专利名称：确定患者对脑卒中遗传易感性的方法
技术领域：
本发明涉及确定患者对脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性的方法，用于该方法的物质、组合物、试剂盒及其用途。
背景技术：
脑血管病流行趋势严峻、危害严重脑卒中(Stoke)，又称中风或脑血管意外(Cerebrovascularaccident)，是一组突然起病，以局灶性神经功能缺失为共同特征的急性脑血管疾病。脑卒中有极高的病死率和致残率，在我国，脑卒中则是仅次于癌症的第二大致死疾病，每年死于脑卒中的超过100万人，是冠心病死亡人数的2-3倍。脑卒中的防治已成为卫生工作中的一项重要课题，越来越引起国内外医学界特别是神经科学界的重视。
脑卒中是临床症状复杂的多因素疾病脑卒中的临床症状复杂，但主要可分为两大类缺血性卒中和出血性卒中。前者约占60-70％，后者占30-40％。缺血性卒中又进一步分为大血管阻塞性疾病，是由于动脉狭窄、管腔内逐渐形成血栓而最终阻塞动脉所致，称为脑血栓形成，其最常见的病因是动脉粥样硬化；小血管阻塞性疾病，是由于大脑小动脉逐渐狭窄而最终闭塞所致，管腔内既无血栓亦无栓子，称为腔隙性脑梗塞，高血压动脉硬化是最常见的原因；心源性脑卒中，是由于血栓脱落或其它栓子进入血流中阻塞脑动脉所引起，如房颤或冠心病患者心腔内的栓子脱落便可引起脑栓塞。出血性脑卒中根据出血部位的不同又分为脑出血和蛛网膜下腔出血。脑出血俗称“脑溢血”，是由于脑内动脉破裂，血液溢出到脑组织内。蛛网膜下腔出血则是脑表面或脑底部的血管破裂，血液直接进入含有脑脊液的蛛网膜下腔和脑室中。长期的原发性高血压和动脉粥样硬化是出血性卒中的主要原因。
研究脑卒中新的遗传危险因素意义重大大量的临床实践已证明，对已发生的脑卒中，无论如何完美的治疗，对其病死率和自然史的影响都不很理想。因此，对脑卒中的防治更应特别强调“预防为主”的方针，而寻找、确定脑卒中的危险因素(risk factor)，然后设法减少或清除这些危险因素的损害，则是预防脑卒中最基本的手段。存在危险因素的人，可称之为“卒中易患个体”(stroke-prone individual)。目前已确定的危险因素包括种族、性别、高龄和脑血管病家族史这类不可改变的因素；吸烟、酗酒、肥胖、食盐摄入过多等可以改变的不良生活习惯，以及高血压、糖尿病、心血管病、高脂血症等在一定程度上可以控制的疾病[5]。此外，同型半胱氨酸血症、血浆纤维蛋白原水平异常[7]、血小板高聚集性[8]等也是脑卒中的危险因素。
脑卒中是一种多因素疾病，其发病受基因之间以及基因与环境因素之间相互作用的共同影响[9]，特定的遗传变异与某些特定的危险因素如食盐摄入过多、肥胖、吸烟、酗酒、高血压、糖尿病、高脂血症等相互作用，可能增加了某些个体患脑卒中的危险性，反之，一些个体即使具有这些传统的危险因素，却未发生心脑血管病事件。因此，研究脑卒中相关的保护基因或有害基因，并在此基础上进一步研究这些基因与环境危险因素之间的关系，是脑卒中个体化预防和治疗的重要途径。
由于种族间的差异，中国人群同西方人群在遗传背景、生活习惯、饮食结构和社会经济结构等各方面都有很大的差异，因而心脑血管病的流行趋势也不相同。据国外统计资料，在发达国家脑血管病以缺血性为多见，脑梗塞占59.2％～85％，脑出血除日本外，一般在20％以下。我国脑梗塞虽然发病率较多见，但脑出血所占比例为30-40％，显然比国外高。其原因尚不清楚，这也正是我们进行脑卒中遗传易感性研究的兴趣点。
血管发生和血管内皮生长因子在脑卒中发病中的重要作用在血管形成的过程中，多种细胞因子发挥着重要的调控作用，包括血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体(VEGFR)，血管生成素(Angiopoietin)及其受体Tie，以及EphrinB2/EphB4等细胞因子。其中，VEGF及其受体VEGFR不仅启动血管形成，而且在其后的血管成熟稳定过程中均发挥着重要作用。血管形成异常与多种疾病的病理生理过程有关，如肿瘤、牛皮癣、糖尿病性眼病以及肥胖、哮喘、动脉粥样硬化等。
VEGF是特异作用于血管内皮细胞的生长因子，在血管发育、成熟、重构过程中起着重要的调控作用。其作用主要为(1)促进内皮细胞的有丝分裂，诱导血管内皮细胞增生和迁移；(2)增加血管通透性，(3)是单核细胞和血管平滑肌细胞(SMC)的趋化剂。最近越来越多的证据表明，VEGF与动脉粥样硬化的进展和斑块的不稳定性有密切关系。Chen等(ATVB，1999，19131-139)应用原位免疫组织化学方法证实在动脉粥样硬化斑块中，平滑肌细胞及巨噬细胞都有VEGF的强表达，VEGF阳性细胞数目与内膜血管化程度呈正相关，且分布与新生血管的分布高度一致。将人重组的VEGF转入动脉粥样硬化易感小鼠模型，发现VEGF可通过炎症浸润和新生血管的形成等机制促进动脉粥样硬化损伤的进展，斑块内的巨噬细胞和血管内皮细胞数量也显著增加(NatureMedicine.2001；7425-429.)。抑制血管形成的拮抗剂endostatin作用于Apo E-/-的小鼠模型，可显著抑制粥样斑块损伤的发展，斑块体积也随之缩小(Circulation.1999；991726-1732.)。Lemstrom KB等研究心肌移植的动脉粥样硬化发生机制，结果提示VEGF和移植物所处微环境中的其他细胞因子共同作用，促进动脉粥样硬化斑块的形成(Circulation.2002，1052524-2530)。Slevin等报道急性缺血性脑卒中患者的血清中VEGF水平升高，并观察到梗塞面积和血清VEGF之间有相关性(Stroke，2000，31(8)1863-1870)。
到目前为止，VEGF受体发现有4种VEGFR-1(fms-relatedtyrosine kinase 1；FLT1)、VEGFR-2(kinase insert domainreceptor；KDR)、VEGFR-3和一种内皮细胞表面球蛋白neuropilin-1。VEGFR-1和VEGFR-2的是VEGF的高亲和力受体，但是VEGFR-1的酪氨酸激酶活性较低，其确切功能和信号传导途径尚不清楚。VEGFR-2主要在血管内皮细胞特异表达，此外在前体细胞如新生造血干细胞也表达，在成年期静息状态的血管内皮细胞呈低水平表达。VEGF主要通过VEGFR-2在血管形成中促进内皮细胞间的相互作用以及新生血管管腔的形成。基因敲除小鼠的实验表明VEGFR-2缺乏的纯合小鼠在E 9.5天死于急性血管缺陷，病理表现为内皮细胞和造血前体细胞缺乏，提示VEGFR-2在血管形成的初始阶段不可或缺。
单核苷酸多态性人类基因组中的序列变异主要由单核苷酸多态性(″SNP″)组成，其余序列变异是短串联重复(包括微卫星)、长串联重复(小卫星)和其它插入和缺失。SNP是群体中以可测频率(即＞1％)出现两个可替换碱基的位置。SNP被称为是″等位的″，因为由于此多态性的存在，一个物种的一些成员可能具有未突变序列(即，原始“等位基因”)，而其它成员可能具有突变序列(即变体或突变等位基因)。在最简单的情况下，可能仅存在一个突变序列，该多态性被称为二对等位基因多态性。可替换突变的发生可产生三对等位基因多态性等。SNP广泛存在于基因组中，改变基因功能的SNP可能直接有助于表型变异。由于它们的流行和普遍本质，SNP已成为定位参与人类疾病情况的基因的重要工具。
研究目的以VEGFR-2基因作为候选基因，采用多临床中心的病例对照方法研究基因多态性与脑卒中发病风险的相关性。
发明内容
本发明涉及用于确定VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的遗传多态性型式的工具。它可以是VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的多态性，或者(2)用于检测VEGFR-2基因中的多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多态性的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。本发明的工具可以是限制性内切酶。
