重PCR的例子。
实施例9用于由于和劣种花粉供体杂交授粉而出现的CMS系中杂质检测的PCR检测如实施例1(b)所描述的一样，通过CMS原种种子发芽得到的100株3天龄的幼苗，从这些幼苗中进行基因组DNA的分离。通过用可以靶向大量的用于检测CMS系和劣质花粉供体之间的多态性的微卫星标记中的任何一个的寡聚核苷酸引物，PCR如实施例7中所描述的一样被操作(随每个来源的引物不同，循环条件有一些改动)。PCR以后，产物在琼脂糖凝胶上进行分离，通过溴乙锭染色进行检测。如果DNA是来自于CMS系，一个单个的条带就可以被观察到，但是如果来自于劣种花粉供体的杂交授粉已出现，那么除了CMS特异的带，还有一个额外的条带(劣种花粉供体)将被观察到。
用于由于和劣种花粉供体杂交授粉而出现的CMS系中杂质检测的PCR检测也可从通过CMS原种种子发芽得到的100株幼苗库分离的DNA进行。切除100株生长到15天的CMS的水稻苗中的每一株的第二片叶片顶部2cm，然后在这个区域以下切下一个1cm长的叶片。收集从所有植株切下的叶片，按照Kochert等(1989)的程序如实施例1所述分离基因组DNA。按标准程序用荧光染料标记引物对(正向或反向)中的一个的5’末端。用荧光标记的引物进行PCR反应，通常如实施例7中所描述的一样。循环条件根据所用的引物而变化。重点要提到的是，所用的模板DNA应仅仅是2-3ng，而且应该用AmpliTaq Gold酶(ABI，Foster City，USA)。PCR后，取1μl的PCR产物和上样(loading)染料[甲酰胺和右旋兰(Bluedextron)为5∶1的比率]和1.5μl的标记(ABI，Foster City，USA)混合。加热变性，加1.5μl在自动DNA测序仪377中(ABI，Foster City，USA)。在凝胶上进行电泳直到条带被很好的分离。用基因扫描分析仪(ABI，Foster City，USA)分析由条带产生的峰高。
实施例10检测水稻杂种纯度的PCR检测从来源于CMS系IR 58025A、恢复系IR40750和这两个亲本的杂种(DRR H1)中按实施例1(b)所述分离基因组DNA。用微卫星标记RM164[正向5’-TCTTGCCCGTCACAGCAGATATCC-3’(SEQ ID No.14)，反向5’-GCAGCCCTAATGCTACAATTCTTC-3’(SEQ ID No.15)](Wu和Tanksley，1993，Mol.Gen.Genet.241225-235)。两个亲本间在这个位置的多态性可以观察到。PCR的条件是DNA样品(50ng)在含有1×PCR缓冲液[10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％的明胶]，每一种dNTPs(AmershamPharmacia Biotech，Sweden)0.2mM，每种引物10pmol，一个单位的Taq聚合酶的25ml反应体系中进行。于95℃下初始变性7分钟，接着进行94℃下1分钟、55℃下1分钟、72℃下2分钟这样的一个循环，共进行35个循环，在72℃最后延伸7分钟，样品储存于4℃，备下一步用。PCR产物在琼脂糖凝胶上被分离，用溴乙锭染色且紫外灯下观察可见。用SEQ IDNo.14和SEQ ID No.15做引物进行的PCR的结果如图8所示。真正的杂种呈现两个DNA片段，一个片段是由恢复亲本提供的，另一个片段是由CMS亲本提供的。非正常型呈现了一个和亲本中任一个DNA条带共转移的单个的片段(图8)。在图8中，非正常型和CMS的DNA条带的共转移表明这个特定的杂种群被IR 5802A(CMS)污染了。在这个实验中所用的微卫星的例子证明的仅仅是被用于检测水稻杂种纯度的许多个微卫星标记中的一个例子。