本发明还涉及用于脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的诊断试剂盒，包含本发明的工具。
本发明还涉及诊断患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在，其中，VEGFR-2基因启动子区-604C等位基因与降低的脑血栓形成性卒中患病风险相关，携带+1192T等位基因的个体和携带+1719T等位基因的个体脑出血的患病风险增加，单体型(-604/+1192/+1719)C/C/T对脑血栓形成有保护作用，而单体型(-604/+1192/+1719)T/T/T单体型携带者脑出血的患病风险增加。
本发明还涉及确定患者对脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在，其中，VEGFR-2基因启动子区-604C等位基因与降低的脑血栓形成性卒中患病风险相关，携带+1192T等位基因的个体和携带+1719T等位基因的个体脑出血的患病风险增加，单体型(-604/+1192/+1719)C/C/T对脑血栓形成有保护作用，而单体型(-604/+1192/+1719)T/T/T单体型携带者脑出血的患病风险增加。
本发明还涉及分析从患者分离的离体生物样品的方法，包括确定所述样品中VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的核苷酸。优选地，该方法还包括确定所述患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性或者诊断患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)，其中，VEGFR-2基因启动子区-604C等位基因与降低的脑血栓形成性卒中患病风险相关，携带+1192T等位基因的个体和携带+1719T等位基因的个体脑出血的患病风险增加，单体型(-604/+1192/+1719)C/C/T对脑血栓形成有保护作用，而单体型(-604/+1192/+1719)T/T/T单体型携带者脑出血的患病风险增加。
在上述方法中，可以使用以下任何的差异核酸分析技术来确定基因多态性用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性。
本发明还涉及一种微阵列，其中本文所定义的VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多态性分型寡核苷酸。微阵列可以是DNA芯片的形式。
本发明还涉及检测生物学样品中VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在的物质用于制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)或者用于确定患者对脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性。其中所述物质可以选自本发明所述的工具；能够特异识别VEGFR-2中Val297Ile突变和/或Gln472His突变的抗体；和能够特异识别VEGFR-2基因VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的引物或者探针或者限制性内切酶等。
附图简述
图1a.VEGFR-2基因rs7667298测序的基因分型图+32AA多态。
图1b.VEGFR-2基因rs7667298测序的基因分型图+32AG多态。
图1c.VEGFR-2基因rs7667298测序的基因分型图+32GG多态。
图2a.VEGFR-2基因rs9994560测序的基因分型图-65TT多态。
图2b.VEGFR-2基因rs9994560测序的基因分型图-65CC多态。
图3a.VEGFR-2基因rs2071559测序的基因分型图-604TC多态。
图3b.VEGFR-2基因rs2071559测序的基因分型图-604CC多态。
图3c.VEGFR-2基因rs2071559测序的基因分型图-604TT多态。
图4a.VEGFR-2基因rs2305948测序的基因分型图+1192CC多态。
图4b.VEGFR-2基因rs2305948测序的基因分型图+1192TT多态。
图4c.VEGFR-2基因rs2305948测序的基因分型图+1192CT多态。
图5a.VEGFR-2基因rs1870377测序的基因分型图+1719TT多态。
图5b.VEGFR-2基因rs1870377测序的基因分型图+1719AA多态。
图5c.VEGFR-2基因rs1870377测序的基因分型图+1719AT多态。
图6VEGFR-2基因rs2305948(+1192C/T)用内切酶BstZ171的RFLP分型结果。
图7VEGFR-2基因rs2071559(-604T/C)用内切酶Bsm I的RFLP分型结果。
图8VEGFR-2基因rs1870377(+1719A/T)用内切酶Alu I的RFLP分型结果。
图9VEGFR-2基因启动子-604野生型和突变型等位基因报告载体的荧光素酶活性分析。
**P＜0.001，pGL3/-604C与pGL3/-604T比较；相对荧光素酶活性单位(ratio firefly/renilla luciferase)用均数±标准差表示。
具体实施例方式
本发明涉及将VEGFR-2基因中的单核苷酸多态性和患者疾病(如脑血管疾病特别是扩张型心肌病)相关联的方法。本发明还涉及确定患者对脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性或者诊断患者这些疾病的方法，此方法包括检测VEGFR-2基因中的至少一个单核苷酸多态性。具体地，这种方法包括至少检测所述样品中VEGFR-2基因位点-604和/或+1192和/或+1719的核苷酸或者VEGFR-2蛋白质297位或者472位的氨基酸，并参照VEGFR-2基因中的多态性确定个体状态。本发明还涉及在序列中包含在上面所限定位置上的多态性的分离的核酸，涉及能与这种核酸杂交的核酸引物和寡核苷酸探针和涉及包含一种或多种这样的引物和探针用于检测VEGFR-2基因中的多态性的诊断试剂盒。
VEGFR-2基因位于染色体4q11-q12，cDNA全长约5.8kb，NCBIRefSeq mRNA accession No.为NM_002253，由30个外显子和29个内含子组成。编码的多肽链由1356个氨基酸组成。在本文中，VEGFR-2基因序列和编码的蛋白质序列按照常规方法进行编号。
本发明所提及的核酸序列和氨基酸序列中核苷酸和氨基酸残基的编号是指与NCBI RefSeq mRNA accession No.为NM_002253的序列或其编码的氨基酸序列相同位置(或编号)对应的核苷酸和氨基酸残基。
“对应”是指本发明核酸分子或者蛋白质的序列在与参考序列如NM_002253的cDNA序列所示序列最佳比对(alignment)后与该参考序列某位置相对的位置。因此，本发明核酸分子或者蛋白质“对应位置”或者“对应核苷酸”或者“对应氨基酸”不一定是与参考序列编号相同的位置、或者核苷酸或者氨基酸。
VEGFR-2基因“-604T/C”是指该基因第-604位多态性T和C，“+1192C/T”是指第+1192位多态性C和T，“+1719A/T”是指第+1719位多态性A和T。
单核苷酸多态性及其检测术语“患者”是指动物，优选哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。
术语“多态性”广义上限定为包括已知发生在核苷酸序列中的所有变异，包括插入，缺失，置换和重复序列(包括二重重复)。
根据本发明的上述方法可通过使用用于检测单核苷酸变异的任何合适方法而得以施用，比如用质谱对PCR产物的直接质量分析，对侵入性切割产物(invasive cleavage product)的直接分析，直接的序列分析，等位基因特异性扩增(即，ARMSTM-等位基因特异性扩增，ARMS指扩增受阻突变体系(amplification refractory mutationsystem))，ALEXTM(扩增受阻突变系统线性延伸(amplificationrefractory mutation system linear extension)和COPS(竞争性寡核苷酸引发系统)，等位基因特异性杂交(ASH)，寡核苷酸连接试验(OLA)，侵入者试验，DNA芯片分析和限制性片段长度多态性(RFLP)(综述参见基因组研究(Genome Research)，1998年，8卷，769-776页；Pharmacogenomics，2000年，1卷，95-100页；人类突变(HumanMutation)，2001年，17卷，475-492页)。
携有所述多态性的核酸试样方便地是从个体中获得的血液、支气管肺泡灌洗液、痰、尿液或其它体液或组织样本。这些样品可以预先进行纯化，例如分离总DNA。可以明了，试样同样可以是对应于试样中序列的核酸序列，也就是说，在等位基因变异分析前，核酸样品中的全部或一部分区域可先用任何一种方便的技术如聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)扩增。
VEGFR-2基因中的多态性可通过对患者的核酸样品进行测序和将此序列与对照物比较来确定，或通过PCR扩增不同种族来源的无关个体的DNA中的400-600个碱基对的片段(涵盖VEGFR-2基因的编码区和调节区)来确定。这些样品中的片段可用正向和反向引物测序，多态性可用PolyPhred软件(经华盛顿大学许可)检测而变体的等位基因频率可被确定(人类突变(Human Mutation)，2001年，17卷，243-254页)。
显然，对于对本领域技术人员来说有大量的分析方法可被用于检测在本发明的一个或多个多态位置处变异核苷酸存在与否。一般来说，等位基因变异的检测需要突变辨别技术，任选地扩增反应和任选地信号生成系统。国际专利申请WO00/06768列出了许多扩增技术和突变检测技术，其中一些是基于PCR技术的。这些技术可和许多信号生成系统联合使用，可选的信号生成系统也被列于WO00/06768。
用于检测等位基因变异的许多现行方法综述于Nollau等，临床化学(Clin.Chem.)，1997年，43期，1114-1120页；在标准教科书例如“突变检测实验指南”(Laboratory Protocols for MutationDetection)U.Landegren编辑，牛津大学出版社，1996年和“PCR”第二版Newton &Graham编辑，BIOS Scientific Publishers Limited，1997年。
本发明涉及可被用做检测VEGFR-2基因中多态性的诊断引物的等位基因特异性核酸引物，该诊断引物能够与在序列内于VEGFR-2基因位点-604和/或+1192和/或+1719包含多态性(例如VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T或者其反向互补序列)的核酸杂交。
等位基因特异性引物通常与恒定引物一起用于诸如PCR反应等扩增反应中，通过对位于一个特定序列位置处的一个等位基因的选择性扩增而使等位基因之间得以区分开来，例如用在ARMSTM试验中的引物。等位基因特异性引物的长度优选17-50个核苷酸，更优选大约17-35个核苷酸，最优选大约17-30个核苷酸。
优选地，等位基因特异性引物与待检测的等位基因完全地相对应，但是也可以考虑其衍生物，其中3’端大约有6到8个核苷酸与待检测的等位基因对应而不超过10个，比如不超过8，6，4，2或者1个剩余核苷酸在不显著影响引物特性的情况下可以发生变化。常常在第2和/或第3位(相对于3’端)的核苷酸被错配以优化差异引物结合和优先仅从正确的等位基因辨别引物延伸。
本发明还涉及用于检测VEGFR-2基因中的多态性的寡核苷酸探针，该探针能特异地与在序列内包含位于VEGFR-2基因第-604和/或+1192和/或+1719位的多态性(例如VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T或者其反向互补序列)的核酸杂交。
术语“寡核苷酸探针”指长度至少有17个核苷酸的一种核苷酸序列，此序列与部分或全部的人类VEGFR-2基因，特别是表达多态性的人类VEGFR-2基因部分对应。优选长度17到50个核苷酸。一般来说这样的探针包含与基因中相应的野生型或变体座位完全互补的碱基序列。
然而，如果需要，可以引入一个或多个错配，前提是寡核苷酸探针的辨别能力不被过度影响。本发明的探针可以携有一个或多个标记以便于检测，比如在Moleaular Beacons中。
本发明还包含一种诊断试剂盒，该试剂盒含有具有VEGFR-2基因单核苷酸多态性的一种或多种核酸引物和/或一种或多种寡核苷酸探针，所述多态性选自于VEGFR-2基因第-604和/或+1192和/或+1719位的多态性(例如VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T或者其反向互补序列)，以及它们的反向互补序列。
在一些实施方案中，一种组合物含有用于同时探测两个或更多个多态性位点的寡核苷酸身份的两个或更多个不同标记的基因分型寡核苷酸。也可考虑含有两套或更多套等位基因特异性引物对以允许同时靶向和扩增含多态性位点的两个或更多个区域的引物组合物。
本发明的VEGFR-2基因分型寡核苷酸也可以固定在固体表面或在固体表面合成，如芯片、珠或玻片(如见WO98/20020和WO98/20019)。这种固定的基因分型寡核苷酸可以用于各种多态性检测试验，包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸试验。本发明的固定的VEGFR-2基因分型寡核苷酸可以包括为同时快速筛选DNA样品在多个基因中的多态性而设计的有序寡核苷酸阵列。
本发明等位基因特异性寡核苷酸引物优选具有与特定SNP的仅一种核苷酸互补的3’末端核苷酸，或优选地3’倒数第二个核苷酸，由此只有存在含该核苷酸的等位基因时其才可以用作聚合酶介导的延伸反应的引物。与编码链或非编码链杂交的等位基因特异性寡核苷酸引物包括在本发明中。使用本领域技术人员已知的技术可以开发检测VEGFR-2基因多态性的ASO引物。
本发明其它基因分型寡核苷酸与位于这里所述的多态性位点之一下游一个至几个核苷酸处的靶区域杂交。这种寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法中以检测这里所描述的多态性之一，因此这种基因分型寡核苷酸这里称作“引物延伸寡核苷酸”。在优选实施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是与多态性位点紧临的核苷酸互补的脱氧核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括包装在分开容器中的至少两个基因分型寡核苷酸的试剂盒。该试剂盒也可以含有包装在分开容器中的其它成分如杂交缓冲液(此时寡核苷酸待用作探针)。可供选择地，当寡核苷酸待用于扩增靶区域时，该试剂盒可以含有包装在分开容器中的聚合酶和用于聚合酶介导的引物延伸如PCR的经优化反应缓冲液。
上述寡核苷酸组合物和试剂盒在个体VEGFR-2基因的基因分型和/或单元型分型方法中有用。
本发明还涉及诊断患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在。
本发明还涉及确定患者对脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性的体外方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在。