检测水稻杂种纯度的PCR方法可以在一个集合的样品中被完成。让从杂种原种种子发芽得到的400株幼苗生长到15天，切除每一株第二片叶片顶部2cm，然后在这个区域以下切下一个1cm长的叶片。收集从所有植株切下的叶片，按照Kochert等(1989)的程序如实施例1所述分离基因组DNA。按标准程序用荧光染料标记引物对(正向或反向)中的一个的5’末端。用荧光标记的引物进行PCR反应，通常如实施例7中所描述的一样。循环的条件根据所用的引物而变化。重点要提到的是，所用的模板DNA应仅仅是2-3ng，而且应该用AmpliTaq Gold酶(ABI，Foster City，USA)。PCR后，取1μl的PCR产物和上样(loading)染料[甲酰胺和右旋(Blue dextron)为5∶1的比率)和1.5μl的标记(ABI，Foster City，USA)混合。加热变性，加1.5μl在自动DNA测序仪377中(ABI，FosterCity，USA)。在凝胶上进行电泳直到条带被很好的分离。用基因扫描分析仪(ABI，Foster City，USA)分析由条带产生的峰高。
通过这个检测，纯度可以通过测量期望的两个峰中每一个高度来检测，这两个峰(每个峰代表被一个亲本提供的等位基因)具有可通过仪器检测的杂种特性。在PCR检测中，用从一个单一杂种植物中分离的基因组做一个模板，峰高被期望是相等的，产生了1∶1比率(或50∶50)。在PCR检测中，用从400株苗的群体中分离的基因组DNA作为一个模板，任何两个峰高度的1∶1(50∶50)的偏离都将是在杂种种子原种中杂质程度的指标。峰高比率为1.02∶0.98(51∶49)将和一个98％纯度的杂种种子原种的样品对应，峰高比率为1.1∶0.9(55∶45)将和一个90％纯度的杂种种子原种的样品对应。
最后，可以这样说，本发明提供了确保亲本品系纯度的方法，这个方法是确保水稻杂种纯度的必要的先决条件。用在三系培育系统进行杂交水稻生产的细胞质雄性不育系常常被等同细胞核的保持系所污染。在本发明中报告的一个DNA序列对于水稻线粒体DNA是同源的，但是它是水稻WA细胞质雄性不育系所特有的。在一个聚合酶链式反应(PCR)中，用基因组的总的DNA作为模板，基于上述的DNA序列的基础上的寡聚核苷酸引物从水稻的细胞质雄性不育系扩增一个片段，但不能从与它同族的保持系中扩增这个片段，这表明这个PCR检测能被用于检测在CMS系原种种子中的保持系的杂质。对含有CMS和保持系的混合的植物样品进行的编代码实验中，这个PCR检测被用于正确预测这些植物的基因型。在Southern杂交分析中，用这些寡聚核苷酸引物获得的PCR扩增片段检测在CMS系和保持系间的多态性。本申请描述了用象微卫星和序列标签位点多态性这样的共显性的PCR可检测的标记检测在CMS系繁育期间污染的杂交授粉方面的应用，此外还描述了用此标记评估水稻杂种纯度。
表1.水稻系分析研究*CMS系IR 58025 AIR 62829 APMS 8APMS 10A78897 A保持系IR 58025 BIR 62829 BPMS 8BPMS 10B78897 B恢复系IR40750杂种DRRH1(IR 58025A×IR 40750)*在本研究中所使用的所有水稻系的提供单位为水稻研究理事会，印度农业研究委员会，海德拉巴，印度。
表2.用于PCR检测以区别水稻的CMS和保持系的特定的寡聚核苷酸序列
表3.在PCR检测中用于区别CMS和保持系的可用SEQ ID No.4和SEQ ID No.5多重复合的寡聚核苷酸引物对
F＝正向对，R＝反向对
权利要求
1.一种利用放射性或非放射性标记的方法在Southern杂交检测中用CMS特异的DNA序列区分WA水稻的细胞质雄性不育系和与它的同族的雄性可育保持系的方法。
全文摘要
本发明涉及对水稻WA细胞质雄性不育系专一的DNA标记，利用这种DNA碱基标记来评估种子纯度和为了确保水稻细胞质雄性不育系的纯度的一种方法。
文档编号C12Q1/68GK1740337SQ20051009909
公开日2006年3月1日 申请日期2001年3月28日 优先权日2001年3月28日
发明者亚什陶拉·贾米尔, 拉梅什·V·松迪 申请人:科学与工业研究委员会