本发明还涉及分析从患者分离的离体生物样品的体外方法，包括确定所述样品中VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的核苷酸。优选地，该方法还包括所述分析结果确定所述患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性或者诊断患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)。
在以上方法中，VEGFR-2基因启动子区-604C等位基因的存在与降低的脑血栓形成性卒中患病风险相关，携带+1192T等位基因的个体和携带+1719T等位基因的个体脑出血的患病风险增加，单体型(-604/+1192/+1719)C/C/T对脑血栓形成有保护作用，而单体型(-604/+1192/+1719)T/T/T单体型携带者脑出血的患病风险增加。
在上述方法中，可以使用以下任何的差异核酸分析技术来确定基因多态性用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性。
本发明还涉及检测生物学样品中VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在的物质在制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)或者用于确定患者对脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性。其中所述物质可以选自VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的多态性，或者(2)用于检测VEGFR-2基因中的多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多态性的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸；能够特异识别VEGFR-2中Val297Ile突变和/或Gln472His突变的抗体；和能够特异识别VEGFR-2基因VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的引物或者探针或者限制性内切酶等。
本发明还涉及用于脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的诊断试剂盒，包含任何(一种或者多种)刚刚定义的检测生物学样品中VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在的物质。
如果适用的话，在所有方面，优选的是，所述VEGFR-2基因第-604和/或+1192和/或+1719位的多态性特别是VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T或者其反向互补序列。
以下实施例用于对本发明作进一步举例说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例一、脑卒中患者和对照人群的入选研究项目“高血压易患脑卒中的分子机制”是国家科技部资助的国家重点基础研究项目(973项目，课题号G200056901)，并获得卫生部伦理委员会、各临床中心伦理委员会的同意以及所有参加者的知情同意书。
从2000年11月到2001年11月期间，中国7个临床中心北京、天津、武汉同济、武汉协和、西安、重庆、山东兖州参加了大规模的病例对照研究，入选了2000例脑卒中患者，并相应在同一地区按照性别、年龄匹配的原则入选了2000例对照。病例入选的标准根据疾病国际分类标准第9版(the International Classification of Disease，ninth revision)，收集了三类亚型的脑卒中患者，包括脑血栓形成(cerebral thrombosis)、腔隙性脑梗塞(Lacunar infarction)、脑出血(intracerebral hemorrhage)。短暂性缺血性脑卒中发作、蛛网膜下腔出血、脑栓塞、脑肿瘤和脑血管动静脉畸形等疾病被排除。脑卒中的诊断依据严格的神经学检查、CT，和/或MRI检查。对照人群的脑卒中排除标准与病例入选标准相同，无脑卒中症状或脑卒中病史。进行数据分析时，共有1849名脑卒中患者(平均年龄60.4±9.23岁，男性占63.4％)和1798名对照(平均年龄59.6+8.5岁，男性占59.2％)。其中，脑卒中患者包括812例(43.9％)脑血栓形成，530例患者(28.7％)腔隙性脑梗塞，507例(27.4％)脑出血。
脑卒中患者与对照人群均进行心脑血管病的标准问卷调查，调查内容包括神经疾病史、高血压史、糖尿病史、收缩压、舒张压、身高、体重、吸烟、饮酒等生活习惯。同时抽取外周静脉血，进行各项血生化指标测定，包括血糖、总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、非高密度脂蛋白胆固醇(non-HDL-C)等。高血压的诊断标准为3次血压测量收缩压≥140mmHg，或舒张压≥90mmHg，或者服用降压药者。糖尿病的诊断标准为空腹血糖水平≥7.8mmol/L，或餐后2小时血糖≥11.1mmol/L。
问卷调查、血压、身高、体重测量和抽血由经过培训的专业人员按《心血管病流行病学调查手册》规定方法完成，血生化指标检测全部由中心实验室完成。
二、基因组DNA的提取按照标准的苯酚-氯仿抽提法进行。
三、VEGFR-2基因SNPs的选择VEGFR-2基因位于染色体4q11-q12，cDNA全长约5.8kb，NCBIRefSeq mRNA accession No.为NM_002253，由30个外显子和29个内含子组成。编码的多肽链由1356个氨基酸组成，是酪氨酸激酶受体。VEGFR-2蛋白的结构分为3部分胞外区，包括7个Ig-like结构域；跨膜区；胞内酪氨酸激酶结构域。第1-19个氨基酸编码信号肽，第20-764个氨基酸编码VEGFR-2蛋白的胞外结构域，第765-789个氨基酸编码跨膜部分，第790-1356个氨基酸编码胞浆内结构域。该基因启动子区的特点是没有TATA盒而富集GC，并具有5个Sp1调控元件及其他多个转录因子的结合位点如AP-2、GATA、NF-κB等。
我们首先分别选取24名脑卒中患者和对照作为研究对象，对VEGFR-2基因转录起始位点上游约2.0Kb的核苷酸序列进行测序，以检测中国人群中的单核苷酸多态性位点及其频率(方法一)。我们在VEGFR-2基因5’-调控区发现3个单核苷酸多态性位点，-604 T→C和-65T→C位于转录起始位点上游，+32 A→G位于5’-UTR，它们在dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)数据库中分别命名为rs2071559，rs9994560和rs7667298(图1-3)。其中rs9994560的稀有等位基因C的频率为0.04，rs7667298的稀有等位基因G的频率为0.02，rs2071559的的稀有等位基因C的频率为0.28。对rs2071559位点进行生物信息学分析，利用ClustalW软件比对人和小鼠包括rs2071559的核苷酸序列，发现该区域高度保守；用TranscriptionElement Search System(TESS)分析发现rs2071559多态性-604 T→C的改变导致转录因子CP-2的结合位点(gTtgg)缺失。因此在进一步的大规模病例对照研究中，我们对rs2071559进行了基因分型。
我们根据dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)对VEGFR-2基因所有30个外显子中的单核苷酸多态性位点进行了测序和筛选(方法二)。此外，Walter在15例青少年血管瘤患者中研究VEGFR-2基因的突变，发现1例患者的血管瘤组织中存在VEGFR-2基因的一个错义突变P1147S，该突变位于VEGFR-2基因的激酶结构域，导致脯氨酸转变为丝氨酸，而在血管瘤周围的正常组织中没有检测到该突变(Genes Chromosomes Cancer 33295-303，2002)。我们对该突变也进行了筛查。我们在对12个SNPs通过直接测序进行筛查之后，发现仅存在2个多态性位点，分别是处于Exon 7中的rs2305948，在VEGFR-2基因转录起始位点下游+1192 C/T，导致非同义突变Val297Ile(图4)；Exon 11中的rs1870377，在转录起始位点下游+1719 A/T，导致非同义突变Gln472His(图5)。因此，我们选取rs2305948和rs1870377进行下一步病例对照的关联研究。
方法一1.以下列引物对VEGFR-2基因5’-调控区进行测序
2.PCR(聚合酶链式扩增反应)体系，见下表
PCR参数
3.PCR产物纯化(1)将25μl PCR反应产物同其6倍体积的无水乙醇与5M醋酸胺(5∶1)混合溶液混合，置于-80℃ 30分钟以上；(2)14,000rpm，4℃离心15分钟，弃去上清；(3)加入200μl的75％酒精，14,000rpm，4℃离心5分钟，吸上清弃去；(4)室温或冷冻干燥后，加入20μl TE溶解；
(5)吸2μl点样，2％琼脂糖凝胶(0.5×TBE缓冲液配制)电泳定量。
4.末端双脱氧法测序仪器ABI PRISM 377测序仪(美国Perkin Elmer公司)方法二VEGFR-2基因编码区的单核苷酸多态性位点(根据dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)
PCR扩增体系，反应参数，PCR产物的纯化以及测序等均同方法一。
四、VEGFR-2基因中3个单核苷酸多态性位点rs2071559，rs2305948和rs1870377基因型的确定1.PCR扩增所用的引物
2.PCR(聚合酶链式扩增反应)体系，见下表
PCR参数 3.rs2071559(-604T/C)多态的检测(图6) 注括号内是内切酶的识别序列，箭头和黑体字是SNP的等位基因。T/T基因型的扩增片段不存在Bsm I酶切位点，将出现一个290bp片段；C/C基因型存在Bsm I酶切位点，将出现232bp和30bp两个片段；T/C基因型则产生290bp、232bp和30bp三个片段。
(2)PCR产物酶切体系如下(20μl)PCR产物 8.0μl10×NEBuffer 22.0μlBsm I(10U/μl)0.3μlddH2O 9.7μl(3)65℃温育3h后，加入10×上样缓冲液1μl终止反应；(4)取8μl上述产物，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
4.rs2305948(+1192C/T)多态的检测(图7)
注括号内是内切酶的识别序列，箭头和黑体字是SNP的等位基因。C/C基因型的扩增片段不存在BstZ17 I酶切位点，将出现一个262bp片段；T/T基因型存在BstZ17 I酶切位点，将出现232bp和30bp两个片段；C/T基因型则产生262bp、232bp和30bp三个片段。
(2)PCR产物酶切体系如下(20μl)PCR产物 8.0μl10×NEBuffer 3 2.0μlBstZ171(5U/μl) 0.5μlddH2O9.5μl(3)37℃温育3h后，加入10×上样缓冲液1μl终止反应；(4)取8μl上述产物，4％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
5.rs1870377(+1719A/T)多态的检测(图8) 注括号内是内切酶的识别序列，箭头和黑体字是SNP的等位基因。A/A基因型的扩增片段不存在Alu I酶切位点，将出现一个404bp片段；T/T基因型存在Alu I酶切位点，将出现191bp和213bp两个片段；T/A基因型则产生404bp、191bp和213bp三个片段。
(2)PCR产物酶切体系如下(20μl)PCR产物 8.0μl10×NEBuffer 2 2.0μlAlu I(10U/μl) 0.3μlddH2O9.7μl(3)37℃温育3h后，加入10×上样缓冲液1μl终止反应；(4)取8μl上述产物，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
五、统计学分析采用SSPS 10.0统计软件包，所有的统计的显著性水平P值定为0.05(双侧)。
1.脑卒中病例组和对照组的临床特征比较(1)Mann-Whitney法血清总甘油三酯(TG)为偏态分布，分析前进行自然对数转换，比较各组间差异。
(2)非配对student’s t检验年龄、血浆HDL-C、血浆non-HDL-C、血浆总胆固醇、血压、体重指数、血糖等血生化指标的组间均数比较(平均值±标准差)。
(3)Chi square检验性别、吸烟、高血压史和糖尿病史等分类资料的组间比较。
2.频数统计单核苷酸多态位点SNPs的等位基因频率和基因型频率在病例和对照组的分布3.Chi square检验(1)判断每个多态位点等位基因频率和基因型频率的分布有无地区、性别差异。
(2)判断每个多态位点是否符合哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)，P＞0.05认为样品符合HWE。
(3)每个位点的单位点关联分析。
4.多元Logistic回归(1)评价传统的心脑血管病危险因素年龄、性别、吸烟、饮酒、血浆HDL、血浆总胆固醇、血压、体重指数、血糖等与脑卒中的关系，(2)校正上述危险因素后，检测VEGFR-2基因的SNPs与脑卒中的相关性。
(3)用比值比(odds ratio，OR)和95％可信区间(confidenceinterval，CI)来表示相关性。
5.遗传标记间的连锁不平衡分析和单体型的关联分析遗传标记之间的连锁不平衡程度的衡量值D、D′、γ2值，通过2LD(http://www.iop.kcl.ac.uk/iop/departments/psychmed/gepibst/software/21d.stm)和EMLD(http://request.mdacc.tmc.edu/～qhuang/Software/pub.htm)软件来计算。采用PHASE 2.0软件[48]估计每种单体型的频率(http://www.stat.washington.edu/stephens/phase.html)，并计算出病例组和对照组中单体型频率的整体差异，P＜0.05作为统计学的显著性差异。然后采用卡方检验比较每个单体型频率在病例组和对照组的分布是否有显著性差异。
六、VEGFR-2基因启动子区SNP-604T/C对启动子活性的影响启动子区的遗传变异可影响基因的转录活性。-604T/C位于VEGFR-2基因转录起始位点上游的启动子区，我们用Clustal W软件比对人和小鼠的启动子区序列，发现该位点所在区域高度保守。利用TranscriptionElement Search System(TESS)软件包分析该多态位点所在序列可能结合的转录因子，发现该段序列可能与转录因子CP2、NF-1(nuclearfactor-1)和YY-1(Yin and Yang 1)结合。VEGFR-2基因-604碱基T→C的改变，可能影响转录因子CP-2、NF-1或YY-1与该段序列的结合能力，或者通过转录因子间的相互作用，改变基因的启动子活性和表达水平，从而影响VEGF的血管生物学效应。因此我们构建VEGFR-2基因启动子/荧光素酶报告载体研究SNP-604T/C对基因转录活性的影响(见方法三)。
方法三、1.构建荧光素酶报告基因质粒pGL3/-604TT1.1 PCR法扩增VEGFR-2基因启动子区序列选择基因型为-604TT的个体DNA，用PCR法和Pyrobest Taq聚合酶扩增含有VEGFR-2基因全部启动子区的DNA片段，包括转录起始位点和外显子1(Genbank accession no.AC021220.7)。引物序列为上游引物5’-tag cga gct ctg cca caa gaa gtc cac aca-3’(含有限制酶SacI识别序列GAGCTC)；下游引物5’-cac ccg acc tgt ctg cct tcc-3’。扩增条件95℃变性10分钟；随后进行30个循环，每一循环包括94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸90秒；最后，72℃延伸10分钟。扩增片段长度1.3Kb，具有SacI/XhoI双酶切位点。
1.2 PCR产物纯化(1)加入6倍体积的醋酸氨/乙醇(1∶5)，-70℃ 30分钟。
(2)4,000rpm(转/分)×10分钟，12,000rpm×10分钟。
(3)75％乙醇洗涤。
(4)待乙醇挥发完，加50μl灭菌水溶解。
1.3 PCR纯化产物测序验证含有野生基因型-604TT1.4构建荧光素酶报告基因质粒pGL3/-604T将上述测序验证后的VEGFR-2基因启动子区的PCR产物用1％的琼脂糖切胶回收，经限制酶Sac I和Xho I双酶切4小时(37℃)后，回收/纯化目的片段(1182bp，-887～+295)，同时将pGL3-Basic荧光素酶报告载体进行Sac I和Xho I双酶切并回收/纯化大片段，最后将上述消化回收的片段在16℃水浴中用T4 DNA连接酶连接，转化，挑取克隆，提取质粒。酶切再鉴定，阳性克隆测序确定插入目的片段的正确性。测序通用引物为T7引物5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’；SP6引物5’ATT TAGGTG ACA CTA TAG AA 3’。
2.突变法制备荧光素酶报告基因质粒pGL3/-604CC2.1构建pGEM-T Easy/-604TT质粒将测序验证后的VEGFR-2基因启动子区的PCR扩增片段(含-604TT)用Takara Taq酶在3’加A尾，并连接入pGEM-T Easy载体，转化，挑取克隆，提取质粒、酶切再鉴定。阳性克隆测序确定目的片段的插入方向。
3’加A尾反应70℃ 30分钟10×Taq polymerase buffers1.0μldATP(2mM) 1.0μlTakara Taq(5U/μl)1.0μl纯化后PCR产物 7.0μl连接反应4℃ 14-16小时
2×Rapid ligation buffer 5.0μlpGEM-T Easy Vector1.0μlT4 DNA连接酶 1.0μl加A尾的PCR产物3.0μl2.2突变法制备pGEM-T Easy/-604C亚克隆质粒(GeneEditor-in vitroSite-Directed Mutagenesis System，Promega)2.2.1突变引物的5’端磷酸化突变引物序列5’-cgg gaa tgC tgg cga ac-3’，其中C为-604突变位点。
磷酸化反应突变引物(200pmol)2.5μlT4 kinase 10×buffer 0.5μlT4 kinase(5U/μl)1.0μlATP(10mM)2.5μl灭菌蒸馏水 18.5μl上述反应体系37℃孵育30分钟，70℃ 10分钟灭活T4 kinase，-20℃保存。
2.2.2质粒pGEM-T Easy/-604T的碱变性质粒DNA(2ng) 12.0μl2M NaOH，2mM EDTA 2.0μl灭菌蒸馏水 6.0μl上述反应体系室温放置5分钟，加入2M醋酸氨2μl和无水乙醇(4℃)75μl沉淀DNA，-70℃ 30分钟，4℃离心13,000rpm×15分钟，小心去除上清。然后用70％乙醇(4℃)洗涤，离心13,000rpm×15分钟，去除上清，晾干，加入50μl灭菌蒸馏水溶解。0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.2.3突变引物与质粒DNA的杂交变性的质粒DNA10.0μl5’磷酸化的突变引物 3.0μl5’磷酸化的Selection引物 1.0μlAnnealing 10×buffer 2.0μl灭菌蒸馏水 4.0μl用PCR扩增仪控制杂交温度的逐渐降低75℃变性5分钟后，使温度缓慢下降至37℃，平均每分钟下降1.0℃，整个过程约40分钟。
2.2.4突变链的合成与连接杂杂交反应液 20.0μlSynthesis 10×buffer 3.0μlT4 DNA Polymerase1.0μlT4 DNA Ligase1.0μl灭菌蒸馏水 5.0μl于37℃水浴90分钟。
2.2.5转化BMH 71-18 mutS感受态细胞BMH 71-18 mutS是错配修复功能缺陷的大肠杆菌E.Coli菌株，可防止新合成的非甲基化DNA链的修复，从而提高突变产生的效率。将突变液转化的BMH 71-18 mutS感受态细胞在含有GeneEditorAntibiotic Selection Mix的LB培养基中于37℃摇菌、培养16-18小时。
2.2.6转化JM109感受态细胞和突变子的筛选碱裂解法提取质粒，转化JM109感受态细胞，在含有Amp抗性和Antibiotic Selection Mix的LB平板上筛选突变子。在37℃孵育14-16小时，挑取单克隆菌在含Amp抗性的LB培养液中培养12-14小时，收获大肠杆菌，用碱裂解法小量提取质粒，测序确定突变位点-604C的存在，以及插入目的片段的其他序列与野生型质粒pGL3/-604T的插入片段完全一致。
2.3构建荧光素酶报告基因质粒pGL3/-604CC将上述测序验证后的pGEM-T Easy/-604C亚克隆质粒和pGL3-Basic荧光素酶报告载体分别用限制酶Sac I和Xho I双酶切4小时(37℃)后，0.8％的琼脂糖凝胶电泳并回收目的片段，在16℃水浴中用T4 DNA连接酶连接上述消化回收的目的片段，转化，碱裂解法小量提取质粒DNA。测序确定插入目的片段的正确性，得到突变基因型的荧光素酶报告基因质粒pGL3/-604C。
3.细胞培养3.1人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的原代培养。
3.1.1实验步骤(1)打开无菌托盘，倒入无菌生理盐水。将24小时内新生儿脐带放入托盘漂洗数遍，冲净血管中残存血块。
(2)剪掉脐带两端，一端接入三通注射器直口，另一端接入吸管-胶管-针头三联体，不断抽动活塞，检查是否漏气，并将脐带内残存血赶出。
(3)将胶管-针头二联体连接入三通注射器侧口，然后将针头插入预热的无菌PBS瓶中，虹吸入1×PBS，冲洗脐带3～5次。
(4)将针头拔出，插入室温预热的0.25％胰蛋白酶瓶中，脐带另一端用血管钳加紧，不断抽动活塞，直至脐静脉内完全充满胰蛋白酶而无残存空气。夹紧侧口胶管。将脐带整体移入含37℃ 1×PBS的瓷缸内，水浴消化15分钟。
(5)取出脐带，将脐静脉中的消化液收集于50ml离心管中，滴入数滴灭活血清，将消化液离心(＜1000rpm，5～10分钟，室温)。
(6)吸取细胞团沉淀至25cm2培养瓶中，加入适量的M199培养液(20cm脐带细胞加3ml～5ml培养液，含15％FBS、150μg/ml ECGS、75μg/ml肝素钠)，小心吹散，于37℃、95％O2、5％CO2培养箱中培养。
(7)细胞密度为70％～90％时传代，加入0.125％胰蛋白酶、0.02％EDTA的细胞消化液，倒置显微镜下观察细胞消化情况，待细胞与细胞分开，胞体变圆变亮，吸去消化液。
(8)加入含10％FBS的M199培养液，小心吹散细胞，接种新的培养瓶。
3.2 293S细胞的培养
3.2.1 293S细胞的复苏(1)将冻存细胞从液氮罐中取出，迅速放入40℃水浴锅中，晃动，使之尽快完全融解(1～1.5分钟)。
(2)离心，取上清；(3)加入5ml新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)，接种至25cm2培养瓶中。
3.2.2 293S细胞的传代培养(1)细胞密度为70％～90％时传代，加入0.125％胰蛋白酶、0.02％EDTA的细胞消化液。
(2)倒置显微镜下观察细胞消化情况(约5分钟)，待细胞与细胞分开，胞体变圆变亮，吸去消化液，去除大部分细胞。
(3)加入5ml含10％FBS的DMEM培养基，于37℃、95％O2、5％CO2培养箱中培养。
4.转染和荧光素酶分析4.1实验分组实验组pGL3/-604T野生型质粒pGL3/-604C突变型质粒空载体组pGL3-Basic荧光素酶报告载体阳性对照组pGL3-Control荧光素酶报告载体。
上述各组同时共转染pRL-CMV报告载体作为内参校正转染效率。
4.2细胞转染和荧光素酶分析(1)用Lipofectamine 2000，分别将20μg pGL3/-604T、pGL3/-604C报告载体或pGL3-Basic空载体、pGL3-Control阳性对照载体，与0.8μg内参pRL-CMV共转染入HUVEC细胞或293S细胞。对于每种报告载体，重复进行三次独立的转染实验。
(2)转染24小时后，弃培养基，用PBS洗一次，去掉PBS。
(3)用双荧光素酶报告分析系统检测荧光素酶活性。加300μl 1×PLB，在摇床上室温孵育15分钟，使细胞完全裂解。
(4)将裂解液移入1.5ml离心管中离心，去掉沉淀。
(5)取100μl LAR II及20μl裂解液移至荧光管中，混匀；测量萤火虫荧光素酶的活性。
(6)再加入100μl stop & Gol Reagent，测量海胆荧光素酶的活性。
5.数据处理进行3次独立的细胞转染和荧光素酶活性分析，启动子活性用相对荧光素酶活性单位(Relative luciferase unit，RLU)表示，即fireflyluciferase和renilla luciferase的比值。RLU用均数±标准差表示，非配对Student’s t检验比较组间的差异，P＜0.05作为显著性水平。
七、结果一)脑卒中病例组和对照组的一般临床资料传统的心脑血管病的危险因素包括糖尿病史、高血压史和吸烟者在病例组更常见。病例组收缩压、舒张压、空腹血糖水平、甘油三酯(TG)均显著高于对照组，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)显著低于对照组(表1)。
二)VEGFR-2基因多态与脑卒中相关VEGFR-2基因多态位点-604T/C、+1192C/T和+1719A/T在病例组和对照组的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，频数分布无地区、性别的显著性差异。每个多态位点的基因型及等位基因在病例组和对照组频率分布如表2所示。
在脑血栓病例组中，多态位点-604等位基因C的频率为0.27，显著低于对照组(频率为0.30，P＝0.001)，基因型TC/CC携带者的频率也显著低于对照组(分别是45.1％和52.1％，P＝0.004)。在脑出血病例组中，多态位点+1192等位基因T的频率为0.18，显著高于对照组(频率为0.11，P＜0.0001)，基因型CT/TT携带者的频率显著高于对照组(分别是33.8％和20.5％，P＜0.0001)。在脑出血组，多态位点+1719等位基因T的频率为0.43，显著高于对照组(频率为0.38，P＝0.004)；AA、AT、TT基因型频率在脑出血组中分别为38.9％、45.4％、15.7％，在对照组中分别为31.8％、49.7％、18.5％，组间分布有显著统计学差异(P＝0.01)。
为调整脑卒中环境因素和其他传统血管危险因素的影响，以是否脑卒中为因变量，以VEGFR-2基因多态和传统危险因素为自变量，进行多元非条件Logistic回归分析。校正了年龄、性别、吸烟、血浆HDL、血浆总胆固醇、血压、体重指数、血糖等传统危险因素后，VEGFR-2基因启动子区-604C等位基因与降低的脑血栓形成性卒中患病风险相关(OR＝0.78，95％ CI0.65-0.95；P＝0.025.)。携带+1192T和+1719T等位基因的个体脑出血的患病风险增加(OR＝2.25，95％ CI1.70-2.96，P＝0.0001；OR＝1.33，95％ CI1.03-1.73，P＝0.01)。
三)VEGFR-2基因单体型与脑卒中相关我们计算了VEGFR-2基因3个SNP位点之间的连锁不平衡程度(表3)，发现-604T/C和+1192C/T之间，以及+1192C/T和+1719A/T之间存在着微弱的连锁不平衡，它们的D’分别为0.1636和0.2663。利用这3个SNP位点构建单体型，关联分析结果表明在脑梗塞组与对照组之间，以及脑出血组和对照组之间单体型频率的分布都有显著性的整体差异(脑梗塞组P＝0.01；脑出血组P＝0.01；表17)。
以野生单体型TCA(-604/+1192/+1719)作为参照，进一步比较每种单体型在不同组之间的频率的区别(表4a，表4b)。我们发现单体型C-C-T在脑梗塞组的频率(7.6％)显著低于对照组中的频率(10.8％)(OR0.67；95％ CI0.54～0.84；P＝0.0004)，Bonferroni’s多重检验校正后，仍有显著性差异(P＝0.0021)。在脑出血组，含有+1192T等位基因的单体型T-T-A、T-T-T、C-T-A和C-T-T的频率均显著高于对照组中的频率(P＜0.01)。其中单体型T-T-T在脑出血和对照组的频率分别为4.5％和1.6％，与脑出血的发病风险有强的相关性，OR值为3.43(95％CI2.28～5.14；Bonferroni’s校正P＝2.7×10-9)；而单体型C-T-T与脑出血发病的相对危险度降低至2.30(95％CI1.39～3.79；Bonferroni’s校正P＝0.007)，在脑出血和对照组中的频率分别是2.5％和1.3％。
四)-604T/C降低VEGFR-2基因启动子区的转录活性由于VEGFR-2主要在血管内皮细胞表达，我们将构建的野生型和突变型报告基因质粒分别瞬时转染入人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，在无血清培养基中培养24小时后，通过测定荧光素酶的活性，检测了单核苷酸多态-604T/C是否影响VEGFR-2基因启动子区的转录。同时，以293-S细胞作为对照，观察VEGFR-2基因的该段启动子序列在非内皮细胞中的启动活性。结果如图9所示，VEGFR-2基因启动子序列(-887～+296)在293-S细胞中几乎没有启动荧光素酶的表达活性；在HUVEC细胞中，与野生型-604T比较，-604C多态使荧光素酶的表达活性降低2.93倍(pGL3/-604C5.81±2.42；pGL3/-604T17.03±4.89；P＜0.001)。
八、结论VEGFR-2是VEGF的高亲和力受体，是一种酪氨酸激酶受体。VEGF的多种生理、病理学作用包括促进血管内皮细胞分裂、增生、迁移以及增加血管通透性等主要是通过VEGFR-2的信号传导通路来完成的。
VEGFR-2基因启动子区的多态-604C等位基因与降低的脑血栓形成性卒中患病风险相关(OR＝0.78，95％ CI0.65-0.95)。细胞学实验结果表明，突变型等位基因-604C的启动子活性显著低于野生型-604T等位基因，因此，VEGFR-2基因-604C等位基因可能通过减弱启动子转录活性，降低VEGF的表达水平，减弱其在动脉粥样硬化斑块区域促进微血管形成的作用，从而影响到斑块损伤的进展和稳定性。
关联分析结果表明，携带+1192T和+1719T等位基因的个体脑出血的患病风险增加(OR＝2.25，95％ CI1.70-2.96；OR＝1.33，95％CI1.03-1.73)。我们对这两个位点进行了生物信息学分析。多态+1192C/T位于VEGFR-2基因外显子7，导致VEGFR-2 mRNA第297位的氨基酸残基由缬氨酸(valine)变为异亮氨酸(isoleucine)。该氨基酸残基的疏水性虽未发生改变，但由于它位于VEGFR-2基因胞外区的第2个Ig-like结构域内，而该结构域对VEGFR-2与其配体VEGF的结合至关重要(J BiolChem.1998；27311197-11204)。采用ExPASy蛋白分析系统的PROSITE数据库分析，表明该位点处于蛋白质的骨架成分内，埋藏在蛋白质空间构象内部，是N-肉豆蔻酰化位点，突变后该位点仍存在。多态+1719A/T位于VEGFR-2基因外显子11，导致VEGFR-2 mRNA第472位的氨基酸残基由谷胺酰氨(glutamine)变为组氨酸(histidine)，氨基酸的性质由中性改变为碱性。该位点在VEGFR-2基因胞外区的第5个Ig-like结构域内。采用ExPASy蛋白分析系统的PROSITE数据库分析，表明该位点在蛋白质空间结构的表面，glutamine突变为histidine后，电荷的改变可能引起氨基酸之间静电作用的改变，从而影响受体与配体的结合特性。因此，我们有理由推测VEGFR-2基因编码区的氨基酸改变可能影响VEGFR-2的空间构象，从而改变配体与受体的结合特性，继而影响下游信号通路，最终改变VEGF促进血管增生、迁移和增加血管通透性等生理病理学效应。
单个遗传标记进行遗传分析的效力较小，由几个连锁位点组成的单倍型则能提供更多更可靠的信息，而且用单倍型来检测连锁不平衡常常比单位点更可靠。单体型的关联分析进一步支持了上述单位点关联分析的结论，即单体型C/C/T(-604/+1192/+1719)为low-riskhaplotype，对脑血栓形成有保护作用(OR＝0.59，95％CI0.43-0.82)，而T/T/T单体型携带者脑出血的患病风险增加(OR＝3.18，95％CI1.79-5.67)。
表1脑卒中病例组和对照组的一般临床资料
*P＜0.05，P＜0.01 versus control.
表2VEGFR-2基因多态位点的基因型和等位基因在病例组和对照组的频率分布
*P andP病例组和对照组间的卡方检验*多元Logistic回归校正年龄、性别、吸烟、饮酒、血浆HDL、血浆总胆固醇、血压、体重指数、血糖后，检测VEGFR-2基因与脑卒中的相关性与脑卒中的相关性。
表3 VEGFR-2基因多态位点的连锁不平衡
注D、D’和r2为衡量连锁不平衡程度的指标；P值是根据D值计算而得。
表4a VEGFR-2基因各单体型(-604/+1192/+1719)在脑梗塞和脑出血组的分布
表4b VEGFR-2基因各单体型(-604/+1192/+1719)在脑出血组的分布
*Global P由PHASE 2.0软件估计单体型频率，并比较病例组和对照组中单体型频率分布的整体差异*OR(95％CI)和P卡方检验比较每个特定的单体型在病例组和对照组间的分布(以野生单体型TCA为参照)；PcorrBonferroni’s多重检验校正后
权利要求
1.用于确定VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的遗传多态性型式的工具。
2.权利要求1的工具，它是VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的多态性，或者(2)用于检测VEGFR-2基因中的多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多态性的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。
3.根据权利要求2的工具，其是限制性内切酶。
4.诊断试剂盒，包含权利要求1-3任一项的工具。
5.诊断患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在，其中，VEGFR-2基因启动子区-604C等位基因与降低的脑血栓形成性卒中患病风险相关，携带+1192T等位基因的个体和携带+1719T等位基因的个体脑出血的患病风险增加，单体型(-604/+1192/+1719)C/C/T对脑血栓形成有保护作用，而单体型(-604/+1192/+1719)T/T/T单体型携带者脑出血的患病风险增加。
6.确定患者对脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在，其中，VEGFR-2基因启动子区-604C等位基因与降低的脑血栓形成性卒中患病风险相关，携带+1192T等位基因的个体和携带+1719T等位基因的个体脑出血的患病风险增加，单体型(-604/+1192/+1719)C/C/T对脑血栓形成有保护作用，而单体型(-604/+1192/+1719)T/T/T单体型携带者脑出血的患病风险增加。
7.分析从患者分离的离体生物样品的方法，包括确定所述样品中VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的核苷酸。
8.权利要求7的方法，还包括确定所述患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性或者诊断患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)，其中，VEGFR-2基因启动子区-604C等位基因与降低的脑血栓形成性卒中患病风险相关，携带+1192T等位基因的个体和携带+1719T等位基因的个体脑出血的患病风险增加，单体型(-604/+1192/+1719)C/C/T对脑血栓形成有保护作用，而单体型(-604/+1192/+1719)T/T/T单体型携带者脑出血的患病风险增加。
9.权利要求5至8任一项的方法，其中使用包括选自以下的差异核酸分析技术的试验用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性。
10.一种微阵列，其中包含权利要求2中所定义的VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多态性分型寡核苷酸。
11.权利要求10的微阵列，它是DNA芯片的形式。
12.检测生物学样品中VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在的物质用于制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)或者用于确定患者对脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性。
13.权利要求12的用途，其中所述物质选自权利要求1-4的工具；能够特异识别VEGFR-2中Val297Ile突变和/或Gln472His突变的抗体；和能够特异识别VEGFR-2基因VEGFR-2基因多态位点-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的引物或者探针或者限制性内切酶。
全文摘要
本发明涉及确定患者对脑血管疾病(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞、脑出血在内的脑卒中)的遗传易感性的方法。具体地，本发明方法包括确定VEGFR－2基因多态位点－604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的遗传多态性型式。本发明还涉及用于该方法的物质、组合物、试剂盒及其用途。
文档编号C12Q1/68GK1940086SQ20051010582
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月29日 优先权日2005年9月29日
发明者惠汝太, 张伟丽, 孙凯, 石毅, 汪一波, 杨晓敏 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院